Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.
Abstract
Das sich entwickelnde Herz ist eine komplexe Struktur mit verschiedenen Vorläuferzellen, die von komplexen Regulationsmechanismen gesteuert werden. Die Untersuchung der Genexpression und des Chromatinzustandes einzelner Zellen ermöglicht die Identifizierung des Zelltyps und -zustands. Einzelzell-Sequenzierungsansätze haben eine Reihe wichtiger Merkmale der kardialen Vorläuferzellheterogenität aufgezeigt. Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf frisches Gewebe beschränkt, was Studien mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen einschränkt, da das frische Gewebe im selben Durchlauf auf einmal verarbeitet werden muss, um die technische Variabilität zu reduzieren. Daher werden in diesem Bereich einfache und flexible Verfahren zur Datengewinnung aus Methoden wie der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und dem Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (snATAC-seq) benötigt. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur schnellen Isolierung von Zellkernen für nachfolgende Single-Nuclei-Dual-Omics (kombinierte snRNA-seq und snATAC-seq) vor. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Zellkernen aus gefrorenen Proben kardialer Vorläuferzellen und kann mit Plattformen kombiniert werden, die mikrofluidische Kammern verwenden.
Introduction
Unter den Geburtsfehlern sind angeborene Herzfehler (KHK) am häufigsten und treten jedes Jahr bei etwa 1 % der Lebendgeburtenauf 1,2. Genetische Mutationen werden nur in einer Minderheit der Fälle identifiziert, was darauf hindeutet, dass andere Ursachen, wie z. B. Anomalien in der Genregulation, an der Ätiologie der KHK beteiligt sind 2,3. Die kardiale Entwicklung ist ein komplexer Prozess verschiedener und interagierender Zelltypen, was die Identifizierung kausaler nicht-kodierender Mutationen und ihrer Auswirkungen auf die Genregulation schwierig macht. Die Organogenese des Herzens beginnt mit zellulären Vorläuferzellen, aus denen verschiedene Subtypen von Herzzellen hervorgehen, darunter Myokard-, Fibroblasten-, Epikard- und Endokardzellen 4,5. Die Einzelzellgenomik entwickelt sich zu einer Schlüsselmethode für die Untersuchung der Herzentwicklung und die Bewertung der Auswirkungen zellulärer Heterogenität auf Gesundheit und Krankheit6. Die Entwicklung von Multi-Omics-Methoden zur gleichzeitigen Messung verschiedener Parameter und der Ausbau von Rechenpipelines haben die Entdeckung von Zelltypen und -subtypen im normalen und erkrankten Herzen ermöglicht6. Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Einzelkern-Isolationsprotokoll für gefrorene kardiale Vorläuferzellen, das aus Mausembryonen gewonnen wurde und mit nachgeschalteten snRNA-seq und snATAC-seq (sowie snRNA-seq und snATAC-seq kombiniert) kompatibel ist7,8,9.
ATAC-seq ist eine robuste Methode, die die Identifizierung regulatorisch offener Chromatinregionen und die Positionierung von Nukleosomenermöglicht 10,11. Diese Informationen werden verwendet, um Rückschlüsse auf den Ort, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zu ziehen. Die Aktivität von Chromatinfaktoren, einschließlich Remodelern, sowie die Transkriptionsaktivität der RNA-Polymerase können somit analysiert werden, da die Methode für die Messung quantitativer Veränderungen in der Chromatinstruktur hochempfindlich ist 1,2. Somit bietet ATAC-seq einen robusten und unparteiischen Ansatz, um die Mechanismen aufzudecken, die die transkriptionelle Regulation in einem bestimmten Zelltyp steuern. ATAC-seq-Protokolle wurden auch validiert, um die Chromatinzugänglichkeit in einzelnen Zellen zu messen, was die Variabilität der Chromatinarchitektur innerhalb von Zellpopulationen aufzeigt10,12,13.
Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte auf dem Gebiet der Einzelzellen gegeben hat, besteht die Hauptschwierigkeit in der Verarbeitung der frischen Proben, die für die Durchführung dieser Experimente benötigt werden14. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, wurden verschiedene Tests mit dem Ziel durchgeführt, Analysen wie snRNA-seq und snATAC-seq mit gefrorenem Herzgewebe oder -zellen durchzuführen15,16.
Mehrere Plattformen wurden verwendet, um Einzelzell-Genomikdaten zu analysieren17. Die weit verbreiteten Plattformen für die Einzelzell-Genexpression und die ATAC-Profilerstellung sind Plattformen für die Verkapselung mehrerer mikrofluidischer Tröpfchen17. Da diese Plattformen mikrofluidische Kammern verwenden, können Schmutz oder Aggregate das System verstopfen, was zu unbrauchbaren Daten führt. Der Erfolg von Einzelzellstudien hängt also von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.
Das hier vorgestellte Protokoll verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, in denen snRNA-seq und snATAC-seq verwendet werden, um angeborene Herzfehler zu verstehen 18,19,20,21,22,23. Bei diesem Verfahren wird die enzymatische Dissoziation von frisch mikropräpariertem Herzgewebe mit anschließender Kryokonservierung von kardialen Vorläuferzellen der Maus verwendet. Nach dem Auftauen werden die lebensfähigen Zellen gereinigt und für die Kernisolierung aufbereitet. In dieser Arbeit wurde dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus der gleichen Kernpräparation von kardialen Vorläuferzellen der Maus zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse der zellulären Zusammensetzung des sich entwickelnden Herzens durch kombinierte snRNA-seq- und snATAC-seq-Studien liefert ein tieferes Verständnis der Entstehung von angeborenen Herzfehlern26. Mehrere Forschungslabore haben die Auswirkungen der Kryokonservierung von Herzgewebe auf snRNA-seq27 untersucht. Die Durchführung von snRNA-seq und snATAC-seq unter Verwendung von frischem, mikropräpariertem Gewebe aus Mausmodellen menschlicher Krankheiten kann beim Ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch ERA-CVD-2019 und ANR-JCJC-2020 bis SS unterstützt. Wir danken der Genomics and Bioinformatics Facility (GBiM) des U 1251/Marseille Medical Genetics Lab und den anonymen Gutachtern für ihre wertvollen Kommentare.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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