Kerneisolering fra musehjertestamceller til epigenom og genekspressionsprofilering ved enkeltcelleopløsning
Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver cellekerneforberedelse. Efter mikrodissektion og enzymatisk dissociation af hjertevæv i enkeltceller blev stamcellerne frosset efterfulgt af isolering af rene levedygtige celler, som blev anvendt til enkeltkerne-RNA-sekventering og enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventeringsanalyser.
Abstract
Det udviklende hjerte er en kompleks struktur, der indeholder forskellige stamceller styret af komplekse reguleringsmekanismer. Undersøgelsen af genekspression og kromatintilstand af individuelle celler muliggør identifikation af celletype og tilstand. Enkeltcellesekventeringsmetoder har afsløret en række vigtige egenskaber ved hjertestamcelleheterogenitet. Disse metoder er dog generelt begrænset til frisk væv, hvilket begrænser undersøgelser med forskellige eksperimentelle betingelser, da det friske væv skal behandles straks i samme serie for at reducere den tekniske variabilitet. Derfor er der behov for nemme og fleksible procedurer til fremstilling af data fra metoder såsom enkeltkerne-RNA-sekventering (snRNA-seq) og enkeltkerneassay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (snATAC-seq) på dette område. Her præsenterer vi en protokol til hurtigt at isolere kerner til efterfølgende enkeltkerner dual-omics (kombineret snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metode tillader isolering af kerner fra frosne prøver af hjertestamceller og kan kombineres med platforme, der bruger mikrofluidiske kamre.
Introduction
Blandt fødselsdefekter er medfødte hjertefejl (CHD’er) de mest almindelige, der forekommer hos ca. 1% af levendefødte hvert år 1,2. Genetiske mutationer identificeres kun i et mindretal af tilfælde, hvilket indebærer, at andre årsager, såsom abnormiteter i genregulering, er involveret i ætiologien af CHD 2,3. Hjerteudvikling er en kompleks proces med forskellige og interagerende celletyper, hvilket gør identifikationen af kausale ikke-kodende mutationer og deres virkninger på genregulering udfordrende. Organogenese af hjertet begynder med cellulære forfædre, der giver anledning til forskellige undertyper af hjerteceller, herunder myokardiale, fibroblast, epikardiale og endokardieceller 4,5. Enkeltcellegenomik dukker op som en nøglemetode til at studere hjerteudvikling og vurdere virkningen af cellulær heterogenitet i sundhed og sygdom6. Udviklingen af multi-omics-metoder til samtidig måling af forskellige parametre og udvidelsen af beregningsrørledninger har lettet opdagelsen af celletyper og undertyper i det normale og syge hjerte6. Denne artikel beskriver en pålidelig isolationsprotokol med en enkelt kerne for frosne hjertestamceller opnået fra museembryoner, der er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombineret)7,8,9.
ATAC-seq er en robust metode, der muliggør identifikation af regulatoriske åbne kromatinregioner og positionering af nukleosomer10,11. Disse oplysninger bruges til at drage konklusioner om placering, identitet og aktivitet af transskriptionsfaktorer. Aktiviteten af kromatinfaktorer, herunder remodelere, såvel som transkriptionsaktiviteten af RNA-polymerase kan således analyseres, da metoden er meget følsom til måling af kvantitative ændringer i kromatinstruktur 1,2. ATAC-seq giver således en robust og upartisk tilgang til at afdække de mekanismer, der styrer transkriptionsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller er også blevet valideret til måling af kromatintilgængelighed i enkeltceller, hvilket afslører variabilitet i kromatinarkitekturen inden for cellepopulationer10,12,13.
Selv om der er sket betydelige fremskridt inden for enkeltceller i de senere år, er den største vanskelighed behandlingen af de friske prøver, der er nødvendige for at udføre disse forsøg14. For at omgå denne vanskelighed er der udført forskellige tests med det formål at udføre analyser såsom snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevæv eller celler15,16.
Flere platforme er blevet brugt til at analysere enkeltcellegenomiske data17. De udbredte platforme til enkeltcelle genekspression og ATAC-profilering er platforme til multipel mikrofluidisk dråbeindkapsling17. Da disse platforme bruger mikrofluidiske kamre, kan affald eller aggregater tilstoppe systemet, hvilket resulterer i ikke-brugbare data. Succesen af enkeltcelleundersøgelser afhænger således af den nøjagtige isolering af individuelle celler / kerner.
Protokollen, der præsenteres her, bruger en lignende tilgang til nylige undersøgelser ved hjælp af snRNA-seq og snATAC-seq til at forstå medfødte hjertefejl 18,19,20,21,22,23. Denne procedure anvender den enzymatiske dissociation af frisk mikrodissekeret hjertevæv efterfulgt af kryopræservering af musehjertestamceller. Efter optøning renses de levedygtige celler og behandles til nuklear isolering. I dette arbejde blev denne protokol med succes anvendt til at opnå snRNA-seq- og snATAC-seq-data fra det samme nukleare præparat af musehjertestamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen af den cellulære sammensætning af det udviklende hjerte ved kombinerede snRNA-seq- og snATAC-seq-undersøgelser giver en dybere forståelse af oprindelsen af medfødt hjertesygdom26. Flere forskningslaboratorier har undersøgt effekten af kryopræservering af hjertevæv på snRNA-seq27. Udførelse af snRNA-seq og snATAC-seq ved hjælp af frisk mikrodissekeret væv fra musemodeller af menneskelig sygdom kan være logistisk udfordrende, når man sammenligner forske…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af ERA-CVD-2019 og ANR-JCJC-2020 til SS. Vi takker Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) fra U 1251/Marseille Medical Genetics lab og de anonyme korrekturlæsere for at give værdifulde kommentarer.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
