Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении
Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.
Abstract
Развивающееся сердце представляет собой сложную структуру, содержащую различные клетки-предшественники, контролируемые сложными регуляторными механизмами. Изучение экспрессии генов и состояния хроматина отдельных клеток позволяет идентифицировать тип и состояние клеток. Подходы к секвенированию отдельных клеток выявили ряд важных характеристик гетерогенности клеток-предшественников сердца. Однако эти методы, как правило, ограничены свежей тканью, что ограничивает исследования с различными экспериментальными условиями, поскольку свежая ткань должна быть обработана сразу в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость. Поэтому в этой области необходимы простые и гибкие процедуры для получения данных с помощью таких методов, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и одноядерный анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (snATAC-seq). Здесь мы представляем протокол для быстрого выделения ядер для последующих одноядерных двойных омиков (комбинированные snRNA-seq и snATAC-seq). Этот метод позволяет выделять ядра из замороженных образцов клеток-предшественников сердца и может быть объединен с платформами, использующими микрофлюидные камеры.
Introduction
Среди врожденных дефектов наиболее распространены врожденные пороки сердца (ВПС), встречающиеся примерно у 1% живорождений каждый год 1,2. Генетические мутации выявляются лишь в меньшинстве случаев, что означает, что в этиологии ИБС 2,3 участвуют другие причины, такие как нарушения регуляции генов. Развитие сердца представляет собой сложный процесс разнообразных и взаимодействующих типов клеток, что затрудняет идентификацию причинно-следственных некодирующих мутаций и их влияния на регуляцию генов. Органогенез сердца начинается с клеточных предшественников, дающих начало различным подтипам сердечных клеток, включая клетки миокарда, фибробластов, эпикардиальных и эндокардиальных клеток 4,5. Одноклеточная геномика становится ключевым методом изучения развития сердца и оценки влияния клеточной гетерогенности на здоровье и болезни6. Разработка мультиомических методов одновременного измерения различных параметров и расширение вычислительных конвейеров облегчили открытие типов и подтипов клеток в нормальном и больном сердце6. В данной статье описывается надежный протокол выделения одного ядра для замороженных клеток-предшественников сердца, полученных из эмбрионов мышей, который совместим с нРНК-секвенированием и snATAC-секвенированием (а также snRNA-seq и snATAC-seq вместе взятыми)7,8,9.
ATAC-seq – это надежный метод, который позволяет идентифицировать регуляторные открытые области хроматина и позиционировать нуклеосомы10,11. Эта информация используется для того, чтобы сделать выводы о расположении, идентичности и активности факторов транскрипции. Таким образом, можно проанализировать активность хроматиновых факторов, в том числе ремоделиров, а также транскрипционную активность РНК-полимеразы, поскольку метод является высокочувствительным для измерения количественных изменений структуры хроматина 1,2. Таким образом, ATAC-seq обеспечивает надежный и беспристрастный подход к раскрытию механизмов, контролирующих регуляцию транскрипции в определенном типе клеток. Протоколы ATAC-seq также были проверены для измерения доступности хроматина в отдельных клетках, что выявило вариабельность архитектуры хроматина в клеточных популяциях10,12,13.
Несмотря на то, что в последние годы были достигнуты заметные успехи в области одиночных клеток, основная трудность заключается в обработке свежих образцов, необходимых для проведения этих экспериментов14. Чтобы обойти эту трудность, были проведены различные тесты с целью проведения таких анализов, как snRNA-seq и snATAC-seq с замороженной сердечной тканью или клетками15,16.
Для анализа данных одноклеточной геномики использовалось несколько платформ17. Широко используемые платформы для экспрессии одноклеточных генов и профилирования ATAC являются платформами для инкапсуляции множественных микрофлюидных капель17. Поскольку эти платформы используют микрофлюидные камеры, мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к непригодным для использования данным. Таким образом, успех одноклеточных исследований зависит от точного выделения отдельных клеток/ядер.
Представленный здесь протокол использует подход, аналогичный недавним исследованиям с использованием snRNA-seq и snATAC-seq для понимания врожденных пороков сердца 18,19,20,21,22,23. В этой процедуре используется ферментативная диссоциация свежеиссеченной микрорассеченной сердечной ткани с последующей криоконсервацией клеток-предшественников сердца мыши. После размораживания жизнеспособные клетки очищаются и обрабатываются для ядерной изоляции. В данной работе этот протокол был успешно использован для получения данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же ядерного препарата клеток-предшественников сердца мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ клеточного состава развивающегося сердца с помощью комбинированных исследований snRNA-seq и snATAC-seq обеспечивает более глубокое понимание происхождения врожденных пороков сердца26. Несколько исследовательских лабораторий изучили влияние криоконсервации сердечной тк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано ERA-CVD-2019 и ANR-JCJC-2020 SS. Мы благодарим Центр геномики и биоинформатики (GBiM) из лаборатории U 1251 / Marseille Medical Genetics и анонимных рецензентов за предоставленные ценные комментарии.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
