Um método de imagem baseado em smartphone para C. elegans Lawn Avoidance Assay
Summary
Este artigo descreve um método simples e de baixo custo para registrar o comportamento de evitar gramado de Caenorhabditis elegans, usando itens prontamente disponíveis, como um smartphone e uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED). Também fornecemos um script Python para processar o arquivo de vídeo em um formato mais propício para contagem.
Abstract
Quando exposto a bactérias tóxicas ou patogênicas, o nematódeo Caenorhabditis elegans exibe um comportamento aprendido de evitar o gramado, no qual os vermes gradualmente deixam sua fonte de alimento e preferem permanecer fora do gramado bacteriano. O ensaio é uma maneira fácil de testar a capacidade dos vermes de detectar pistas externas ou internas para responder adequadamente a condições prejudiciais. Embora seja um ensaio simples, a contagem é demorada, particularmente com várias amostras, e durações de ensaio que se estendem durante a noite são inconvenientes para os pesquisadores. Um sistema de imagem que pode obter imagens de muitas placas durante um longo período é útil, mas caro. Aqui, descrevemos um método de imagem baseado em smartphone para registrar a evitação de gramado em C. elegans. O método requer apenas um smartphone e uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED), para servir como fonte de luz transmitida. Usando aplicativos de câmera de lapso de tempo gratuitos, cada telefone pode obter imagens de até seis placas, com nitidez e contraste suficientes para contar manualmente vermes fora do gramado. Os filmes resultantes são processados em arquivos AVI (audio video interleave) de 10 s para cada ponto de tempo de hora em hora, depois cortados para mostrar cada placa única para torná-los mais passíveis de contagem. Este método é uma maneira custo-efetiva para aqueles que procuram examinar defeitos de evitação e pode ser potencialmente estendido a outros ensaios de C. elegans.
Introduction
Entre as muitas vantagens de estudar C. elegans, seu sistema nervoso simples oferece a oportunidade de estudar como as mudanças em nível genético e celular afetam a função da rede e a produção comportamental. Apesar de ter um número limitado de neurônios, C. elegans exibe uma ampla gama de comportamentos complexos. Um deles é evitar gramado, em que o nematódeo bacterívoro responde a uma fonte de alimento prejudicial deixando o gramado bacteriano. C. elegans evita gramados de bactérias patogênicas 1,2,3, gramados de bactérias produtoras de toxinas ou que são fortificadas com toxinas1,4 e até mesmo bactérias que expressam RNAi cujo knockdown do gene alvo é prejudicial à saúde dos vermes 4,5. Estudos têm demonstrado que os vermes respondem a pistas externas, como metabólitos produzidos pelas bactérias patogênicas1,6, ou pistas internas que indicam que o alimento está adoecendo 4,7. Essas pistas são processadas por vias de sinalização conservadas, como a via da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e a via do fator transformador de crescimento beta (TGFβ), e requerem comunicação entre o intestino e o sistema nervoso 4,6,7,8.
Embora o ensaio seja simples, o comportamento aprendido se desenvolve ao longo de muitas horas, muitas vezes da noite para o dia. Embora existam mutantes que são incapazes de sair, caso em que pontuar evitação em apenas um ponto de tempo é suficiente para demonstrar o defeito, muitos mutantes saem eventualmente, mas são mais lentos para sair. Para estes, o movimento dos vermes precisa ser rastreado a cada poucas horas, o que pode ser difícil de fazer durante a noite. A contagem em si também leva tempo, criando um tempo de atraso entre as placas e, assim, limita o número de placas que podem ser testadas ao mesmo tempo. Usar uma configuração de imagem para registrar muitas placas simultaneamente durante toda a duração do ensaio seria muito útil, mas o custo de instalação pode ser proibitivo, dependendo da situação de financiamento do laboratório de pesquisa.
Para resolver isso, desenvolvemos um método muito simples que usa smartphones para registrar ensaios de evitação. Cada telefone pode gravar vídeos de lapso de tempo de até seis placas de ensaio. Para fornecer luz transmitida, usamos uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED) que pode ser facilmente comprada on-line. As placas de ensaio são colocadas em uma plataforma elevada, apoiada por túneis retangulares ocos, que focalizam a luz recebida, criando contraste. Também fornecemos um script Python que converte os vídeos em arquivos de intercalação de áudio e vídeo (AVI) mostrando clipes de 10 s de cada ponto de tempo de hora. Os vídeos são então cortados em placas individuais e salvos em arquivos separados para usar na contagem manual.
O método proporciona um procedimento de baixo custo e extremamente fácil de usar, utilizando itens que estão prontamente disponíveis para a maioria das pessoas. Aqui, descrevemos o método usando o bem estabelecido ensaio de evitação de gramado contra o patógeno humano Pseudomonas aeruginosa (PA14), cujo protocolo foi previamente descrito 2,9. Finalmente, também revisamos as considerações e limitações do método de imagem para aqueles que desejam aplicá-lo a outros experimentos comportamentais de C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imaginar o comportamento dos animais, em vez de depender da observação direta, não é apenas conveniente, mas também tem a vantagem de deixar documentação visual. Isso permite a análise cega por uma terceira pessoa objetiva, ou pode até mesmo ser usado para análise automatizada usando técnicas de reconhecimento de imagem. Apesar das vantagens, o equipamento padrão geralmente oferecido é de alto custo, por isso se compromete com a configuração uma vez comprado.
Usar smartphones pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Deok Joong Lee pela leitura crítica do manuscrito e teste do código Python. Esta pesquisa foi patrocinada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) e 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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