एकल-कोशिका संकल्प पर एपिजीनोम और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं से नाभिक अलगाव
Summary
यहां, हम सेल नाभिक तैयारी का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एकल कोशिकाओं में हृदय ऊतक के सूक्ष्मविच्छेदन और एंजाइमेटिक पृथक्करण के बाद, पूर्वज कोशिकाओं को फ्रीज किया गया था, इसके बाद शुद्ध व्यवहार्य कोशिकाओं का अलगाव किया गया था, जिसका उपयोग एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए किया गया था और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विश्लेषण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक परख का उपयोग किया गया था।
Abstract
विकासशील हृदय एक जटिल संरचना है जिसमें जटिल नियामक तंत्र द्वारा नियंत्रित विभिन्न पूर्वज कोशिकाएं होती हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन स्थिति की परीक्षा सेल प्रकार और स्थिति की पहचान की अनुमति देती है। एकल-कोशिका अनुक्रमण दृष्टिकोण ने कार्डियक पूर्वज कोशिका विषमता की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा किया है। हालांकि, ये विधियां आम तौर पर ताजा ऊतक तक ही सीमित होती हैं, जो विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अध्ययन को सीमित करती हैं, क्योंकि तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ताजा ऊतक को एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए। इसलिए, इस क्षेत्र में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एसएनएटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) और एकल-नाभिक परख जैसे तरीकों से डेटा का उत्पादन करने के लिए आसान और लचीली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। यहां, हम बाद में एकल-नाभिक दोहरे-ओमिक्स (संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक) के लिए नाभिक को तेजी से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के जमे हुए नमूनों से नाभिक के अलगाव की अनुमति देती है और इसे माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करने वाले प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
जन्म दोषों में, जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) सबसे आम हैं, जोहर साल लगभग 1% जीवित जन्मों में होते हैं। आनुवंशिक उत्परिवर्तन केवल अल्पसंख्यक मामलों में पहचाने जाते हैं, जिसका अर्थ है कि अन्य कारण, जैसे जीन विनियमन में असामान्यताएं, सीएचडी 2,3 के एटियलजि में शामिल हैं। कार्डियक विकास विविध और अंतःक्रियात्मक सेल प्रकारों की एक जटिल प्रक्रिया है, जिससे कारण नॉनकोडिंग म्यूटेशन की पहचान और जीन विनियमन पर उनके प्रभाव चुनौतीपूर्ण हो जाते हैं। हृदय का ऑर्गेनोजेनेसिस सेलुलर पूर्वजों के साथ शुरू होता है जो हृदय कोशिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों को जन्म देते हैं, जिनमें मायोकार्डियल, फाइब्रोब्लास्ट, एपिकार्डियल और एंडोकार्डियल कोशिकाएं 4,5 शामिल हैं। एकल-कोशिका जीनोमिक्स हृदय के विकास का अध्ययन करने और स्वास्थ्य और रोग6 में सेलुलर विषमता के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि के रूप में उभर रहा है। विभिन्न मापदंडों के एक साथ माप और कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के विस्तार के लिए बहु-ओमिक्स विधियों के विकास ने सामान्य और रोगग्रस्त हृदय6 में सेल प्रकार और उपप्रकारों की खोज की सुविधा प्रदान की है। यह लेख माउस भ्रूण से प्राप्त जमे हुए कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो डाउनस्ट्रीम एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक (साथ ही एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक संयुक्त) 7,8,9 के साथ संगत है।
एटीएसी-सेक एक मजबूत विधि है जो नियामक खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों की पहचान और न्यूक्लियोसोम10,11 की स्थिति की अनुमति देती है। इस जानकारी का उपयोग प्रतिलेखन कारकों के स्थान, पहचान और गतिविधि के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जाता है। क्रोमैटिन कारकों की गतिविधि, जिसमें रीमॉडेलर्स शामिल हैं, साथ ही आरएनए पोलीमरेज़ की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि, का विश्लेषण किया जा सकता है, इस प्रकार, क्योंकि विधि क्रोमैटिन संरचना 1,2 में मात्रात्मक परिवर्तनों को मापने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। इस प्रकार, एटीएसी-सेक एक विशिष्ट सेल प्रकार में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को नियंत्रित करने वाले तंत्र को उजागर करने के लिए एक मजबूत और निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल को एकल कोशिकाओं में क्रोमैटिन पहुंच को मापने के लिए भी मान्य किया गया है, जो सेल आबादी10,12,13 के भीतर क्रोमैटिन आर्किटेक्चर में परिवर्तनशीलता का खुलासा करता है।
यद्यपि हाल के वर्षों में एकल कोशिकाओं के क्षेत्र में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, मुख्य कठिनाईइन प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक ताजा नमूनों का प्रसंस्करण है। इस कठिनाई को दरकिनार करने के लिए, जमे हुए हृदय ऊतक या कोशिकाओं15,16 के साथ एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक जैसे विश्लेषण करने के उद्देश्य से विभिन्न परीक्षण किए गए हैं।
एकल-कोशिका जीनोमिक्स डेटा17 का विश्लेषण करने के लिए कई प्लेटफार्मों का उपयोग किया गया है। एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति और एटीएसी प्रोफाइलिंग के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्लेटफॉर्म कई माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट एनकैप्सुलेशन17 के लिए प्लेटफॉर्म हैं। चूंकि ये प्लेटफ़ॉर्म माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करते हैं, मलबे या समुच्चय सिस्टम को रोक सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गैर-उपयोग योग्य डेटा होता है। इस प्रकार, एकल-कोशिका अध्ययन की सफलता व्यक्तिगत कोशिकाओं / नाभिक के सटीक अलगाव पर निर्भर करती है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जन्मजात हृदय दोष18,19,20,21,22,23 को समझने के लिए एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक का उपयोग करके हाल के अध्ययनों के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यह प्रक्रिया माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद ताजा सूक्ष्मविच्छेदित हृदय ऊतक के एंजाइमेटिक पृथक्करण का उपयोग करती है। पिघलने के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं को शुद्ध किया जाता है और परमाणु अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है। इस काम में, माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं की एक ही परमाणु तैयारी से एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक डेटा प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक अध्ययनों द्वारा विकासशील हृदय की सेलुलर संरचना का विश्लेषण जन्मजात हृदय रोग26 की उत्पत्ति की गहरी समझ प्रदान करता है। कई शोध प्रयोगशालाओं ने एसएनआरए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को ईआरए-सीवीडी-2019 और एएनआर-जेसीजेसी-2020 द्वारा एसएस द्वारा समर्थित किया गया था। मार्सिले मेडिकल जेनेटिक्स लैब से जीनोमिक्स और जैव सूचना विज्ञान सुविधा (जीबीआईएम) और मूल्यवान टिप्पणियां प्रदान करने के लिए अनाम समीक्षकों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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