Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении

Summary

Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.

Abstract

Развивающееся сердце представляет собой сложную структуру, содержащую различные клетки-предшественники, контролируемые сложными регуляторными механизмами. Изучение экспрессии генов и состояния хроматина отдельных клеток позволяет идентифицировать тип и состояние клеток. Подходы к секвенированию отдельных клеток выявили ряд важных характеристик гетерогенности клеток-предшественников сердца. Однако эти методы, как правило, ограничены свежей тканью, что ограничивает исследования с различными экспериментальными условиями, поскольку свежая ткань должна быть обработана сразу в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость. Поэтому в этой области необходимы простые и гибкие процедуры для получения данных с помощью таких методов, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и одноядерный анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (snATAC-seq). Здесь мы представляем протокол для быстрого выделения ядер для последующих одноядерных двойных омиков (комбинированные snRNA-seq и snATAC-seq). Этот метод позволяет выделять ядра из замороженных образцов клеток-предшественников сердца и может быть объединен с платформами, использующими микрофлюидные камеры.

Introduction

Среди врожденных дефектов наиболее распространены врожденные пороки сердца (ВПС), встречающиеся примерно у 1% живорождений каждый год ^1,2. Генетические мутации выявляются лишь в меньшинстве случаев, что означает, что в этиологии ИБС ^2,3 участвуют другие причины, такие как нарушения регуляции генов. Развитие сердца представляет собой сложный процесс разнообразных и взаимодействующих типов клеток, что затрудняет идентификацию причинно-следственных некодирующих мутаций и их влияния на регуляцию генов. Органогенез сердца начинается с клеточных предшественн....

Protocol

Процедура на животных, принятая в этом исследовании, была одобрена комитетами по этике животных Университета Экс-Марсель (C2EA-14) и проводилась в соответствии с протоколами, утвержденными назначенным национальным этическим комитетом по экспериментам на животных (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Авторизация Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Настройка спаривания по времени перед вскрытием

1. Чтобы получить эмбрионы мышей, выполните спаривание между взрослыми мышами за 9,5 дней до выделения области сердца. В этой процедуре использовались мыши дикого типа C57BL/6J в ....

Results

По сравнению с приготовлением одноклеточных суспензий для одноклеточных подходов, приготовление одноядерных суспензий является гораздо более сложным и требует более высокой степени разрешения и обработки. Ключевым фактором успешного комбинирования snRNA-seq и snATAC-seq является чистая и неповрежденная суспензия ядер. Протокол эффективного выделения ядер должен быть адаптирован к каждому типу и состоянию ткани (свежей или замороженной). Здесь описан оптимизированный протокол выделения ядер из замороженных эмбриональных с.......

Discussion

Анализ клеточного состава развивающегося сердца с помощью комбинированных исследований snRNA-seq и snATAC-seq обеспечивает более глубокое понимание происхождения врожденных пороков сердца²⁶. Несколько исследовательских лабораторий изучили влияние криоконсервации сердечной ткани на snRNA-seq²⁷. Проведение snRNA-seq и snATAC-seq с использованием свежей микрорассеченной ткани из мышиных моделей заболеваний человека может быть логистически сложным при сравнении различных экспер.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Биоанализатор Прибор	Agilent		No каталожный
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 наборов	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + пучок реагентов экспрессии генов, 4 rxn (включая буфер ядер 20X)	10X Genomics	1000285
Камеру подсчета клеток Countess	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No Каталожный номер
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	стерильный и безРНКазный
двойной индексный набор TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 мл конические центрифужные пробирки	Fisher Scientific
Falcon 50 мл конические центрифужные пробирки	Fisher Scientific
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Термоинактивированный Высокочувствительный
набор ДНК	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Набор для жизнеспособности/цитотоксичности	Thermofisher	L3224
MACS Набор для удаления мертвых клеток: Микрогранулы Dead Cell Romoval, связывающий буфер 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartSits (30 & микро; m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Хлорид магния (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS	Колонки Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No каталожного номера
Пенициллин Стрептомицин (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40&микро; m	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Ингибитор горных пород	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Стандартная чашка Петри 90мм Sterilin	Thermofisher	101R20
Стерильная вода двойной дистилляции	Thermofisher	R0582
Тризма гидрохлорид раствор (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Трипан Синий морилка (0.4%)	Invitrogen	T10282
Трипсин 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Наконечники для пипеток с широким отверстием и фильтром 200 мкм; l	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		Нет каталожного номера