Een smartphone-gebaseerde beeldvormingsmethode voor C. elegans gazonvermijdingstest
Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudige, goedkope methode voor het registreren van het gazonvermijdingsgedrag van Caenorhabditis elegans, met behulp van direct beschikbare items zoals een smartphone en een lichtbak (light emitting diode). We bieden ook een Python-script om het videobestand te verwerken in een formaat dat meer geschikt is om te tellen.
Abstract
Bij blootstelling aan giftige of pathogene bacteriën vertoont de nematode Caenorhabditis elegans een aangeleerd gazonvermijdingsgedrag, waarbij de wormen geleidelijk hun voedselbron verlaten en liever buiten het bacteriële gazon blijven. De test is een eenvoudige manier om het vermogen van de wormen te testen om externe of interne signalen te detecteren om goed te reageren op schadelijke omstandigheden. Hoewel het een eenvoudige test is, is tellen tijdrovend, vooral met meerdere monsters, en testduur die ‘s nachts duurt, is onhandig voor onderzoekers. Een beeldvormingssysteem dat veel platen over een lange periode in beeld kan brengen, is nuttig maar kostbaar. Hier beschrijven we een op smartphones gebaseerde beeldvormingsmethode om gazonvermijding in C. elegans vast te leggen. De methode vereist alleen een smartphone en een lichtbak (light emitting diode) (LED) om als een doorgelaten lichtbron te dienen. Met behulp van gratis time-lapse cameratoepassingen kan elke telefoon tot zes platen in beeld brengen, met voldoende scherpte en contrast om wormen buiten het gazon handmatig te tellen. De resulterende films worden verwerkt tot 10 s audio video interleave (AVI) -bestanden voor elk tijdspunt per uur en vervolgens bijgesneden om elke afzonderlijke plaat weer te geven om ze meer vatbaar te maken voor tellen. Deze methode is een kosteneffectieve manier voor diegenen die vermijdingsdefecten willen onderzoeken en kan mogelijk worden uitgebreid naar andere C. elegans-assays.
Introduction
Een van de vele voordelen van het bestuderen van C. elegans, het eenvoudige zenuwstelsel biedt de mogelijkheid om te bestuderen hoe veranderingen op genetisch en cellulair niveau de netwerkfunctie en gedragsoutput beïnvloeden. Ondanks het feit dat ze een beperkt aantal neuronen hebben, vertonen C. elegans een breed scala aan complexe gedragingen. Een daarvan is gazonvermijding, waarbij de bacterivore nematode reageert op een schadelijke voedselbron door het bacteriële gazon te verlaten. C. elegans vermijden gazons van pathogene bacteriën 1,2,3, gazons van bacteriën die toxines produceren of zijn geprikt met toxines 1,4, en zelfs RNAi-tot expressie brengende bacteriën waarvan het doelgen knockdown schadelijk is voor de gezondheid van de wormen 4,5. Studies hebben aangetoond dat wormen reageren op externe signalen zoals metabolieten geproduceerd door de pathogene bacteriën 1,6, of interne signalen die aangeven dat het voedsel hen ziek maakt 4,7. Deze signalen worden verwerkt via geconserveerde signaalroutes, zoals de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) route en de transformerende groeifactor beta (TGFβ) route, en vereisen communicatie tussen de darm en het zenuwstelsel 4,6,7,8.
Hoewel de test eenvoudig is, ontwikkelt het aangeleerde gedrag zich gedurende vele uren, vaak ‘s nachts. Hoewel er mutanten zijn die niet in staat zijn om te vertrekken, in welk geval het scoren van vermijding op slechts één tijdstip voldoende is om het defect aan te tonen, vertrekken veel mutanten uiteindelijk wel, maar komen ze langzamer naar buiten. Hiervoor moet de beweging van de wormen om de paar uur worden gevolgd, wat ‘s nachts moeilijk kan zijn. Het tellen zelf kost ook tijd, waardoor er een vertragingstijd tussen de platen ontstaat en dus het aantal platen dat tegelijkertijd kan worden getest, wordt beperkt. Het gebruik van een beeldvormingsopstelling om veel platen tegelijkertijd op te nemen voor de hele duur van de test zou zeer nuttig zijn, maar de kosten van de installatie kunnen onbetaalbaar zijn, afhankelijk van de financieringssituatie van het onderzoekslaboratorium.
Om dit aan te pakken, hebben we een zeer eenvoudige methode bedacht die smartphones gebruikt om vermijdingstests vast te leggen. Elke telefoon kan time-lapse-video’s van maximaal zes testplaten opnemen. Om doorgelaten licht te bieden, gebruiken we een light emitting diode (LED) lichtbak die gemakkelijk online kan worden gekocht. Testplaten worden op een verhoogd platform geplaatst, ondersteund door holle rechthoekige tunnels, die het binnenkomende licht focussen, waardoor contrast ontstaat. We bieden ook een Python-script dat de video’s converteert naar audio-video interleave (AVI) -bestanden met 10 s-clips van elk uurtijdstip. De video’s worden vervolgens bijgesneden tot afzonderlijke platen en opgeslagen in afzonderlijke bestanden om te gebruiken voor handmatig tellen.
De methode biedt een goedkope procedure die ook uiterst eenvoudig te gebruiken is, met behulp van items die voor de meeste mensen direct beschikbaar zijn. Hier beschrijven we de methode met behulp van de gevestigde gazonvermijdingstest tegen de menselijke ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa (PA14), waarvan het protocol eerder is beschreven 2,9. Ten slotte bekijken we ook de overwegingen en beperkingen van de beeldvormingsmethode voor degenen die deze willen toepassen op andere gedragsexperimenten van C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het in beeld brengen van het gedrag van dieren, in plaats van te vertrouwen op directe observatie, is niet alleen handig, maar heeft ook het voordeel dat het visuele documentatie achterlaat. Dit maakt blinde analyse door een objectieve derde persoon mogelijk, of kan zelfs worden gebruikt voor geautomatiseerde analyse met behulp van beeldherkenningstechnieken. Ondanks de voordelen is de standaarduitrusting die meestal wordt aangeboden hoog in kosten, dus men is toegewijd aan de installatie zodra deze is gekocht.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Deok Joong Lee voor het kritisch lezen van het manuscript en het testen van de Python-code. Dit onderzoek werd gesponsord door de National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) en 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
