Kärnisolering från mushjärtstamceller för epigenom- och genuttrycksprofilering vid encellsupplösning
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver cellkärnberedning. Efter mikrodissektion och enzymatisk dissociation av hjärtvävnad i enstaka celler frystes stamcellerna, följt av isolering av rena livskraftiga celler, som användes för RNA-sekvensering med en kärna och enkärnsanalysen för transposastillgängligt kromatin med sekvenseringsanalyser med hög genomströmning.
Abstract
Det utvecklande hjärtat är en komplex struktur som innehåller olika stamceller som styrs av komplexa regleringsmekanismer. Undersökningen av genuttrycket och kromatintillståndet hos enskilda celler möjliggör identifiering av celltyp och tillstånd. Encellssekvenseringsmetoder har avslöjat ett antal viktiga egenskaper hos hjärtprogenitorcellheterogenitet. Dessa metoder är dock i allmänhet begränsade till färsk vävnad, vilket begränsar studier med olika experimentella betingelser, eftersom den färska vävnaden måste bearbetas omedelbart i samma omgång för att minska den tekniska variationen. Därför behövs enkla och flexibla procedurer för att producera data från metoder som single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) och single-nucleus assay för transposas-tillgängligt kromatin med high-throughput sekvensering (snATAC-seq) inom detta område. Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt isolera kärnor för efterföljande single-nuclei dual-omics (kombinerad snRNA-seq och snATAC-seq). Denna metod möjliggör isolering av kärnor från frysta prover av hjärtstamceller och kan kombineras med plattformar som använder mikrofluidiska kamrar.
Introduction
Bland fosterskador är medfödda hjärtfel (CHD) de vanligaste, som förekommer hos cirka 1% av levande födda varje år 1,2. Genetiska mutationer identifieras endast i en minoritet av fallen, vilket innebär att andra orsaker, såsom avvikelser i genreglering, är involverade i etiologin för CHD 2,3. Hjärtutveckling är en komplex process av olika och interagerande celltyper, vilket gör identifieringen av kausala icke-kodande mutationer och deras effekter på genreglering utmanande. Organogenes av hjärtat börjar med cellulära progenitorer som ger upphov till olika subtyper av hjärtceller, inklusive myokardiala, fibroblast-, epikardiala och endokardiala celler 4,5. Encellsgenomik framträder som en nyckelmetod för att studera hjärtutveckling och bedöma effekterna av cellulär heterogenitet i hälsa och sjukdom6. Utvecklingen av multi-omics-metoder för samtidig mätning av olika parametrar och expansionen av beräkningsrörledningar har underlättat upptäckten av celltyper och subtyper i det normala och sjuka hjärtat6. Denna artikel beskriver ett tillförlitligt isoleringsprotokoll med en kärna för frysta hjärtstamceller erhållna från musembryon som är kompatibla med nedströms snRNA-seq och snATAC-seq (samt snRNA-seq och snATAC-seq kombinerat)7,8,9.
ATAC-seq är en robust metod som möjliggör identifiering av regulatoriska öppna kromatinregioner och positionering av nukleosomer10,11. Denna information används för att dra slutsatser om plats, identitet och aktivitet för transkriptionsfaktorer. Aktiviteten hos kromatinfaktorer, inklusive remodelers, liksom transkriptionsaktiviteten hos RNA-polymeras, kan således analyseras eftersom metoden är mycket känslig för mätning av kvantitativa förändringar i kromatinstruktur 1,2. Således ger ATAC-seq ett robust och opartiskt tillvägagångssätt för att avslöja mekanismerna som styr transkriptionsreglering i en specifik celltyp. ATAC-seq-protokoll har också validerats för att mäta kromatintillgänglighet i enskilda celler, vilket avslöjar variabilitet i kromatinarkitekturen inom cellpopulationer10,12,13.
Även om det har skett anmärkningsvärda framsteg inom området för enskilda celler under de senaste åren, är den största svårigheten bearbetningen av de färska prover som behövs för att utföra dessa experiment14. För att kringgå denna svårighet har olika tester utförts i syfte att genomföra analyser såsom snRNA-seq och snATAC-seq med frusen hjärtvävnad eller celler15,16.
Flera plattformar har använts för att analysera encellsgenomikdata17. De allmänt använda plattformarna för encellsgenuttryck och ATAC-profilering är plattformar för multipel mikrofluidisk droppinkapsling17. Eftersom dessa plattformar använder mikrofluidiska kammare kan skräp eller aggregat täppa till systemet, vilket resulterar i oanvändbara data. Således beror framgången för encellsstudier på noggrann isolering av enskilda celler / kärnor.
Protokollet som presenteras här använder ett liknande tillvägagångssätt som nyligen genomförda studier med snRNA-seq och snATAC-seq för att förstå medfödda hjärtfel 18,19,20,21,22,23. Denna procedur utnyttjar enzymatisk dissociation av nyligen mikrodissekerad hjärtvävnad följt av kryokonservering av mushjärtprogenitorceller. Efter upptining renas de livskraftiga cellerna och bearbetas för kärnisolering. I detta arbete användes detta protokoll framgångsrikt för att erhålla snRNA-seq- och snATAC-seq-data från samma kärnberedning av mushjärtprogenitorceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen av den cellulära sammansättningen av det utvecklande hjärtat genom kombinerade snRNA-seq- och snATAC-seq-studier ger en djupare förståelse för ursprunget till medfödd hjärtsjukdom26. Flera forskningslaboratorier har studerat effekterna av kryokonservering av hjärtvävnad på snRNA-seq27. Att genomföra snRNA-seq och snATAC-seq med hjälp av färsk mikrodissekerad vävnad från musmodeller av mänsklig sjukdom kan vara logistiskt utmanande när man jämför…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av ERA-CVD-2019 och ANR-JCJC-2020 till SS. Vi tackar Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) från U 1251 / Marseille Medical Genetics lab och de anonyma granskarna för att ge värdefulla kommentarer.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
