عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.
Abstract
القلب النامي هو هيكل معقد يحتوي على خلايا سلفية مختلفة تتحكم فيها آليات تنظيمية معقدة. يسمح فحص التعبير الجيني وحالة الكروماتين للخلايا الفردية بتحديد نوع الخلية وحالتها. كشفت مناهج تسلسل الخلية الواحدة عن عدد من الخصائص المهمة لعدم تجانس الخلايا السلفية القلبية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق بشكل عام على الأنسجة الطازجة ، مما يحد من الدراسات ذات الظروف التجريبية المتنوعة ، حيث يجب معالجة الأنسجة الطازجة مرة واحدة في نفس الجري لتقليل التباين التقني. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراءات سهلة ومرنة لإنتاج البيانات من طرق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) في هذا المجال. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى بسرعة للنواة المزدوجة أحادية النوى اللاحقة (الجمع بين snRNA-seq و snATAC-seq). تسمح هذه الطريقة بعزل النوى من العينات المجمدة للخلايا السلفية القلبية ويمكن دمجها مع المنصات التي تستخدم غرف الموائع الدقيقة.
Introduction
من بين العيوب الخلقية ، عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي الأكثر شيوعا ، وتحدث في حوالي 1٪ من المواليد الأحياء كلعام 1,2. يتم تحديد الطفرات الجينية في أقلية فقط من الحالات ، مما يعني أن الأسباب الأخرى ، مثل التشوهات في تنظيم الجينات ، متورطة في مسببات أمراض القلبالتاجية 2,3. تطور القلب هو عملية معقدة من أنواع الخلايا المتنوعة والمتفاعلة ، مما يجعل تحديد الطفرات السببية غير المشفرة وتأثيراتها على تنظيم الجينات أمرا صعبا. يبدأ تكوين الأعضاء في القلب بالسلف الخلوي الذي يؤدي إلى ظهور أنواع فرعية مختلفة من خلايا القلب ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب والخلايا الليفية وخلايا القلب والشغاف 4,5. يظهر علم الجينوم أحادي الخلية كطريقة رئيسية لدراسة نمو القلب وتقييم تأثير عدم التجانس الخلوي في الصحة والمرض6. سهل تطوير طرق متعددة الأوميكس للقياس المتزامن للمعلمات المختلفة وتوسيع خطوط الأنابيب الحسابية اكتشاف أنواع الخلايا والأنواع الفرعية في القلب الطبيعي والمريض6. توضح هذه المقالة بروتوكول عزل أحادي النواة موثوق به للخلايا السلفية القلبية المجمدة التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران المتوافقة مع snRNA-seq و snATAC-seq (بالإضافة إلى snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة)7،8،9.
ATAC-seq هي طريقة قوية تسمح بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة التنظيمية ووضع النيوكليوسومات10,11. تستخدم هذه المعلومات لاستخلاص استنتاجات حول موقع عوامل النسخ وهويتها ونشاطها. وبالتالي ، يمكن تحليل نشاط عوامل الكروماتين ، بما في ذلك أجهزة إعادة التشكيل ، وكذلك نشاط النسخ لبوليميراز الحمض النووي الريبي ، لأن الطريقة حساسة للغاية لقياس التغيرات الكمية في بنية الكروماتين 1,2. وبالتالي ، يوفر ATAC-seq نهجا قويا ومحايدا للكشف عن الآليات التي تتحكم في تنظيم النسخ في نوع معين من الخلايا. كما تم التحقق من صحة بروتوكولات ATAC-seq لقياس إمكانية الوصول إلى الكروماتين في الخلايا المفردة ، مما يكشف عن التباين في بنية الكروماتين داخل مجموعات الخلايا10،12،13.
على الرغم من حدوث تقدم ملحوظ في مجال الخلايا المفردة في السنوات الأخيرة ، إلا أن الصعوبة الرئيسية تكمن في معالجة العينات الجديدة اللازمة لإجراء هذه التجارب14. للتحايل على هذه الصعوبة ، تم إجراء اختبارات مختلفة بهدف إجراء تحليلات مثل snRNA-seq و snATAC-seq مع أنسجة أو خلايا القلب المجمدة15,16.
تم استخدام العديد من المنصات لتحليل بيانات الجينوم أحادية الخلية17. المنصات المستخدمة على نطاق واسع للتعبير الجيني أحادي الخلية وتنميط ATAC هي منصات لتغليف قطرات الموائع الدقيقةالمتعددة 17. نظرا لأن هذه المنصات تستخدم غرف الموائع الدقيقة ، يمكن للحطام أو الركام أن يسد النظام ، مما يؤدي إلى بيانات غير قابلة للاستخدام. وبالتالي ، فإن نجاح دراسات الخلية الواحدة يعتمد على العزل الدقيق للخلايا / النوى الفردية.
يستخدم البروتوكول المقدم هنا نهجا مشابها للدراسات الحديثة باستخدام snRNA-seq و snATAC-seq لفهم عيوب القلب الخلقية18،19،20،21،22،23. يستخدم هذا الإجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة القلب التي تم تشريحها حديثا متبوعا بالحفظ بالتبريد للخلايا السلفية القلبية للفئران. بعد ذوبان الجليد ، يتم تنقية الخلايا القابلة للحياة ومعالجتها للعزل النووي. في هذا العمل ، تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للحصول على بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس التحضير النووي للخلايا السلفية القلبية للفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر تحليل التركيب الخلوي للقلب النامي من خلال دراسات snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة فهما أعمق لأصل أمراض القلب الخلقية26. درست العديد من مختبرات الأبحاث آثار حفظ أنسجة القلب بالتبريد على snRNA-seq27. يمكن أن يكون إجراء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام أنسجة تشريح دقيقة جديدة من نماذج الفئ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل ERA-CVD-2019 و ANR-JCJC-2020 إلى SS. نشكر مرفق علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية (GBiM) من مختبر U 1251 / Marseille Medical Genetics والمراجعين المجهولين على تقديم تعليقات قيمة.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
