シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)
Summary
ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。
Abstract
発達中の心臓は、複雑な調節機構によって制御される様々な前駆細胞を含む複雑な構造である。個々の細胞の遺伝子発現とクロマチン状態の検査は、細胞の種類と状態の識別を可能にします。シングルセルシーケンシングアプローチは、心臓前駆細胞の不均一性の多くの重要な特性を明らかにしました。ただし、これらの方法は一般に新鮮な組織に限定されており、技術的なばらつきを減らすために新鮮な組織を同じ実行で一度に処理する必要があるため、多様な実験条件での研究が制限されます。したがって、この分野では、一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、ハイスループットシーケンシングを備えたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの一核アッセイ(snATAC-seq)などの方法からデータを生成するための簡単で柔軟な手順が必要です。ここでは、後続の単一核デュアルオミクス(snRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)のために核を迅速に分離するためのプロトコルを紹介します。この方法は、心臓前駆細胞の凍結サンプルからの核の単離を可能にし、マイクロ流体チャンバーを使用するプラットフォームと組み合わせることができます。
Introduction
先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD 2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています6。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました6。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-seq(およびsnRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)と互換性のある信頼性の高い単核単細胞分離プロトコルについて説明します7,8,9。
ATAC-seqは、調節オープンクロマチン領域の同定とヌクレオソームの位置決めを可能にする堅牢な方法です10,11。この情報は、転写因子の位置、同一性、および活性に関する結論を引き出すために使用されます。リモデリング剤を含むクロマチン因子の活性、およびRNAポリメラーゼの転写活性は、クロマチン構造の定量的変化を測定するのに非常に感度が高いため、分析することができます1,2。したがって、ATAC-seqは、特定の細胞型における転写調節を制御するメカニズムを明らかにするための堅牢で公平なアプローチを提供します。ATAC-seqプロトコルは、単一細胞におけるクロマチンアクセシビリティを測定するためにも検証されており、細胞集団内のクロマチン構造のばらつきを明らかにしています10、12、13。
近年、単一細胞の分野で顕著な進歩がありましたが、主な困難は、これらの実験を実行するために必要な新鮮なサンプルの処理です14。この困難を回避するために、凍結心臓組織または細胞を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqなどの分析を行うことを目的として様々な試験が実施されてきた15,16。
シングルセルゲノミクスデータを解析するために、いくつかのプラットフォームが使用されてきた17。単一細胞遺伝子発現およびATACプロファイリングに広く使用されているプラットフォームは、複数のマイクロ流体液滴カプセル化のためのプラットフォームです17。これらのプラットフォームはマイクロ流体チャンバーを使用しているため、破片や凝集物がシステムを詰まらせ、データが使用できなくなる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、個々の細胞/核の正確な分離にかかっています。
ここで紹介するプロトコルは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqを使用した最近の研究と同様のアプローチを使用して、先天性心疾患を理解しています18、19、20、21、22、23。この手順では、新たにマイクロ解剖された心臓組織の酵素解離とそれに続くマウス心臓前駆細胞の凍結保存を利用します。解凍後、生細胞は精製され、核分離のために処理されます。この研究では、このプロトコルを使用して、マウス心臓前駆細胞の同じ核製剤からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを取得することに成功しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせた研究による発達中の心臓の細胞組成の分析は、先天性心疾患の起源のより深い理解を提供します26。いくつかの研究所は、snRNA-seq27に対する心臓組織の凍結保存の効果を研究しています。ヒト疾患のマウスモデルから得られた新鮮な微小解剖組織を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqを実施することは、異なる実験条件を比較する際?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ERA-CVD-2019およびANR-JCJC-2020からSSの支援を受けて行われました。貴重なコメントを提供してくれたU 1251 /Marseille Medical Geneticsラボのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスファシリティ(GBiM)と匿名のレビューアに感謝します。
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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