Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu
Summary
Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.
Abstract
Gelişmekte olan kalp, karmaşık düzenleyici mekanizmalar tarafından kontrol edilen çeşitli progenitör hücreleri içeren karmaşık bir yapıdır. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonunun ve kromatin durumunun incelenmesi, hücre tipinin ve durumunun tanımlanmasını sağlar. Tek hücreli dizileme yaklaşımları, kardiyak progenitör hücre heterojenitesinin bir dizi önemli özelliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle taze doku ile sınırlıdır, bu da farklı deneysel koşullara sahip çalışmaları sınırlar, çünkü taze dokunun teknik değişkenliği azaltmak için aynı anda işlenmesi gerekir. Bu nedenle, bu alanda tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve yüksek verimli dizileme (snATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli test gibi yöntemlerden veri üretmek için kolay ve esnek prosedürlere ihtiyaç vardır. Burada, sonraki tek çekirdekli dual-omikler (kombine snRNA-seq ve snATAC-seq) için çekirdekleri hızlı bir şekilde izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çekirdeklerin kardiyak progenitör hücrelerin dondurulmuş örneklerinden izole edilmesine izin verir ve mikroakışkan odalar kullanan platformlarla birleştirilebilir.
Introduction
Doğum kusurları arasında, konjenital kalp kusurları (KKH’ler) en yaygın olanıdır ve her yıl canlı doğumların yaklaşık% 1’inde görülür 1,2. Genetik mutasyonlar vakaların sadece küçük bir kısmında tanımlanmıştır, bu da gen regülasyonundaki anormallikler gibi diğer nedenlerin KKH 2,3’ün etiyolojisinde rol oynadığını ima etmektedir. Kardiyak gelişim, çeşitli ve etkileşimli hücre tiplerinin karmaşık bir sürecidir ve nedensel kodlamayan mutasyonların tanımlanmasını ve gen regülasyonu üzerindeki etkilerini zorlaştırır. Kalbin organogenezi, miyokardiyal, fibroblast, epikardial ve endokardiyal hücreler dahil olmak üzere farklı kalp hücreleri alt tiplerine yol açan hücresel progenitörlerle başlar 4,5. Tek hücreli genomik, kalp gelişimini incelemek ve hücresel heterojenitenin sağlık ve hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için anahtar bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır6. Farklı parametrelerin eşzamanlı ölçümü için multi-omik yöntemlerin geliştirilmesi ve hesaplama boru hatlarının genişletilmesi, normal ve hastalıklı kalpte hücre tiplerinin ve alt tiplerinin keşfedilmesini kolaylaştırmıştır6. Bu makalede, fare embriyolarından elde edilen dondurulmuş kardiyak progenitör hücreler için aşağı akış snRNA-seq ve snATAC-seq (ayrıca snRNA-seq ve snATAC-seq kombinasyonu) ile uyumlu güvenilir bir tek çekirdekli izolasyon protokolü açıklanmaktadır7,8,9.
ATAC-seq, düzenleyici açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına ve nükleozomların10,11’in konumlandırılmasına izin veren sağlam bir yöntemdir. Bu bilgi, transkripsiyon faktörlerinin yeri, kimliği ve etkinliği hakkında sonuçlar çıkarmak için kullanılır. Bu nedenle, remodelleyiciler de dahil olmak üzere kromatin faktörlerinin aktivitesi ve RNA polimerazın transkripsiyonel aktivitesi, yöntem, kromatin yapısı 1,2’deki nicel değişiklikleri ölçmek için oldukça hassas olduğu için analiz edilebilir. Bu nedenle, ATAC-seq, belirli bir hücre tipinde transkripsiyonel düzenlemeyi kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için sağlam ve tarafsız bir yaklaşım sağlar. ATAC-seq protokolleri, tek hücrelerde kromatin erişilebilirliğini ölçmek için de doğrulanmıştırve hücre popülasyonları 10,12,13 içindeki kromatin mimarisindeki değişkenliği ortaya koymaktadır.
Son yıllarda tek hücreler alanında kayda değer ilerlemeler olmasına rağmen, asıl zorluk bu deneyleri gerçekleştirmek için gereken taze örneklerin işlenmesidir14. Bu zorluğun üstesinden gelmek için dondurulmuş kalp dokusu veya hücre15,16 ile snRNA-seq ve snATAC-seq gibi analizlerin yapılması amacıyla çeşitli testler yapılmıştır.
Tek hücreli genomik verileri analiz etmek için çeşitli platformlar kullanılmıştır17. Tek hücreli gen ekspresyonu ve ATAC profillemesi için yaygın olarak kullanılan platformlar, çoklu mikroakışkan damlacık kapsüllemesi için platformlardır17. Bu platformlar mikroakışkan odalar kullandığından, enkaz veya agregalar sistemi tıkayabilir ve kullanılamaz verilere neden olabilir. Bu nedenle, tek hücreli çalışmaların başarısı, bireysel hücrelerin / çekirdeklerin doğru izolasyonuna bağlıdır.
Burada sunulan protokol, konjenital kalp kusurlarını anlamak için snRNA-seq ve snATAC-seq kullanan son çalışmalara benzer bir yaklaşım kullanmaktadır 18,19,20,21,22,23. Bu prosedür, taze mikrodiseke edilmiş kalp dokusunun enzimatik ayrışmasını ve ardından fare kardiyak progenitör hücrelerinin kriyoprezervasyonunu kullanır. Çözüldükten sonra, canlı hücreler saflaştırılır ve nükleer izolasyon için işlenir. Bu çalışmada, bu protokol, fare kardiyak progenitör hücrelerinin aynı nükleer preparatından snRNA-seq ve snATAC-seq verilerini elde etmek için başarıyla kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelişmekte olan kalbin hücresel bileşiminin kombine snRNA-seq ve snATAC-seq çalışmaları ile analizi, konjenital kalp hastalığının kökeni hakkında daha derin bir anlayış sağlar26. Birkaç araştırma laboratuvarı, kardiyak doku kriyoprezervasyonunun snRNA-seq27 üzerindeki etkilerini incelemiştir. İnsan hastalığının fare modellerinden taze mikro-disseke edilmiş doku kullanarak snRNA-seq ve snATAC-seq iletmek, farklı deneysel koşulları karşılaşt?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma SS’ye ERA-CVD-2019 ve ANR-JCJC-2020 tarafından desteklenmiştir. U 1251/Marsilya Tıbbi Genetik laboratuvarından Genomik ve Biyoinformatik tesisine (GBiM) ve değerli yorumlar sağlayan isimsiz hakemlere teşekkür ederiz.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
