Un método de imagen basado en teléfonos inteligentes para el ensayo de evitación de césped de C. elegans
Summary
Este artículo describe un método simple y de bajo costo para registrar el comportamiento de evitación del césped de Caenorhabditis elegans, utilizando elementos fácilmente disponibles, como un teléfono inteligente y una caja de luz de diodo emisor de luz (LED). También proporcionamos un script de Python para procesar el archivo de video en un formato más susceptible de contar.
Abstract
Cuando se expone a bacterias tóxicas o patógenas, el nematodo Caenorhabditis elegans muestra un comportamiento aprendido de evitar el césped, en el que los gusanos abandonan gradualmente su fuente de alimento y prefieren permanecer fuera del césped bacteriano. El ensayo es una manera fácil de probar la capacidad de los gusanos para detectar señales externas o internas para responder adecuadamente a condiciones dañinas. Aunque es un ensayo simple, el conteo lleva mucho tiempo, particularmente con múltiples muestras, y las duraciones de los ensayos que se extienden durante la noche son inconvenientes para los investigadores. Un sistema de imágenes que puede obtener imágenes de muchas placas durante un largo período es útil pero costoso. Aquí, describimos un método de imagen basado en teléfonos inteligentes para registrar la evitación del césped en C. elegans. El método requiere solo un teléfono inteligente y una caja de luz de diodo emisor de luz (LED), para servir como fuente de luz transmitida. Usando aplicaciones de cámara de lapso de tiempo gratuitas, cada teléfono puede obtener imágenes de hasta seis placas, con suficiente nitidez y contraste para contar manualmente los gusanos fuera del césped. Las películas resultantes se procesan en archivos de intercalado de audio y video (AVI) de 10 s para cada punto de tiempo por hora, luego se recortan para mostrar cada placa para que sean más susceptibles de contar. Este método es una forma rentable para aquellos que buscan examinar defectos de evitación y potencialmente puede extenderse a otros ensayos de C. elegans.
Introduction
Entre las muchas ventajas de estudiar C. elegans, su sistema nervioso simple ofrece la oportunidad de estudiar cómo los cambios a nivel genético y celular afectan la función de la red y la producción de comportamiento. A pesar de tener un número limitado de neuronas, C. elegans muestra una amplia gama de comportamientos complejos. Uno de ellos es evitar el césped, en el que el nematodo bacterívoro responde a una fuente de alimento dañina abandonando el césped bacteriano. C. elegans evita céspedes de bacterias patógenas 1,2,3, céspedes de bacterias que producen toxinas o están enriquecidas con toxinas1,4, e incluso bacterias que expresan ARNi cuya eliminación del gen objetivo es perjudicial para la salud de los gusanos 4,5. Los estudios han demostrado que los gusanos responden a señales externas como metabolitos producidos por las bacterias patógenas 1,6, o señales internas que indican que el alimento los está enfermando 4,7. Estas señales se procesan a través de vías de señalización conservadas, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la vía del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ), y requieren comunicación entre el intestino y el sistema nervioso 4,6,7,8.
Aunque el ensayo es simple, el comportamiento aprendido se desarrolla durante muchas horas, a menudo durante la noche. Si bien hay mutantes que son incapaces de irse, en cuyo caso la evitación de puntuación en un solo punto de tiempo es suficiente para demostrar el defecto, muchos mutantes se van eventualmente, pero son más lentos para salir. Para estos, el movimiento de los gusanos debe rastrearse cada pocas horas, lo que puede ser difícil de hacer durante la noche. El conteo en sí también lleva tiempo, creando un tiempo de retraso entre las placas y, por lo tanto, limita el número de placas que se pueden probar al mismo tiempo. El uso de una configuración de imágenes para registrar muchas placas simultáneamente durante toda la duración del ensayo sería muy útil, pero el costo de la configuración puede ser prohibitivo, dependiendo de la situación de financiación del laboratorio de investigación.
Para abordar esto, ideamos un método muy simple que utiliza teléfonos inteligentes para registrar los ensayos de evitación. Cada teléfono puede grabar videos de lapso de tiempo de hasta seis placas de ensayo. Para proporcionar luz transmitida, utilizamos una caja de luz de diodo emisor de luz (LED) que se puede comprar fácilmente en línea. Las placas de ensayo se colocan en una plataforma elevada, sostenida por túneles rectangulares huecos, que enfocan la luz entrante, creando contraste. También proporcionamos un script de Python que convierte los videos en archivos de intercalado de audio y video (AVI) que muestran clips de 10 s de cada punto de tiempo por hora. Luego, los videos se recortan en placas individuales y se guardan en archivos separados para usarlos en el conteo manual.
El método proporciona un procedimiento de bajo costo que también es extremadamente fácil de usar, utilizando artículos que están fácilmente disponibles para la mayoría de las personas. Aquí, describimos el método utilizando el ensayo de evitación de césped bien establecido contra el patógeno humano Pseudomonas aeruginosa (PA14), cuyo protocolo ha sido descrito previamente 2,9. Finalmente, también revisamos las consideraciones y limitaciones del método de imagen para aquellos que desean aplicarlo a otros experimentos de comportamiento de C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obtener imágenes del comportamiento animal, en lugar de depender de la observación directa, no solo es conveniente, sino que también tiene la ventaja de dejar documentación visual. Esto permite el análisis ciego por una tercera persona objetiva, o incluso podría usarse para el análisis automatizado utilizando técnicas de reconocimiento de imágenes. A pesar de las ventajas, el equipo estándar que generalmente se ofrece es de alto costo, por lo que uno está comprometido con la configuración una vez comprado.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Deok Joong Lee por la lectura crítica del manuscrito y la prueba del código Python. Esta investigación fue patrocinada por la Fundación Nacional de Investigación de Corea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) y 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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