エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング
Summary
ラボアッセイでは、加齢黄斑変性症(AMD)の縦断的光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダルイメージングから得られた予後値を活用できます。AMDの有無にかかわらず、ヒトドナーの眼は、組織切片作成の前に、OCT、カラー、近赤外反射率スキャンレーザー検眼鏡、および2つの励起波長での自家蛍光を使用して画像化されます。
Abstract
光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダル(MMI)臨床画像から学んだ加齢黄斑変性症(AMD)の進行シーケンスは、検査所見に予後価値を追加する可能性があります。この研究では、網膜組織切片化の前に、ex vivo OCTとMMIをヒトドナーの目に適用しました。眼は80歳≥の非糖尿病白人ドナーから回収され、死亡から保存までの時間(DtoP)は≤6時間でした。グローブを現場で回収し、角膜の除去を容易にするために18 mmのトレフィンでスコアを付け、緩衝した4%パラホルムアルデヒドに浸しました。前眼部摘出後,解剖スコープと一眼レフカメラを用いてトランス照明,エピ照明,フラッシュ照明を3倍率で撮影した。グローブは、60ジオプターレンズを備えたカスタム設計のチャンバー内のバッファーに配置されました。スペクトルドメインOCT(30°黄斑立方体、30 μm間隔、平均= 25)、近赤外反射率、488 nmの自家蛍光、および787 nmの自家蛍光で画像化しました。AMDの目は、網膜色素上皮(RPE)の変化を示し、ドルーゼンまたは網膜下ドルセノイド沈着物(SDD)、新生血管形成の有無にかかわらず、および他の原因の証拠はありませんでした。2016年6月から2017年9月の間に、右眼94個、左眼90個が回復した(DtoP:3.9±1.0時間)。184眼のうち、40.2%がAMDを有し、初期中期(22.8%)、萎縮性(7.6%)、血管新生(9.8%)AMDを含み、39.7%が目立たない黄斑を有していた。ドルーゼン、SDD、過反射性病巣、萎縮、および線維血管瘢痕はOCTを使用して特定されました。 アーティファクトには、組織の混濁、剥離(細菌、網膜、RPE、脈絡膜)、中心窩嚢胞性変化、起伏のあるRPE、および機械的損傷が含まれていました。凍結切片をガイドするために、OCTボリュームを使用して、中心窩と視神経乳頭のランドマークと特定の病状を見つけました。ex vivoボリュームは、アイトラッキングのための参照機能を選択することによって、in vivoボリュームに登録されました。インビボで見られる病状の生体外での可視性は、保存品質に依存します。16か月以内に、AMDのすべての段階で75の迅速なDtoPドナーの眼が回復し、臨床MMI法を使用して病期分類されました。
Introduction
光干渉断層撮影(OCT)の指導の下で抗VEGF療法で血管新生加齢黄斑変性症(AMD)を管理してきた15年間は、視力喪失のこの一般的な原因の進行シーケンスとマイクロアーキテクチャに新しい洞察を提供しました。重要な認識は、AMDが神経感覚網膜、網膜色素上皮(RPE)、および脈絡膜を含む三次元疾患であるということです。治験患者や治療を受けた臨床患者の仲間の目のOCTイメージングの結果、何十年にもわたって臨床標準であったカラー眼底写真で見られる以上の病理の特徴が認識されるようになりました。これらには、網膜内血管新生(3型黄斑新生血管1、以前は血管腫性増殖)、網膜下ドルセノイド沈着物(SDD、網様偽ドルーゼンとも呼ばれる)2、RPE運命の複数の経路3,4、および萎縮における激しい神経膠生物ミュラー細胞5,6が含まれます。
黄斑(細胞と動物)を欠くモデルシステムは、この複雑な病気のいくつかのスライスを再現します7,8,9。AMDの負担を改善するさらなる成功は、人間の目の原発病理の発見と探索、黄斑のユニークな細胞組成の理解、それに続くモデルシステムへの翻訳からもたらされる可能性があります。このレポートは、学術研究所とアイバンクの30年間のコラボレーションを描いています。本明細書に記載の組織特性評価法の目標は、1)顕微鏡で眼底の外観と画像化シグナル源の基礎を実証することにより、進化する診断技術に情報を提供すること、2)AMD標本を標的(免疫組織化学)および非標的分子探索技術(イメージング質量分析、IMS、および空間トランスクリプトミクス)のために分類することであり、錐体のみの中心窩と桿状に富む傍中心窩および中心窩を保存します。このような研究は、アイトラッキングを通じて進行シーケンスと縦断的フォローアップが可能な臨床OCTへの翻訳を加速する可能性があります。治療効果を監視するように設計されたこの技術は、網膜血管を使用して、あるクリニック訪問から次のクリニック訪問へのスキャンを登録します。眼球追跡OCTを破壊的技術で得られた検査結果にリンクさせることは、分子所見に新しいレベルの予後価値を提供する可能性があります。
1993年、研究所は死後の眼底のカラー写真をフィルム10に撮影しました。この取り組みは、Foosらによるヒト末梢網膜の優れた顕微鏡検査と組織学11,12,13と、Sarksらによる広範なAMD臨床病理学的相関に触発されました14,15。2009年から、スペクトルドメインOCTに固定されたex vivoマルチモーダルイメージング(MMI)が採用されました。この移行は、他の人の同様の努力16,17、特にサークスによって記述された超微細構造の多くが、時間の経過とともにクリニックで3次元で利用可能であるという認識に触発されました18,19。目標は、網膜、RPE、および脈絡膜における細胞レベルの表現型の十分な検出力のある研究のために、妥当な時間枠で黄斑が付着した目を取得することでした。その意図は、「目ごと」の統計を超えて、心血管疾患の「脆弱なプラーク」の概念の影響を受けた基準である「病変タイプごと」に移行することでした20,21。
このレポートのプロトコルは、いくつかのストリームでアクセッションされた約400組のドナーアイの経験を反映しています。2011年から2014年にかけて、AMD組織病理学のプロジェクトMACULAウェブサイトが作成され、142のアーカイブされた標本からの層の厚さと注釈が含まれています。これらの眼は、高分解能エポキシ樹脂組織学および電子顕微鏡観察のために、1996年から2012年までグルタルアルデヒド-パラホルムアルデヒド固定剤で保存されました。すべてのファンディは、受け取ったときにカラーで撮影され、組織学の直前にOCTによって再画像化されました。もともと視神経研究用に設計されたアイホルダー22を使用して、中心窩を中心とした直径8mmの全層組織パンチを収容しました。中心窩の中心と2 mm上の部位を通るOCT Bスキャンは、同じレベルの組織学に対応し、カラー眼底写真をウェブサイトにアップロードしました。OCT平面の選択は、中心窩23の下のAMD病理の卓越性と、中心窩24,25よりも優れた桿体が豊富な領域でのSDDの卓越性によって決定されました。
2013年以降、生涯にOCTアンカーMMIで画像化された目は、直接的な臨床病理学的相関のために利用可能になりました。ほとんど(10人のドナーのうち7人)は、研究目的で死後に眼を提供することに関心のある患者に高度な指令レジストリを提供する網膜紹介診療所(著者:KBF)の患者に関係していました。眼は地元のアイバンクによって回収・保存され、研究所に移され、プロジェクトMACULAの目と同じ方法で準備されました。死前の臨床OCTボリュームは実験室でシームレスに読み取られ、したがって、人生の間に見られる病理学的特徴を顕微鏡下で見られる特徴と一致させた26。
2014年以降、前向き眼球採集は、病歴のないドナー眼でAMDのスクリーニングから始まりましたが、定義された制限時間(6時間)の間保存されました。この目的のために、アイホルダーは地球全体を収容するように変更されました。これにより、以前に使用されていた8 mmパンチのカットエッジの周りで剥離する可能性が減少しました。眼は免疫組織化学のために4%緩衝パラホルムアルデヒドで保存され、長期保存のために翌日1%に移されました。2016年から2017年(パンデミック前)に、90人のドナーから184の目が回復しました。このレポートの統計情報と画像は、このシリーズから生成されます。パンデミックの時代(2020年の封鎖と余波)の間、トランスクリプトミクスとIMSコラボレーションの将来の収集は、基本的に2014年の方法を使用して、ペースを下げて継続しました。
ドナーの目の評価のための他の方法が利用可能です。ミネソタグレーディングシステム(MGS)27,28は、カラー眼底写真用のAREDS臨床システムに基づいています29。この方法の限界には、萎縮性AMDと新生血管性AMDを「後期AMD」の1つの段階に組み合わせることが含まれます。さらに、MGSは、RPE脈絡膜の写真記録の前に神経感覚網膜の除去を伴う。このステップは、SDDをさまざまな程度30,31に取り除き、外側網膜とそのサポートシステムの空間的対応を取り除きます。したがって、網膜からの代謝要求とシグナル伝達をRPE脈絡膜の病理に結び付ける努力が妨げられる可能性があります。ユタシステムは、ex vivoカラー写真とOCTを使用してMMIを実装し、解剖される予定の目をRNAおよびタンパク質抽出用の領域に分類しました32。アイカップ全体の抜歯よりも好ましいが、AMD進行33,34のリスクが最も高い直径3mmの領域は、直径6mmの中心窩中心のパンチの25%に過ぎない。したがって、免疫組織化学のための連続切片化など、中心窩を参照して所見を局在化できる技術が有利である。
Protocol
Representative Results
Discussion
COVID以前の16か月間に集団ベースのスクリーニングアプローチを使用して、AMDで75人のドナーの目を調達することができました。すべて短いDtoPで回収し、OCTアンカーMMIを使用してステージングしました。年齢基準(>80歳)は、移植可能な角膜を対象とした組織回復の典型的な年齢範囲外です。高齢にもかかわらず、私たちの基準はAMDのすべての段階で目をもたらしました。多くのRPE表現型はすべ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オリジナルのアイホルダーの計装と設計を提供してくれたハイデルベルクエンジニアリング、OCTベースのマルチモーダルイメージングの紹介をしてくれたRichard F. Spaide MD、臨床画像デバイスへのアクセスを容易にしてくれたChristopher Girkin MD、 図 1を提供してくれたDavid Fisherに感謝します。研究のための人間のドナーの目の回復は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01EY06019(C.A.C.)、P30 EY003039(ピットラー)、R01EY015520(スミス)、R01EY027948(C.A.C.、T.A.)によってサポートされました。R01EY030192(Li)、R01EY031209(スタンボリアン)、U54EY032442(スプラギンズ)、IZKFヴュルツブルク(N-304、T.A)、アラバマ州アイサイト財団、国際網膜研究財団(C.A.C.)、アーノルドとメイベルベックマン黄斑研究イニシアチブ(C.A.C.)、および失明防止AMDカタリスト(シャイ)。
Materials
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
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