Une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour le test d’évitement de pelouse de C. elegans
Summary
Cet article décrit une méthode simple et peu coûteuse d’enregistrement du comportement d’évitement de pelouse de Caenorhabditis elegans, en utilisant des éléments facilement disponibles tels qu’un smartphone et un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED). Nous fournissons également un script Python pour traiter le fichier vidéo dans un format plus propice au comptage.
Abstract
Lorsqu’il est exposé à des bactéries toxiques ou pathogènes, le nématode Caenorhabditis elegans affiche un comportement appris d’évitement de la pelouse, dans lequel les vers quittent progressivement leur source de nourriture et préfèrent rester à l’extérieur de la pelouse bactérienne. Le test est un moyen facile de tester la capacité des vers à détecter les signaux externes ou internes pour répondre correctement aux conditions nocives. Bien qu’il s’agisse d’un test simple, le comptage prend beaucoup de temps, en particulier avec plusieurs échantillons, et les durées de test qui s’étendent sur la nuit sont gênantes pour les chercheurs. Un système d’imagerie capable d’imager de nombreuses plaques sur une longue période est utile mais coûteux. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour enregistrer l’évitement de pelouse chez C. elegans. La méthode ne nécessite qu’un smartphone et un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED) pour servir de source de lumière transmise. En utilisant des applications gratuites de caméra time-lapse, chaque téléphone peut imager jusqu’à six plaques, avec une netteté et un contraste suffisants pour compter manuellement les vers à l’extérieur de la pelouse. Les films résultants sont transformés en fichiers d’entrelacement audio-vidéo (AVI) de 10 s pour chaque point horaire horaire, puis recadrés pour montrer chaque plaque afin de les rendre plus faciles à compter. Cette méthode est un moyen rentable pour ceux qui cherchent à examiner les défauts d’évitement et peut potentiellement être étendue à d’autres tests de C. elegans.
Introduction
Parmi les nombreux avantages de l’étude de C. elegans, son système nerveux simple offre la possibilité d’étudier comment les changements au niveau génétique et cellulaire affectent la fonction du réseau et le rendement comportemental. Malgré un nombre limité de neurones, C. elegans présente un large éventail de comportements complexes. L’un d’eux est l’évitement de la pelouse, dans lequel le nématode bactériivore réagit à une source de nourriture nocive en quittant la pelouse bactérienne. C. elegans évite les pelouses de bactéries pathogènes 1,2,3, les pelouses de bactéries qui produisent des toxines ou sont enrichies de toxines1,4, et même les bactéries exprimant l’ARNi dont l’élimination du gène cible est préjudiciable à la santé des vers 4,5. Des études ont montré que les vers répondent à des signaux externes tels que les métabolites produits par les bactéries pathogènes 1,6, ou les signaux internes qui indiquent que la nourriture les rend malades 4,7. Ces signaux sont traités par des voies de signalisation conservées, telles que la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) et la voie du facteur de croissance bêta transformant (TGFβ), et nécessitent une communication entre l’intestin et le système nerveux 4,6,7,8.
Bien que le test soit simple, le comportement appris se développe sur de nombreuses heures, souvent du jour au lendemain. Bien qu’il y ait des mutants qui sont incapables de partir, auquel cas marquer l’évitement à un seul moment est suffisant pour démontrer le défaut, de nombreux mutants finissent par partir mais sont plus lents à sortir. Pour ceux-ci, le mouvement des vers doit être suivi toutes les quelques heures, ce qui peut être difficile à faire du jour au lendemain. Le comptage lui-même prend également du temps, créant un décalage entre les plaques, et limitant ainsi le nombre de plaques pouvant être testées en même temps. L’utilisation d’une installation d’imagerie pour enregistrer plusieurs plaques simultanément pendant toute la durée du test serait très utile, mais le coût de l’installation peut être prohibitif, selon la situation financière du laboratoire de recherche.
Pour résoudre ce problème, nous avons mis au point une méthode très simple qui utilise des smartphones pour enregistrer les tests d’évitement. Chaque téléphone peut enregistrer des vidéos time-lapse de jusqu’à six plaques de dosage. Pour fournir de la lumière transmise, nous utilisons un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED) qui peut être facilement acheté en ligne. Les plaques d’essai sont placées sur une plate-forme surélevée, soutenue par des tunnels rectangulaires creux, qui concentrent la lumière entrante, créant un contraste. Nous fournissons également un script Python qui convertit les vidéos en fichiers AVI (Audio Video Interleave) montrant des clips de 10 s de chaque point horaire de l’heure. Les vidéos sont ensuite recadrées sur des plaques individuelles et enregistrées dans des fichiers séparés pour être utilisées pour le comptage manuel.
La méthode fournit une procédure peu coûteuse qui est également extrêmement facile à utiliser, en utilisant des articles qui sont facilement disponibles pour la plupart des gens. Ici, nous décrivons la méthode en utilisant le test bien établi d’évitement des pelouses contre l’agent pathogène humain Pseudomonas aeruginosa (PA14), dont le protocole a déjà été décrit 2,9. Enfin, nous examinons également les considérations et les limites de la méthode d’imagerie pour ceux qui veulent l’appliquer à d’autres expériences comportementales de C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie du comportement des animaux, plutôt que de s’appuyer sur l’observation directe, est non seulement pratique, mais présente également l’avantage de laisser une documentation visuelle. Cela permet une analyse aveugle par une tierce personne objective, ou pourrait même être utilisé pour une analyse automatisée à l’aide de techniques de reconnaissance d’images. Malgré les avantages, l’équipement standard généralement offert est élevé en coût, de sorte que l’on s’engage à la configu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Deok Joong Lee pour la lecture critique du manuscrit et le test du code Python. Cette recherche a été parrainée par la Fondation nationale de recherche de Corée 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) et 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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