طريقة تصوير قائمة على الهاتف الذكي لمقايسة تجنب العشب C. elegans
Summary
توضح هذه المقالة طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتسجيل سلوك تجنب العشب ل Caenorhabditis elegans ، باستخدام العناصر المتاحة بسهولة مثل الهاتف الذكي وصندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED). نوفر أيضا برنامج نصي Python لمعالجة ملف الفيديو بتنسيق أكثر قابلية للعد.
Abstract
عند التعرض للبكتيريا السامة أو المسببة للأمراض ، تظهر الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans سلوكا مكتسبا لتجنب العشب ، حيث تترك الديدان تدريجيا مصدر غذائها وتفضل البقاء خارج العشب البكتيري. الفحص هو طريقة سهلة لاختبار قدرة الديدان على استشعار الإشارات الخارجية أو الداخلية للاستجابة بشكل صحيح للظروف الضارة. على الرغم من كونه مقايسة بسيطة ، إلا أن العد يستغرق وقتا طويلا ، لا سيما مع عينات متعددة ، وفترات الفحص التي تمتد بين عشية وضحاها غير مريحة للباحثين. يعد نظام التصوير الذي يمكنه تصوير العديد من اللوحات على مدى فترة طويلة مفيدا ولكنه مكلف. هنا ، نصف طريقة تصوير قائمة على الهاتف الذكي لتسجيل تجنب العشب في C. elegans. تتطلب الطريقة فقط هاتفا ذكيا وصندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، ليكون بمثابة مصدر ضوء مرسل. باستخدام تطبيقات الكاميرا ذات الفاصل الزمني المجانية ، يمكن لكل هاتف تصوير ما يصل إلى ست لوحات ، مع وضوح وتباين كافيين لحساب الديدان يدويا خارج العشب. تتم معالجة الأفلام الناتجة في ملفات تداخل الصوت والفيديو (AVI) لمدة 10 ثوان لكل نقطة زمنية كل ساعة ، ثم يتم اقتصاصها لإظهار كل لوحة واحدة لجعلها أكثر قابلية للعد. هذه الطريقة هي طريقة فعالة من حيث التكلفة لأولئك الذين يتطلعون إلى فحص عيوب التجنب ويمكن أن تمتد إلى فحوصات C. elegans الأخرى.
Introduction
من بين المزايا العديدة لدراسة C. elegans ، يوفر نظامها العصبي البسيط الفرصة لدراسة كيفية تأثير التغييرات على المستوى الجيني والخلوي على وظيفة الشبكة والإنتاج السلوكي. على الرغم من وجود عدد محدود من الخلايا العصبية ، فإن C. elegans تعرض مجموعة واسعة من السلوكيات المعقدة. أحد هذه العوامل هو تجنب العشب ، حيث تستجيب الديدان الخيطية البكتيرية لمصدر غذائي ضار عن طريق ترك العشب البكتيري. تتجنب C. elegans مروج البكتيريا المسببة للأمراض 1،2،3 ، ومروج البكتيريا التي تنتج السموم أو ترتفع بالسموم1,4 ، وحتى البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي التي تضر ضربة قاضية للجين المستهدف بصحة الديدان 4,5. أظهرت الدراسات أن الديدان تستجيب للإشارات الخارجية مثل المستقلبات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض 1,6 ، أو الإشارات الداخلية التي تشير إلى أن الطعام يجعلها مريضة 4,7. تتم معالجة هذه الإشارات من خلال مسارات الإشارات المحفوظة ، مثل مسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) ومسار عامل النمو المحول بيتا (TGFβ) ، وتتطلب التواصل بين الأمعاء والجهاز العصبي4،6،7،8.
على الرغم من أن الفحص بسيط ، إلا أن السلوك المكتسب يتطور على مدار ساعات عديدة ، غالبا بين عشية وضحاها. في حين أن هناك طفرات غير قادرة على المغادرة ، وفي هذه الحالة يكون تجنب التسجيل في نقطة زمنية واحدة فقط كافيا لإثبات العيب ، فإن العديد من المسوخ يغادرون في النهاية ولكنهم أبطأ في الخروج. بالنسبة لهذه ، يجب تتبع حركة الديدان كل بضع ساعات ، وهو ما قد يكون من الصعب القيام به بين عشية وضحاها. يستغرق العد نفسه أيضا وقتا ، مما يخلق وقتا متأخرا بين اللوحات ، وبالتالي يحد من عدد اللوحات التي يمكن اختبارها في نفس الوقت. سيكون استخدام إعداد التصوير لتسجيل العديد من اللوحات في وقت واحد طوال مدة الفحص مفيدا للغاية ، ولكن تكلفة الإعداد يمكن أن تكون باهظة ، اعتمادا على حالة تمويل مختبر الأبحاث.
لمعالجة هذا الأمر ، ابتكرنا طريقة بسيطة للغاية تستخدم الهواتف الذكية لتسجيل مقايسات التجنب. يمكن لكل هاتف تسجيل مقاطع فيديو بفاصل زمني تصل إلى ست لوحات فحص. لتوفير الضوء المرسل ، نستخدم صندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) الذي يمكن شراؤه بسهولة عبر الإنترنت. يتم وضع لوحات الفحص على منصة مرتفعة ، مدعومة بأنفاق مستطيلة مجوفة ، تركز الضوء الوارد ، مما يخلق تباينا. نوفر أيضا برنامج نصي Python يحول مقاطع الفيديو إلى ملفات تداخل الصوت والفيديو (AVI) تعرض مقاطع 10 s لكل نقطة زمنية كل ساعة. ثم يتم اقتصاص مقاطع الفيديو إلى لوحات فردية وحفظها في ملفات منفصلة لاستخدامها في العد اليدوي.
توفر هذه الطريقة إجراء منخفض التكلفة سهل الاستخدام للغاية ، باستخدام عناصر متاحة بسهولة لمعظم الناس. هنا ، نصف الطريقة التي تستخدم مقايسة تجنب العشب الراسخة ضد الممرض البشري Pseudomonas aeruginosa (PA14) ، الذي تم وصف بروتوكوله سابقا 2,9. أخيرا ، نراجع أيضا اعتبارات وقيود طريقة التصوير لأولئك الذين يرغبون في تطبيقها على تجارب سلوك C. elegans الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن تصوير سلوك الحيوان ، بدلا من الاعتماد على الملاحظة المباشرة ، ليس مريحا فحسب ، بل يتمتع أيضا بميزة ترك الوثائق المرئية. يسمح هذا بالتحليل الأعمى من قبل شخص ثالث موضوعي ، أو حتى يمكن استخدامه للتحليل الآلي باستخدام تقنيات التعرف على الصور. على الرغم من المزايا ، فإن المعدات القياسية المق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Deok Joong Lee على القراءة النقدية للمخطوطة واختبار كود Python. تم رعاية هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) و 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
