Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration
Summary
Labortests können den prognostischen Wert der auf der longitudinalen optischen Kohärenztomographie (OCT) basierenden multimodalen Bildgebung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nutzen. Menschliche Spenderaugen mit und ohne AMD werden vor der Gewebeschnittierung mittels OCT, Farbe, Nahinfrarot-Reflexions-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und Autofluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen abgebildet.
Abstract
Eine Progressionssequenz für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die aus der optischen Kohärenztomographie (OCT)-basierten multimodalen (MMI) klinischen Bildgebung gewonnen wurde, könnte den Laborbefunden einen prognostischen Wert verleihen. In dieser Arbeit wurden ex vivo OCT und MMI an menschlichen Spenderaugen vor der Schnittung von Netzhautgewebe appliziert. Die Augen wurden von nicht-diabetischen weißen Spendern im Alter von ≥80 Jahren mit einer Sterbezeit bis zur Konservierung (DtoP) von ≤6 h gewonnen. Die Globen wurden vor Ort geborgen, mit einem 18-mm-Trepan geritzt, um die Entfernung der Hornhaut zu erleichtern, und in gepuffertes 4%iges Paraformaldehyd getaucht. Farbfundusbilder wurden nach Entfernung des vorderen Augenabschnitts mit einem Präparierfernrohr und einer Spiegelreflexkamera unter Verwendung von Trans-, Epi- und Blitzbeleuchtung bei drei Vergrößerungen aufgenommen. Die Kugeln wurden in einem Puffer in einer speziell angefertigten Kammer mit einer 60-Dioptrien-Linse platziert. Sie wurden mit spektraler Domänen-OCT (30° Makulawürfel, 30 μm Abstand, Mittelung = 25), Nahinfrarot-Reflexion, 488 nm Autofluoreszenz und 787 nm Autofluoreszenz abgebildet. Die AMD-Augen zeigten eine Veränderung des retinalen Pigmentepithels (RPE), mit Drusen- oder subretinalen Drusenoidablagerungen (SDDs), mit oder ohne Neovaskularisation und ohne Hinweise auf andere Ursachen. Zwischen Juni 2016 und September 2017 wurden 94 rechte und 90 linke Augen geborgen (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Von den 184 Augen hatten 40,2 % AMD, einschließlich früher intermediärer (22,8 %), atrophischer (7,6 %) und neovaskulärer (9,8 %) AMD, und 39,7 % hatten unauffällige Makulas. Drusen, SDDs, hyperreflektive Herde, Atrophie und fibrovaskuläre Narben wurden mittels OCT identifiziert. Zu den Artefakten gehörten Gewebetrübung, Ablösungen (bakteriell, retinal, RPE, choroidal), foveale zystische Veränderungen, ein wellenförmiges RPE und mechanische Schäden. Um die Kryo-Schnitte zu steuern, wurden OCT-Volumina verwendet, um die Fovea und den Sehnervenkopf sowie spezifische Pathologien zu finden. Die ex-vivo-Volumina wurden mit den in-vivo-Volumina registriert, indem die Referenzfunktion für das Eye-Tracking ausgewählt wurde. Die Ex-vivo-Sichtbarkeit der in vivo beobachteten Pathologie hängt von der Erhaltungsqualität ab. Innerhalb von 16 Monaten wurden 75 schnelle DtoP-Spenderaugen in allen Stadien der AMD geborgen und mit klinischen MMI-Methoden in Szene gesetzt.
Introduction
Fünfzehn Jahre Behandlung der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) mit einer Anti-VEGF-Therapie unter der Leitung der optischen Kohärenztomographie (OCT) haben neue Einblicke in die Progressionssequenz und Mikroarchitektur dieser weit verbreiteten Ursache des Sehverlusts ermöglicht. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass AMD eine dreidimensionale Erkrankung ist, die die neurosensorische Netzhaut, das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut betrifft. Als Ergebnis der OCT-Bildgebung von Studienpatienten und den Mitaugen der behandelten Klinikpatienten werden nun die Merkmale der Pathologie erkannt, die über die von der Farbfundusfotografie hinausgehen, die seit Jahrzehnten ein klinischer Standard ist. Dazu gehören intraretinale Neovaskularisationen (Typ 3 Makulaneovaskularisation1, ehemals angiomatöse Proliferation), subretinale Drusenoidablagerungen (SDDs, auch retikuläre Pseudodrusen genannt)2, multiple Signalwege des RPE-Schicksals3,4 und intensiv gliotische Müllerzellen bei Atrophie 5,6.
Modellsysteme, denen Makula (Zellen und Tiere) fehlen, bilden einige Ausschnitte dieser komplexen Krankheit nach 7,8,9. Ein weiterer Erfolg bei der Linderung der Belastung durch AMD könnte durch die Entdeckung und Erforschung der primären Pathologie im menschlichen Auge, das Verständnis der einzigartigen zellulären Zusammensetzung der Makula und die anschließende Übertragung in Modellsysteme erzielt werden. Dieser Bericht porträtiert eine drei Jahrzehnte währende Zusammenarbeit zwischen einem akademischen Forschungslabor und einer Augenbank. Die hierin beschriebenen Gewebecharakterisierungsmethoden verfolgen zwei Ziele: 1) die sich entwickelnde diagnostische Technologie durch die Demonstration der Grundlagen des Fundusaussehens und der Bildgebungssignalquellen mit Mikroskopie zu informieren und 2) AMD-Proben für gezielte (Immunhistochemie) und ungezielte molekulare Entdeckungstechniken (bildgebende Massenspektrometrie, IMS und räumliche Transkriptomik) zu klassifizieren, die die reine Zapfenfovea und die stäbchenreiche para- und perifovea erhalten. Solche Studien könnten die Translation in die klinische OCT beschleunigen, für die eine Progressionssequenz und eine longitudinale Nachbeobachtung durch Eye-Tracking möglich sind. Diese Technologie, die zur Überwachung der Behandlungseffekte entwickelt wurde, registriert Scans von einem Klinikbesuch zum nächsten mit Hilfe von Netzhautgefäßen. Die Verknüpfung von Eye-Track-OCT mit Laborergebnissen, die mit destruktiven Techniken erzielt wurden, könnte molekularen Befunden eine neue Ebene der Prognose verleihen.
Im Jahr 1993 nahm das Forschungslabor Farbfotos des postmortalen Fundus auf Film10 auf. Inspiriert wurde diese Arbeit durch die hervorragende Photomikroskopie und Histologie der menschlichen peripheren Netzhaut von Foos und Kollegen 11,12,13 und die umfangreichen klinisch-pathologischen Korrelationen der AMD von Sarks et al.14,15. Ab 2009 wurde die multimodale Ex-vivo-Bildgebung (MMI) eingeführt, die auf der Spektraldomäne OCT verankert ist. Dieser Übergang wurde durch die ähnlichen Bemühungen anderer16,17 und insbesondere durch die Erkenntnis inspiriert, dass so viel von der von den Sarks beschriebenen Ultrastruktur im Laufe der Zeit in der Klinik dreidimensional verfügbar war18,19. Ziel war es, Augen mit anhaftenden Makulamuskeln in einem angemessenen Zeitrahmen für aussagekräftige Studien von Phänotypen auf zellulärer Ebene in Netzhaut, RPE und Aderhaut zu gewinnen. Die Absicht war, über die “Pro-Auge”-Statistik hinaus zu “pro Läsionstyp” überzugehen, einem Standard, der von den Konzepten der “anfälligen Plaque” bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflusst wird20,21.
Das Protokoll in diesem Bericht spiegelt Erfahrungen mit fast 400 Paaren von Spenderaugen wider, die in mehreren Strömen akzessioniert wurden. In den Jahren 2011-2014 wurde die Website des Projekts MACULA zur AMD-Histopathologie erstellt, die Schichtdicken und Anmerkungen von 142 archivierten Proben enthält. Diese Augen wurden von 1996-2012 in einem Glutaraldehyd-Paraformaldehyd-Fixiermittel für hochauflösende Epoxidharz-Histologie und Elektronenmikroskopie konserviert. Alle Fundi waren bei Erhalt in Farbe fotografiert worden und wurden kurz vor der Histologie durch OCT neu abgebildet. Ein Augenhalter, der ursprünglich für die Untersuchung des Sehnervs22 konzipiert war, wurde verwendet, um eine Gewebestanze mit einem Durchmesser von 8 mm in voller Dicke aufzunehmen, die auf der Fovea zentriert war. OCT-B-Scans durch das foveale Zentrum und eine 2 mm obere Stelle, die der Histologie auf den gleichen Ebenen entspricht, wurden auf die Website hochgeladen, zusammen mit einem Farbfundusfoto. Die Wahl der OCT-Ebenen wurde durch die Prominenz der AMD-Pathologie unter der Fovea23 und die Prominenz der SDDs in stäbchenreichen Bereichen, die der Fovea überlegen sind, diktiert24,25.
Seit 2013 stehen Augen, die lebenslang mit OCT-verankertem MMI abgebildet wurden, für direkte klinisch-pathologische Korrelationen zur Verfügung. Bei den meisten (7 von 10 Spendern) handelte es sich um Patienten einer Netzhautüberweisungspraxis (Autor: K.B.F.), die ein Register für Patienten, die daran interessiert waren, ihre Augen nach dem Tod zu Forschungszwecken zu spenden, anbot. Die Augen wurden von der örtlichen Augenbank geborgen und konserviert, ins Labor gebracht und auf die gleiche Weise wie die Augen des Projekts MACULA präpariert. Die prämortalen klinischen OCT-Volumina wurden nahtlos im Labor gelesen, wodurch die im Laufe des Lebens beobachteten pathologischen Merkmale mit den unter dem Mikroskop sichtbaren Merkmalen in Einklang gebracht wurden26.
Ab 2014 begann die prospektive Augenentnahme mit einem Screening auf AMD bei Spenderaugen ohne klinische Anamnese, die jedoch während eines definierten Zeitraums (6 h) aufbewahrt wurden. Zu diesem Zweck wurde der Augenhalter so modifiziert, dass er einen ganzen Globus aufnehmen kann. Dies verringerte die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Schnittkanten des zuvor verwendeten 8-mm-Stempels ablösten. Die Augen wurden in 4 % gepuffertem Paraformaldehyd für die Immunhistochemie konserviert und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung auf 1 % überführt. In den Jahren 2016-2017 (vor der Pandemie) wurden 184 Augen von 90 Spendern geborgen. Die Statistiken und Bilder in diesem Bericht stammen aus dieser Serie. Während der Pandemie-Ära (Lockdowns und Nachwirkungen 2020) wurden die prospektiven Sammlungen für Transkriptomik und IMS-Kollaborationen in reduziertem Tempo fortgesetzt, wobei im Wesentlichen die Methoden von 2014 verwendet wurden.
Andere Methoden zur Beurteilung des Spenderauges stehen zur Verfügung. Das Minnesota Grading System (MGS)27,28 basiert auf dem klinischen AREDS-System für die Farbfundusfotografie 29. Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Kombination von atrophischer und neovaskulärer AMD in einem Stadium der “späten AMD”. Des Weiteren beinhaltet die MGS die Entfernung der neurosensorischen Netzhaut vor der Fotodokumentation der RPE-Aderhaut. Dieser Schritt löst SDDs in unterschiedlichem Ausmaß30,31 und entfernt die räumliche Entsprechung der äußeren Netzhaut und ihres Stützsystems. Daher könnten die Bemühungen, den metabolischen Bedarf und die Signalübertragung von der Netzhaut mit der Pathologie in der RPE-Aderhaut in Verbindung zu bringen, behindert werden. Das Utah-System implementierte MMI unter Verwendung von Ex-vivo-Farbfotografie und OCT, um Augen, die für die Sektion bestimmt waren, in Regionen für RNA- und Proteinextraktionen zu kategorisieren32. Obwohl er der Extraktion ganzer Augenmuscheln vorzuziehen ist, macht der Bereich mit einem Durchmesser von 3 mm und dem höchsten Risiko für eine AMD-Progression33,34 nur 25 % einer foveazentrierten Stanze mit 6 mm Durchmesser aus. Daher sind Techniken von Vorteil, die Befunde in Bezug auf die Fovea lokalisieren können, wie z. B. Reihenschnitte für die Immunhistochemie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit einem bevölkerungsbasierten Screening-Ansatz über einen Zeitraum von 16 Monaten in der Vor-COVID-Ära konnten 75 Spenderaugen mit AMD beschafft werden. Alle wurden mit einem kurzen DtoP geborgen und mit einem OCT-verankerten MMI inszeniert. Das Alterskriterium (>80 Jahre) liegt außerhalb der typischen Altersspanne für Gewebegewinnungen, die für transplantierbare Hornhäute vorgesehen sind. Trotz des fortgeschrittenen Alters ergaben unsere Kriterien Augen in allen Stadien der AMD. Viele RPE-Phänotypen sind allen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Heidelberg Engineering für die Instrumentierung und das Design des ursprünglichen Augenhalters, Dr. Richard F. Spaide für die Einführung in die OCT-basierte multimodale Bildgebung, Dr. Christopher Girkin für die Erleichterung des Zugangs zu klinischen Bildgebungsgeräten und David Fisher für Abbildung 1. Die Wiederherstellung der menschlichen Spenderaugen für die Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) und U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), die EyeSight Foundation of Alabama, die International Retinal Research Foundation (C.A.C.), die Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) und Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).
Materials
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
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