Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Polymerasekædereaktion og dot-blot-hybridisering til detektion af leptospira i vandprøver

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

I denne undersøgelse blev en dot-blot-applikation designet til at detektere Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver. Denne metode gør det muligt at identificere minimale DNA-mængder, der specifikt er målrettet mod en digoxigenin-mærket sonde, der let detekteres af et anti-digoxigenin-antistof. Denne tilgang er et værdifuldt og tilfredsstillende redskab til screeningsformål.

Abstract

Dot-blot er en enkel, hurtig, følsom og alsidig teknik, der muliggør identifikation af minimale mængder DNA, der specifikt er målrettet mod sondehybridisering i nærvær af bærer-DNA. Det er baseret på overførsel af en kendt mængde DNA til en inert fast støtte, såsom en nylonmembran, ved hjælp af dot-blot-apparatet og uden elektroforetisk adskillelse. Nylonmembraner har fordelen ved høj nukleinsyrebindingskapacitet (400 μg /cm2), høj styrke og er positivt eller neutralt ladede. Den anvendte sonde er et meget specifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser langt mærket med digoxigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden er hybridiseret med mål-DNA'et, detekteres den af et anti-digoxigenin-antistof, hvilket gør det let at detektere det gennem dets emissioner afsløret i en røntgenfilm. Prikkerne med en emission svarer til DNA-fragmenterne af interesse. Denne metode anvender den ikke-isotopiske mærkning af sonden, som kan have en meget lang halveringstid. Ulempen ved denne standard immunetiket er en lavere følsomhed end isotopprober. Ikke desto mindre afbødes det ved kobling af polymerasekædereaktion (PCR) og dot-blot-assays. Denne fremgangsmåde muliggør berigelse af målsekvensen og dens detektion. Derudover kan det bruges som en kvantitativ anvendelse sammenlignet med en seriel fortynding af en velkendt standard. En dot-blot-applikation til påvisning af Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver præsenteres her. Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering for at give bevis for tilstedeværelsen af leptospiral-DNA. Dette er et værdifuldt og tilfredsstillende værktøj til generelle screeningsformål og kan bruges til andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand, hvilket forbedrer forståelsen af økosystemet.

Introduction

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsageligt fra miljømæssige kilder 1,2. Tilstedeværelsen af Leptospira i søer, floder og vandløb er en indikator for leptospiroseoverførsel blandt dyreliv og husdyr og produktionsdyr, der i sidste ende kan komme i kontakt med disse vandområder 1,3,4. Desuden er Leptospira blevet identificeret i ikke-naturlige kilder, herunder spildevand, stillestående vand og postevand 5,6.

Leptospira er en verdensomspændende distribueret bakterie 7,8, og miljøets rolle i dets bevarelse og transmission er blevet anerkendt. Leptospira kan overleve i drikkevand under variabel pH og mineraler9 og i naturlige vandområder1. Det kan også overleve i lange perioder i destilleret vand10, og under konstant pH (7,8) kan det overleve op til 152 dage11. Desuden kan Leptospira interagere i bakteriekonsortier for at overleve barske forhold12,13. Det kan indgå i biofilm i ferskvand med Azospirillum og Sphingomonas og er endda i stand til at vokse og udholde temperaturer på over 49 °C14,15. Det kan også formere sig i vandtæt jord og forblive levedygtigt i op til 379 dage16 og bevare dets evne til at forårsage sygdommen i så længe som et år17,18. Imidlertid er der lidt kendt om økologien inden for vandlegemer og hvordan den fordeles i dem.

Siden opdagelsen var undersøgelsen af slægten Leptospira baseret på serologiske tests. Det var først i det nuværende århundrede, at molekylære teknikker blev mere udbredt i undersøgelsen af denne spirochaete. Dot-blottet er næsten ikke blevet anvendt til identifikation ved hjælp af (1) en isotopsonde baseret på 16S rRNA og på en inter-simple sekvensgentagelse (ISSR)19,20, (2) som et nanoguldbaseret immunoassay for human leptospirose anvendt på urin21 eller (3) som et antistofbaseret assay til kvægurinprøver22. Teknikken faldt i brug, fordi den oprindeligt var baseret på isotopsonder. Det er imidlertid en velkendt teknik, der kombineret med PCR giver forbedrede resultater, og det betragtes som sikkert på grund af brugen af ikke-isotopiske sonder. PCR spiller en afgørende rolle i berigelsen af Leptospira-DNA'et ved at amplificere et specifikt DNA-fragment, der kan findes i spormængder i en prøve. Under hver PCR-cyklus fordobles mængden af det målrettede DNA-fragment i reaktionen. I slutningen af reaktionen er amplikonen blevet ganget med en faktor på mere end en million23. Produktet forstærket af PCR, ofte ikke synligt i agaroseelektroforese, bliver synligt gennem specifik hybridisering med en DIG-mærket sonde i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-teknikken er enkel, robust og velegnet til adskillige prøver, hvilket gør den tilgængelig for laboratorier med begrænsede ressourcer. Det har været anvendt i en række bakterieundersøgelser, herunder (1) orale bakterier27, (2) andre prøvetyper såsom mad og afføring28 og (3) identifikation af udyrkelige bakterier29, ofte i overensstemmelse med andre molekylære teknikker. Blandt fordelene ved dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høj bindingskapacitet, der er i stand til at binde over 200 μg/cm2 nukleinsyrer og op til 400 μg/cm2; (2) Dot-blot-resultater kan fortolkes visuelt uden behov for særligt udstyr, og (3) de kan nemt opbevares i årevis ved stuetemperatur (RT).

Slægten Leptospira er blevet klassificeret i patogene, mellemliggende og saprofytiske klader30,31. Sondringen mellem disse klader kan opnås baseret på specifikke gener såsom lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er til stede i de patogene klader og udviser høj følsomhed i forskellige serologiske og molekylære værktøjer, mens det er fraværende i saprofytarter21. Husholdningsgenet lipL41 er kendt for sit stabile udtryk og anvendes i molekylære teknikker32, mens 16S rRNA-genet bruges til deres klassificering.

Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering. Det gør det muligt at vurdere forskellige punkter og dybder i et vandlegeme for at detektere tilstedeværelsen af leptospiral-DNA og den klade, som den tilhører. Dette værktøj er værdifuldt til både økologiske og generelle screeningsformål og kan også anvendes til at detektere andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand.

Derudover er PCR- og dot-blot-assays teknisk og økonomisk overkommelige for en lang række laboratorier, selv dem, der mangler sofistikeret eller dyrt udstyr. Denne undersøgelse har til formål at anvende den digoxigeninbaserede dot-blot til identifikation af de tre Leptospira-klader i vandprøver indsamlet fra naturlige vandområder.

Bakteriestammer
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi og Wolffi) blev inkluderet i denne undersøgelse. Disse serovarer er en del af samlingen på Institut for Mikrobiologi og Immunologi, Det Veterinærmedicinske Fakultet og Zooteknik, National Autonomous University of Mexico, og de bruges i øjeblikket i mikroagglutinationstesten (MAT).

Alle Leptospira serovarer blev dyrket i EMJH, og deres DNA blev ekstraheret ved hjælp af et kommercielt DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel). En genomisk DNA-blanding af de tolv serovarer blev anvendt som en positiv kontrol for den Leptospira-patogene klade. Som en positiv kontrol af Leptospira-mellemkladen blev genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stammen BUT6 inkluderet, og som en positiv kontrol for Leptospira-saprofytkladen blev genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I også inkluderet.

Negative kontroller bestod af et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterede bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og vand af PCR-kvalitet, der fungerede som ikke-skabelonkontrol.

Vandprøver
Tolv prøvetagningsprøver blev indsamlet ved hjælp af en stratificeret-tilfældig prøveudtagningsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Disse prøver blev opnået på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vandopsamlingsprocedurerne påvirkede ikke nogen truede eller beskyttede arter. Hver prøve blev opsamlet i et sterilt 15 ml mikrocentrifugeglas. For at indsamle prøven blev hvert rør forsigtigt nedsænket i vandet, fyldt på den valgte dybde og derefter forseglet. Prøverne blev opbevaret ved 22 °C og straks transporteret til laboratoriet til forarbejdning.

Hver prøve blev koncentreret ved centrifugering i sterile 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved 8000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Dette trin blev gentaget, indtil alle prøverne var koncentreret i et rør, som derefter blev brugt til DNA-ekstraktion (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Koncentration af vandprøver ved centrifugering. (A) Vandprøvetagningsdamme, og (B) Naturlige vandløb. C) Centrifugeringsbaseret behandling af vandprøver i gentagne trin så mange gange som nødvendigt (n). Klik her for at se en større version af denne figur.

DNA-ekstraktion
Total DNA blev isoleret ved hjælp af et kommercielt genomisk DNA-sæt i henhold til producentens instruktioner (se materialetabel). DNA-ekstraktioner blev elueret i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-koncentrationen blev bestemt af et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm og opbevaret ved 4 °C indtil brug.

PCR-forstærkning
PCR-målene var generne 16S rRNA, lipL41 og lipL32, som identificerer DNA fra slægten Leptospira og tillader sondring mellem de tre klader: patogen, saprofytisk og mellemliggende. Både primere og sondedesign var baseret på de tidligere værker af Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen af hver sonde, primer og forstærket fragment er beskrevet i tabel 1, og deres tilpasning til referencesekvenser er angivet i supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5. PCR-reagenserne og termocykelbetingelserne er beskrevet i protokolafsnittet.

Amplifikationsprodukter blev visualiseret ved elektroforetisk separation på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA; pH 8,3) ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddetektion, som vist i supplerende figur 1. Genomisk DNA opnået fra hver serovar blev anvendt med koncentrationer fra 6 x 106 til 1 x 104 genomiske ækvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaktion baseret på genomstørrelsen af L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for patogen Leptospira, genomstørrelsen af L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen af L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 (4.267, 324 bp) med tiltrædelsesnummer AKWZ00000000.2.

Sondernes følsomhed blev vurderet med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert forsøg. For at vurdere specificiteten af PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen blev DNA fra ikke-relaterede bakterier inkluderet.

Tabel 1: PCR-primere og sonder til forstærkning af produkter til identifikation af patogene, saprofytiske og mellemliggende klader af Leptospira. Klik her for at downloade denne tabel.

Dot-blot hybridiseringsassay
Teknikken kaldes dot-blot, fordi hullerne, hvori DNA-prøven er placeret, har en prikform, og når de suges til at blive fastgjort på plads ved vakuumsugning, får de denne form. Denne teknik blev udviklet af Kafatos et al.40. Teknikken muliggør semikvantificering af Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består af en denaturering med NaOH 0,4 M ved stuetemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, svarende til 6 x 106 til 1 x 104 leptospirer, blottes på en nylonmembran med et 96-brønds dot-blot-apparat. Efter immobilisering bindes DNA'et til membranen ved udsættelse for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde konjugeres med digoxigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrin i 3'-enden (Digoxigenin er et plantesteroid opnået fra Digitalis purpurea, der anvendes som reporter41). Efter den strenge hybridisering af den mærkede DNA-sonde (50 pmol) ved den specifikke temperatur på mål-DNA'et visualiseres DNA-hybriderne ved kemiluminescensreaktionen med anti-digoxigenin alkalisk fosfataseantistof kovalent konjugeret med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges ved udsættelse for en røntgenfilm (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Trin i proceduren for PCR-dot-blot-assayet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af prøver

  1. Hver vandprøve koncentreres i 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved centrifugering ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dette trin gentages så mange gange som nødvendigt for at koncentrere prøven i et volumen på 250 μl.
  2. Brug DNA-ekstraktionssættet i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
  3. Udfør den specifikke PCR i henhold til den dot-blot-sonde, der skal bruges (tabel 1).
    1. Der udføres amplifikationer i PCR-rør med det endelige volumen på 25 μL indeholdende 1 X buffer, 2,5 enheder Taq-polymerase, 1 μM af hver primer, 0,2 mM af hver dNTP, 1,5 mMMgCl2 og 100 ng mål-DNA fra hver vandprøve eller referencegenom-DNA.
    2. Programmér PCR-reaktionen i en termocyklist i henhold til termocykelbetingelserne (tabel 2).
    3. Opbevar reaktionerne ved 4 °C indtil brug.
  4. Anbring 10 μL af hvert PCR-produkt, der skal blottes, i en separat brønd på en plade med 96 huller.
  5. Der tilsættes 40 μL TE til hvert hul og blandes ved pipettering.
    BEMÆRK: 96-brøndpladen kan forsegles og opbevares ved 4 °C natten over. Følg instruktionerne i supplerende fil 6 for at forberede buffere og opløsninger til protokollen. Figur 3 viser trinnene i prøveforberedelsen.

Tabel 2: PCR-termocykelbetingelser for generne 16S, lipL41 og lipL32. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 3
Figur 3: PCR og prøveforberedelse. Ved anvendelse af den specifikke PCR-protokol blev PCR-produktet overført til en mikrotiterplade, og 40 μL TE blev tilsat til hver brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Montering af dot-blot-apparatet

BEMÆRK: Samlingen af dot-blot-apparatet er vist i figur 4. Brug handsker under proceduren til at håndtere alkaliopløsningerne og beskytte nylonmembranen mod forurening.

Figure 4
Figur 4: Montering af dot-blot-apparater. Filterpapiret og nylonmembranen (tidligere fugtet i 10 X SSPE) skal anbringes i den rigtige rækkefølge. Samlingen skal fastgøres med skruerne tæt, inden vakuumet påføres. Hver brønd skal vaskes med TE, og PCR-produkterne lægges i deres respektive brønde. Efter overførsel af PCR-produktet gennem membranen vaskes hver brønd igen med TE og får lov til at tørre. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Skær nylonmembranen (se materialetabellen) og filtrer papiret i ark i størrelsen 12 x 8,5 cm.
  2. Marker membranen med en permanent markør.
  3. Lav et hak med en saks i den ene kant for at angive den rigtige retning. Brug mærket til at huske prøveordren.
  4. Fugt membranen og filterpapiret med 10 X saltvandsnatriumphosphat-EDTA-buffer (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 MNaH2PO4 og 0,02 M EDTA, pH 7,4) (supplerende fil 6). Håndter membranen med en ren, stump pincet.
  5. Saml dot-blot-kammeret; Først filterpapiret, efterfulgt af membranen over plastforseglingen. Fastgør dækslet med skruerne på tværs.
  6. Tilslut kammeret til vakuumet, anbring 100 μL TE i hvert hul, hold vakuumet i 1 min, og stop det derefter.
  7. Vakuummet tændes ved lav hastighed, og 50 μL af hver prøve hældes i det tilsvarende hul på membranen i dot-blot-apparatet (efter den forudbestemte membranfordeling).
    BEMÆRK: Homogeniser hver prøve i hæmagglutination 96 brøndpladen, inden den placeres i dot-blot-kammeret.
  8. Lad vakuummet tørre membranen. Slå om nødvendigt forsigtigt på kammeret for at frigøre boblerne i prøven.
  9. Hvert hul vaskes ved at anbringe 100 μL TE i det med et kontinuerligt vakuum og lade det tørre.
    BEMÆRK: Når overførslen er afsluttet, er det afgørende først at slukke for pumpen og afmontere den. I modsat fald kan det resultere i, at der kommer tilbagesvaling ind i apparatet. DNA behøver ikke et denatureringstrin, hvis der anvendes en positivt ladet nylonmembran, men hvis der anvendes anden inert støtte, kan der være behov for et prædenatureringstrin og alkalibaseret denaturering41.

3. DNA-denaturering og fiksering

BEMÆRK: Figur 5 illustrerer DNA-membranfikseringsproceduren.

Figure 5
Figur 5: DNA-membranfikseringsprocedure. DNA'et denatureres i en alkalisk opløsning. Derefter neutraliseres den med 10 X SSPE, og membranen tørres. Derefter transillumineres membranen. Membranen rehydreres med 2 X SSPE og forhybridiseres natten over. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Inkuber membranen med 0,4 M NaOH i 10 minutter ved stuetemperatur.
  2. Ligevægt membranen med 10 X SSPE i 10 minutter ved stuetemperatur.
  3. Membranen tørres ved 80 °C i 2 timer.
  4. Transilluminer med 120 mJ UV-lys i 3 min. Sørg for, at prøverne vender nedad mod UV-lyskilden. Hvis du bruger en UV-tværbinding, skal du kontrollere, at prøverne vender opad, og gentage dette trin to gange.
    BEMÆRK: Membranen skal være helt tør inden UV-tværbinding. DNA vil blive immobiliseret af en kovalent binding til nylonmembranen. Hver tværbinding tager ca. 18 '' til 1' med en optimal UV-bestrålingsdosis for de fleste hybridiseringseksperimenter på ca. 0,6-0,8 kJ / m2.
    Eksponering for UV-bestråling er skadelig for øjne og hud. Brug passende beskyttelsesudstyr og undgå udsættelse for bar hud.
  5. Vask membranen med 2 X SSPE i 10 min.
  6. Fold forsigtigt membranen og indsæt den i hybridiseringsrøret (brug et 15 ml mikrocentrifugerør).
  7. Der tilsættes 10 ml af præhybridiseringsopløsningen (supplerende fil 6) til glasset, og der inkuberes ved 42 °C natten over. Sørg for, at røret er forseglet korrekt for at forhindre lækage.

4. Hybridisering

  1. Fjern 5 ml af præhybridiseringsopløsningen fra hybridiseringsrøret. For at bruge 5 ml for anden gang skal du opbevare den i et andet rør og opbevare den ved -4 °C.
  2. Der tilsættes 15 μL af den mærkede sonde (tabel 1) til hybridiseringsrøret. Skyl spidsen i opløsningen for at sikre, at den mærkede sonde blev grundigt indpodet i fortyndingen.
    BEMÆRK: DNA-sondens binding er ikke så stærk som antigen-antistofbindingen. Derfor kan ændringer i koncentrationen af sonden eller DNA'et i prøven påvirke intensiteten af den udsendte fluorescens. DNA-sonder er støkiometriske, hvilket betyder, at antallet af sondemolekyler bundet til DNA svarer til antallet af DNA-molekyler, der er til stede i opløsningen. Figur 6 viser sondehybridiseringen.
  3. Der inkuberes ved 42 °C natten over.
  4. Udfør DNA-sonde DIG-mærkning. Følg instruktionerne i tabel 3 for at blande reagenserne, og inkuber derefter blandingen ved 37 °C i 1 time. Derefter tilsættes 80 μL destilleret vand, og halesonden opbevares ved 4 °C.

Figure 6
Figur 6: Sondehybridisering. Volumenet af hybridiseringsbufferen justeres, og den digoxigeninmærkede sonde inkorporeres for at tillade sondens hybridisering natten over. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 3: Reagenser til sonderne mærkning med digoxigenin (DIG). Klik her for at downloade denne tabel.

5. Kemiluminescens (anti-DIG-mærkning)

  1. Vask membranen to gange med 2 X SSPE/0,1% SDS ved stuetemperatur i 10 min.
  2. Inkuber membranen med 5 X SSPE/0,1% SDS ved sondens udglødningstemperatur i 15 min.
    BEMÆRK: I dette trin skal du bruge en beholder med låg for at opretholde temperaturen så længe som muligt. Sørg for ensartet og konstant temperatur over membranen. Det omtrentlige volumen i hver vask er 100 ml af den angivne opløsning.
  3. Membranen vaskes én gang med buffer 1 (supplerende fil 6) ved stuetemperatur i 5 min.
  4. Membranen vaskes én gang med buffer 2 (supplerende fil 6) ved stuetemperatur i 30 min.
  5. Membranen vaskes med buffer 2 og tilsættes anti-digoxigenin-antistoffet (15 μL) (se materialetabellen), og inkuberes derefter i 45 minutter (inkubationstiden kan variere fra 30-60 min). Dette sekundære antistof mærker sonden til påvisning.
    BEMÆRK: Membranen kan opbevares i buffer 2 med anti-digoxigenin-antistoffet natten over ved 4-8 °C. Anti-DIG-mærkning af kemiluminescensprocessen er afbildet i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Anti-DIG-mærkning af kemiluminescensprocessen. De ubundne nukleinsyrer fjernes med bufferopløsninger. Sonden er justeret med mål-DNA'et, og overskuddet fjernes. Membranen blokeres med den blokerende 1 X-buffer, og anti-DIG-antistoffet tilsættes (1:10000). Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Kemiluminescens (substratpåføring)

  1. Membranen vaskes to gange i buffer 1 ved stuetemperatur i 15 min.
  2. Vask én gang i buffer 3 (se supplerende fil 6) ved stuetemperatur i 5 minutter, så membranen dræner det meste af bufferen og efterlader den næsten tør.
  3. Der tilsættes brugsklar CSPD (Dinatrium3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetan-3,2′-(5′-chlor)tricyclo [3.3.1.13,7] decan}-4-yl) phenylphosphat, se materialetabellen), og lad det blive i 5 minutter (med dæmpede fingre homogeniseres CSPD fra den ene side til den anden).
  4. Anbring membranen i en gennemsigtig plastpose (12,5 x 9 cm), der passer til membrandimensionen. Fjern forsigtigt luftbobler, fordel CSPD jævnt og varmeforsegl posen.
  5. Inkuber membranen i et vandbad ved 37 °C i 15 min (det kan være op til 30 min), og sørg for, at membranen med prøver placeres nedad, så den er godt nedsænket. Sørg for, at temperaturen forbliver konstant og godt fordelt over membranen.
  6. Tør plastikposen og fastgør den med scotch tape på en allerede brugt radiografisk film. Dette muliggør nem håndtering under eksponeringsproceduren.
    BEMÆRK: Figur 8 viser substratanvendelsen af kemiluminescensprocessen.

Figure 8
Figur 8: Substratpåføring af kemiluminescensprocessen. Det frie antistof fjernes, og substratet CSPD (1:250) tilsættes membranen. Reaktionen aktiveres ved inkubation ved 37 °C, og membranen er anbragt til registrering af kemiluminescensen i en røntgenfilm. Klik her for at se en større version af denne figur.

7. Kemiluminescens (detektion)

  1. Udfør eksponeringsproceduren. I mørkekammeret skal du forberede udvikler- og fixerløsningerne (se materialetabellen) i de respektive bakker.
  2. I mørke skal du forsigtigt placere den faste membran mod en ny radiografisk film og indsætte den i en radiografisk kassette (se materialetabel).
  3. Registrer eksponeringstidspunktet. Eksponeringstiden kan variere fra 1 min til 30 min eller mere. Start med 5 min og juster tiden i overensstemmelse hermed.
  4. Fugt røntgenfilmen i udvikleropløsningen i 1-3 minutter og skyl forsigtigt med postevand (15-45 s).
  5. Fugt røntgenfilmen i fixeropløsning i 1-3 minutter og skyl forsigtigt med postevand (45 s).
  6. Lad røntgenfilmen lufttørre, og dokumentér analysen i en synlig hvid lysboks.
    BEMÆRK: Undgå at ryste membranen under røntgeneksponeringstiden. Detektionsprocessen er afbildet i figur 9.
  7. Fortsæt til resultatfortolkningen. I den eksponerede røntgenfilm kan prikkerne med emission placeres visuelt og svare til DNA-fragmenterne med sondens hybridisering. Intensiteten af det udsendte signal afhænger af luminescensen og eksponeringens varighed.
    BEMÆRK: Membraner kan opbevares tørret mellem filterpapir i flere måneder ved stuetemperatur.

Figure 9
Figur 9: Påvisning af kemiluminescensprocessen. Under mørke forhold udsættes membranen for en røntgenfilm inde i en røntgenkassette. Dernæst fik det lov til at stå i udstillingstiden, og derefter blev røntgenfilmen udviklet og fastgjort. Endelig blev det lufttørret og fortolket. Klik her for at se en større version af denne figur.

8. Procedure for membrandehybridisering

  1. Vask membranen to gange i 10 minutter med destilleret vand.
  2. Membranen vaskes i 20 minutter med 0,4 M NaOH ved 53 °C (to gange).
  3. Vask to gange membranen i 10 min med 2 X SSPE.
  4. Lad membranen tørre ved stuetemperatur.
  5. Behold membranen, og vend tilbage til trin 3.5 i protokollen.
    BEMÆRK: Membranen kan opbevares i præhybridiseringsbufferen natten over ved 4-8 °C. Den næste dag genstartes med en inkubation ved 42 ° C i 1 time, så præhybridiseringsbufferen kan nå temperaturen. Fortsæt derefter til trin 3.5 i protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere effektiviteten af teknikken blev genomisk DNA fra rene kulturer af hver Leptospira serovar anvendt sammen med den kladespecifikke sonde. Membraner blev fremstillet med 100 ng genomisk DNA pr. PCR-reaktion for hver serovar, efterfulgt af otte genomisk DNA fra ikke-beslægtede bakterier og variable koncentrationer af genomisk DNA fra ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse omfattede positiv, negativ og ikke-skabelonkontrol. Disse ikke-relaterede genomiske DNA viste ikke en affinitet for dot-blot-sonderne. Membranfordelingen og dot-blot-membranerne er vist i supplerende figur 2, supplerende figur 3, supplerende figur 4, supplerende figur 5, supplerende figur 6, supplerende figur 7. Med hensyn til saprofytkladen ved anvendelse af DB_Saproprobe med PCR-produktet på 1059 bp amplificeret med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og PCR-produktet på 517 bp amplificeret med primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD med genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I, det var muligt at påvise mellem 0,05-0,1 ng saprofyt-DNA (supplerende figur 2 og supplerende figur 3). Ligeledes til påvisning af mellemkladen ved anvendelse af DB_Interprobe med PCR-produktet på 1059 bp amplificeret med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og PCR-produktet på 299-301 bp amplificeret med primerne DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD med genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 (supplerende figur 4 og supplerende figur 5), var det muligt at detektere omkring 0,1 ng af det mellemliggende DNA. Tilsvarende gælder det for den patogene klade med DB_16SPathoprobe med PCR-produktet på 1059 bp forstærket med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD eller DBlipL41probe med PCR-produktet på 479 bp amplificeret med primere DB_lipL41REV og DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blanding fra patogene Leptospira serovarer, Det var muligt at påvise DNA-koncentrationer på 0,3-0,6 ng patogent DNA (supplerende figur 6 og supplerende figur 7).

De analyser, der er designet til at identificere de tre klader, kan bruges individuelt for hver klade. I tilfælde af værdifulde og knappe prøver kan der dog fremstilles en enkelt membran med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, som forstærker et produkt på 1058-1069 bp. Dette produkt kan derefter hybridiseres med DB_Interprobe, DB_Saproprobe og DB_16SPatoprobe individuelt med dehybridiseringstrinnet (trin 8) før hver enkelt af dem. Denne fremgangsmåde gør det muligt at identificere alle klader i samme membran.

I feltvandprøverne blev lipL32-sondeprotokollen anvendt. Hver vandprøves DNA blev anvendt i en koncentration på 100 ng pr. PCR-reaktion. Derudover blev der inkluderet en DNA-ekstraktionsprotokolkontrol, som bestod i at stikke 100 ng Leptospira genomisk DNA i en 15 ml destilleret vandprøve. Negative og positive kontroller blev også inkluderet (figur 10).

Tabel 4: Beskrivelse og dybde af vandprøver. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 10
Figur 10: Dot-blot-analyse af hver vandprøve. (A) Membranfordeling og (B) dot-blot-af DB_lipL32probe og produktet (262 bp) af primere DB_lipL32REV og DB_lipL32FWD af markvandsprøverne. Overfladen af dam 3 viser et positivt resultat, og både ekstraktionsprotokolstyringen og de positive kontroller har et intenst signal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vandprøvebeskrivelsen er vist i tabel 4, og dot-blot-membranfordelingen og billedet er vist i figur 9. Prikken A7 viser, at Leptospiral DNA var til stede på overfladen af dam 3. For at bestemme DNA-koncentrationen, der var til stede i dam 3, blev der udført et dot-blot-assay med kendte DNA-koncentrationer af en blanding af Leptospira serovarer og lipL32-sonden (figur 11). Membranen blev fremstillet med genomisk DNA fordelt fra 100 ng til 1 x 10-13 ng i hver prik. Den minimumskoncentration, der utvivlsomt kan påvises, var ca. 0,3 ng, svarende til 6 x 105 GEq i vandprøverne.

Figure 11
Figur 11: Dot-blot-analyse med kendte DNA-koncentrationer af en blanding af Leptospira serovarer og lipL32-sonden. (A) Membranfordeling og (B) dot-blot-af DB_lipL32probe og produktet (262 bp) af primere DB_lipL32REV og DB_lipL32FWD med fortyndinger (1:2) af en genomisk DNA-blanding af patogene Leptospira serovarer. Sondens signal kan let detekteres ned til 3,91 x 10-1 ng Leptospira DNA-blanding. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: PCR-forstærkningsprodukter visualiseret ved elektroforetisk separation. Bane 1. Molekylvægtmarkør 100 bp DNA-stige. Bane 2. PCR baseret på lipL32-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som skabelon; Bane 3. PCR baseret på lipL41-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som skabelon; Bane 4. PCR baseret på 16S rRNA-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som skabelon; Bane 5. PCR baseret på 16S rRNA-genet med primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I DNA som skabelon; Bane 6. PCR baseret på 16S rRNA-genet med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I DNA som skabelon; Bane 7. PCR baseret på 16S rRNA-genet med primere DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD og Leptospira fainei, serovar Hurstbridge stamme BUT6 DNA som skabelon; Bane 8. PCR baseret på 16S rRNA-genet med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og Leptospira fainei, serovar Hurstbridge stamme BUT6 DNA som skabelon. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: (A) Membranfordeling og (B) dot-blottet af DB_Saproprobe og produktet (1059 bp) af primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD af genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: (A) Membranfordeling og (B) dot-blottet af DB_Saproprobe med produktet (517 bp) af primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD af genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: (A) Membranfordeling og (B) dot-blottet af DB_Interprobe med produktet (1059 bp) af primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: (A) Membranfordeling og B) dot-blottet af DB_Interprobe og produktet (299-301 bp) af primere DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD med genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: (A) Membranfordeling og (B) dot-blottet af DB_16SPathoprobe og produktet (1059 bp) af primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD med genomisk DNA-blanding af patogene Leptospira serovarer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: (A) Membranfordeling og (B) dot-blottet af DB_lipL41probe med produktet (479 bp) af primere DB_lipL41REV og DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blanding af patogene Leptospira serovarer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Justering af saprofyte Leptospira-arter med primere og sonde baseret på 16S ribosomal RNA-sekvens. Primere er fremhævet med fed og sort for deres identifikation, med deres retning angivet med sorte pile. Sonden er angivet med fed skrift og fremhævet med gråt, og dens position er markeret med en grå linje. De justerede sekvenser er fremhævet i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvenser er i sort og hvid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Justering af mellemliggende Leptospira-arter med primere og sonde baseret på 16S ribosomal RNA-sekvens. Primere er fremhævet med fed og sort for deres identifikation, med deres retning angivet med sorte pile. Sonden er angivet med fed skrift og fremhævet med gråt, og dens position er markeret med en grå linje. De justerede sekvenser er i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvenser vises i sort og hvid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Tilpasning af patogene Leptospira-arter til primere og sonde baseret på lipL32-gensekvensen. Primere er fremhævet med fed og sort for deres identifikation, med deres retning angivet med sorte pile. Sonden er angivet med fed skrift og fremhævet med gråt, og dens position er markeret med en grå linje. De justerede sekvenser er i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvenser vises i sort og hvid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Tilpasning af patogene Leptospira-arter til primere og sonde baseret på lipL41-gensekvensen. Til deres identifikation er primere med fed skrift og fremhævet i sort, med deres retning angivet med sorte pile. Sonden er angivet med fed skrift og fremhævet med mørkegrå, og dens position er markeret med en grå linje. De justerede sekvenser er i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvenser er i sort og hvid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: Tilpasning af Leptospira-arter med primere rettet mod 16S ribosomal RNA-sekvens og sonderne for saprofyt, mellemliggende og patogene arter. Til deres identifikation er primere angivet med fed skrift og fremhævet med sort, med deres retning markeret med sorte pile. Sonderne er angivet med fed skrift og fremhævet med gråt, og deres position er repræsenteret af grå linjer. De justerede sekvenser er lysegrå, og de ikke-tilsvarende sekvenser er i hvid og sort. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: Buffere og opløsninger til dot-blot-assayet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske trin i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokering af de frie bindingssteder på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellem sonden og målfragmentet under udglødningsbetingelser, (4) fjernelse af den uhybridiserede sonde og (5) påvisning af reportermolekylet41.

PCR-Dot-blot har visse begrænsninger, såsom teknikken giver ikke information om størrelsen af det hybridiserede fragment37, det kræver de-hybridisering af en enkelt membran før rehybridisering med en anden eller tredje sonde, og det kræver betydelig tid og kræfter til det endelige resultat.

Denne teknik har vist overensstemmelse med andre molekylære teknikker42,43 og dens anvendelser. Reverse dot-blot, nanogold dot-blot21 og dot-ELISA42 er blevet anvendt til påvisning af specifikke gener i organismer som Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 og Mycobacterium tuberculosis48,49 baseret på 16S rRNA29,43 og til påvisning af DNA eller RNA af planter Virus41. Detektionsgrænsen (LOD), defineret som den laveste koncentration af mikroorganismen, der konsekvent og pålideligt kan måles ved denne teknik50, varierede fra 100 pg (5 x 104 bakterier) for H. pylori47 til en enkelt celle af B. burgdorferi i kliniske prøver45 og en fg, som er mindre end en celle, af M. tuberculosis48,49.

Et værdifuldt aspekt ved denne kombinerede metode er dens evne til at udvide detektionsgrænsen med én rækkefølge og overvinde falsk negative resultater på grund af to prøvebetingelser, der kan føre til inkonsekvente resultater: 1) prøver med utilstrækkeligt DNA eller 2) prøvekontaminering, der muliggør 100 % påvisning af positive prøver 25,45,47,48,49. PCR-Dot-blot har kapacitet til at detektere lavere mængder amplificerede produkter end dem, der kan påvises i agarosegelelektroforese, og det undgår kontaminering som følge af andet amplifikationstrin, som i indlejret og semi-indlejret PCR. Disse fordele er særligt kritiske, når man arbejder med miljøprøver, der indeholder en lav bakteriel ladning, som kan indeholde en bredere vifte af inhibitorer og DNA fra ikke-relaterede kilder, der kan forstyrre de molekylære teknikker.

Tidligere arbejde tyder på, at leptospirer kan identificeres ved DNA-sonder mærket med fotobiotin, der når en LOD på 5 pg (5 x 103 leptospirer)51. DIG-mærkede sonder detekterer 0,1-1 pg (102 leptospirer), mens 32P-mærkede sonder registrerer 1-5 pg (750 til 1000 leptospirer)51, og biotinmærkede sonder registrerer 5 pg (2500 leptospirer)52. Endvidere nåede 32P-mærkede sonder for saprofyt Leptospira en LOD på 1,95 ng og for patogen Leptospira, 3,9 ng53. I denne undersøgelse blev lignende LOD'er etableret for de tre klader. LOD for patogene arter var ca. 0,3 ng genomisk DNA (6-8 x 104 GEq) (figur 11), og for saprofyten og mellemarterne var den nede på 0,1 ng (2 x 104 GEq). Især blev tidligere undersøgelser udført ved hjælp af rene Leptospira-kulturer 51 og sera fra eksperimentelt inficerede gyldne hamstere med det formål at detektere patogen Leptospira54,55 og anvende DNA-hybridisering med 32P mærket som et værktøj til identifikation og klassificering af Leptospira56. Disse sonder udviser høj specificitet og viser ikke krydshybridisering med ikke-homologt DNA fra andre mikroorganismer 19,51,54,55,56,57 og kan skelne selv mellem nært beslægtede arter som Leptonema57. Ligeledes blev der i dette arbejde ikke observeret hybridisering med ikke-homologt DNA. Selvom ikke-isotopiske sonder ikke er så følsomme som isotopsonder58 eller andre teknikker43, kan det forventes, at PCR-Dot-blot-kombinationen tillader op til ti gange øget følsomhed sammenlignet med andre PCR-baserede teknikker, som det ses ved påvisning af Leishmania og bovin herpesvirus 4 (BHV4)24,26.

På den anden side er dot-blot-analysen til identifikation af Leptospira hyppigere blevet anvendt med antistoffer og på det seneste med monoklonale antistoffer som et alternativ til diagnosticering af mennesker og dyr i urinprøver 59,60,61,62. I disse undersøgelser behandles prøven direkte på membranen uden forudgående trin, og antistoffer er målrettet mod specifikke Leptospira-overfladeproteiner forbundet med patogenese. Mab-Dot-blot ELISA viser for eksempel høj følsomhed og specificitet og detekterer så lidt som 1 μg bakterielt homogenat62. Resultaterne opnået fra Mab-Dot-blot-analysen kan sammenlignes med PCR-assays, som typisk har LOD omkring 103 leptospirer / ml urin eller 9,3 ng Leptospira-homogenat 63. Mængden af genomisk DNA, der kan amplificeres ved PCR, er 100 celler (500 fg DNA)61. Disse tidligere undersøgelser brugte rene kulturer eller kliniske prøver uden berigelsesprocedurer og var orienteret mod bedre diagnose. Da inficerede rotter kan udskille så mange som 107 leptospirer / ml urin64, og hunde kan udskille mellem 102 til 106 leptospirer / ml urin65, der tjener som kilder til forurening af vandområder, kræver miljøprøverne leptospiralberigelse. In vitro PCR-amplifikation af det målrettede DNA før blotting muliggør en forbedring af procedurefølsomheden på op til ti gange52,55. Normalt ville produktet forstærket af en slutpunkts-PCR ikke visualiseres i en agarosegelelektroforese; ikke desto mindre bliver det tydeligt gennem den specifikke hybridisering af den DIG-mærkede sonde i dot-blot.

Mens meget forskning om leptospira og leptospirose har fokuseret på sygdomsdiagnose, er der lidt kendt om deres økologi i vandområder og deres fordeling i dem. PCR-Dot-blot-teknikken supplerer værktøjskassen til undersøgelse af Leptospira og leptospirose, hvilket giver fordelen ved screening af et stort antal prøver og fremskyndelse af resultater og fortolkning. PCR-Dot-blot er en relativt billig, enkel og ikke-radioaktiv teknik, der kan rumme flere sonder på en enkelt membran. Desuden eliminerer det behovet for sofistikeret udstyr og komplekse arbejdsgange, hvilket kan være udfordrende i ressourcebegrænsede indstillinger.

Virkningen af denne undersøgelse ligger i dens fremtidige anvendelse til at studere store vandmasser på forskellige dybder samt andre økologiske nicher og prøvetyper, herunder jord, stillestående vand, afføring, blod og væv.

Afslutningsvis demonstrerer dette arbejde anvendelsen af PCR-Dot-blot-teknikken baseret på digoxigeninmærkning af DNA-sonder til identifikation af de tre klader inden for slægten Leptospira. Denne metode strømliner identifikationsprocessen ved at reducere den til et enkelt forstærkningstrin og giver mulighed for enten tre samtidige hybridiseringer eller tre på hinanden følgende hybridiseringer ved hjælp af en enkelt membran. De detektionsgrænser, der opnås med denne teknik, svarer til dem, der opnås med radioaktive sonder53, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til at identificere Leptospira i vandprøver fra naturlige kilder. Derfor giver denne teknik øget følsomhed og giver nøjagtige og konsistente resultater ved evaluering af prøver med minimale mængder bakterielt DNA. Det tjener som en alternativ tilgang til undersøgelse af dynamikken i Leptospira i vandområder og kan hjælpe med vurdering og overvågning af bredere miljøprøver, hvilket hjælper med gennemførelsen af forebyggende foranstaltninger mod overførsel af denne mikroorganisme.

I tilfælde af problemer med teknikken skal du overveje følgende fejlfindingshøjdepunkter: (1) Hvis prikkerne har uregelmæssige former, skal du kontrollere, at vakuumsystemet er sikkert lukket på tværs og derefter gentage overførslen. (2) Hvis hybridiseringsrøret går i stykker under proceduren natten over, hvilket får membranen til at miste hybridiseringsbufferen, henvises til afsnittet "De-hybridiseringsprocedure" og genstart processen. (3) Hvis der ikke er synlige prikker, må membranen ikke kasseres; fortsæt til afsnittet "De-hybridiseringsprocedure" for at gentage hybridiseringstrinnene. (3) Hvis der opdages ujævne hvide områder på den udviklede røntgenfilm, skal du sørge for, at der ikke fanges luftbobler under poseforseglingsprocessen. (5) Hvis der observeres ujævne sorte områder på den udviklede røntgenfilm, skal det bekræftes, at CSPD er blevet grundigt fordelt med dæmpede fingre. (6) Hvis røntgenfilmen viser skygger af prikkerne, skal du sørge for, at filmen ikke flyttes under eksponeringstiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi står i gæld til Leptospira-samlingen ved Institut for Mikrobiologi og Immunologi, Det Veterinærmedicinske Fakultet og Zooteknik, Mexicos Nationale Autonome Universitet. Vi er taknemmelige for den generøse donation af referencestammerne fra Leptospira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I til Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi takker Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-koordinatoren, og personalet for deres logistiske støtte. EDT var under Terminal Project-programmet for bachelorstuderende på Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi anerkender den Biorender.com software til oprettelse af figur 1 og 3 til 9.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 208 Leptospira Dot-blot PCR Digoxigenin
Polymerasekædereaktion og dot-blot-hybridisering til detektion af <i>leptospira</i> i vandprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgadillo-Tellez, E.,… More

Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter