Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Polymerasekettingreactie en dot-blot-hybridisatie voor leptospira-detectie in watermonsters

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

In deze studie werd een dot-blot-applicatie ontworpen om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters. Deze methode maakt de identificatie mogelijk van minimale DNA-hoeveelheden die specifiek het doelwit zijn van een digoxigenine-gelabelde sonde, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam. Deze aanpak is een waardevol en bevredigend instrument voor screeningsdoeleinden.

Abstract

De dot-blot is een eenvoudige, snelle, gevoelige en veelzijdige techniek die de identificatie mogelijk maakt van minimale hoeveelheden DNA die specifiek het doelwit zijn van sondehybridisatie in aanwezigheid van drager-DNA. Het is gebaseerd op de overdracht van een bekende hoeveelheid DNA op een inerte vaste drager, zoals een nylon membraan, met behulp van het dot-blot-apparaat en zonder elektroforetische scheiding. Nylonmembranen hebben het voordeel van een hoog nucleïnezuurbindend vermogen (400 μg/cm2), een hoge sterkte en zijn positief of neutraal geladen. De gebruikte sonde is een zeer specifiek ssDNA-fragment van 18 tot 20 basen dat lang is gelabeld met digoxigenine (DIG). De sonde zal zich conjugeren met het Leptospira-DNA . Zodra de sonde is gehybridiseerd met het doel-DNA, wordt deze gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam, waardoor deze gemakkelijk kan worden gedetecteerd door de emissies die worden onthuld in een röntgenfilm. De stippen met een emissie komen overeen met de DNA-fragmenten die van belang zijn. Deze methode maakt gebruik van de niet-isotopische etikettering van de sonde, die een zeer lange halfwaardetijd kan hebben. Het nadeel van dit standaard immunolabel is een lagere gevoeligheid dan isotopensondes. Desalniettemin wordt het beperkt door polymerasekettingreactie (PCR) en dot-blot-assays te koppelen. Deze aanpak maakt de verrijking van de doelsequentie en de detectie ervan mogelijk. Bovendien kan het worden gebruikt als een kwantitatieve toepassing in vergelijking met een seriële verdunning van een bekende standaard. Een dot-blot-toepassing om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters wordt hier gepresenteerd. Deze methodologie kan worden toegepast op grote hoeveelheden water nadat ze zijn geconcentreerd door centrifugatie om bewijs te leveren van de aanwezigheid van Leptospiral DNA. Dit is een waardevol en bevredigend hulpmiddel voor algemene screeningsdoeleinden en kan worden gebruikt voor andere niet-kweekbare bacteriën die in water aanwezig kunnen zijn, waardoor het begrip van het ecosysteem wordt verbeterd.

Introduction

Leptospirose bij de mens is voornamelijk afkomstig van milieubronnen 1,2. De aanwezigheid van Leptospira in meren, rivieren en beken is een indicator van de overdracht van leptospirose onder dieren in het wild en huisdieren en productiedieren die uiteindelijk in contact kunnen komen met deze watermassa's 1,3,4. Bovendien is Leptospira geïdentificeerd in niet-natuurlijke bronnen, waaronder rioolwater, stilstaand en kraanwater 5,6.

Leptospira is een wereldwijd verspreide bacterie 7,8, en de rol van het milieu bij het behoud en de overdracht ervan is algemeen erkend. Leptospira kan overleven in drinkwater met een variabele pH en mineralen9, en in natuurlijke waterlichamen1. Het kan ook lange tijd overleven in gedestilleerd water10, en onder een constante pH (7,8) kan het tot 152 dagen overleven11. Bovendien kan Leptospira interageren in bacteriële consortia om barre omstandigheden te overleven12,13. Het kan deel uitmaken van biofilms in zoet water met Azospirillum en Sphingomonas en is zelfs in staat om te groeien en temperaturen van meer dan 49 °C14,15 te doorstaan. Het kan zich ook vermenigvuldigen in drassige grond en tot 379 dagen levensvatbaar blijven16, waardoor het vermogen om de ziekte te veroorzaken tot een jaar lang behouden blijft17,18. Er is echter weinig bekend over de ecologie in waterlichamen en hoe deze daarin is verdeeld.

Sinds de ontdekking was de studie van het geslacht Leptospira gebaseerd op serologische tests. Pas in de huidige eeuw kwamen moleculaire technieken steeds vaker voor in de studie van deze spirochaete. De dot-blot is nauwelijks gebruikt voor zijn identificatie met behulp van (1) een isotopische sonde op basis van het 16S rRNA en op een inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) als een op nanogoud gebaseerde immunoassay voor menselijke leptospirose toegepast op urine21, of (3) als een op antilichamen gebaseerde test voor runderurinemonsters22. De techniek raakte in onbruik omdat deze oorspronkelijk gebaseerd was op isotopische sondes. Het is echter een bekende techniek die, in combinatie met PCR, verbeterde resultaten oplevert en als veilig wordt beschouwd vanwege het gebruik van niet-isotopische sondes. PCR speelt een cruciale rol bij de verrijking van het Leptospira-DNA door een specifiek DNA-fragment te amplificeren dat in sporenhoeveelheden in een monster kan worden aangetroffen. Tijdens elke PCR-cyclus wordt de hoeveelheid van het beoogde DNA-fragment in de reactie verdubbeld. Aan het einde van de reactie is het amplicon vermenigvuldigd met een factor van meer dan een miljoen23. Het door PCR geamplificeerde product, vaak niet zichtbaar bij agarose-elektroforese, wordt zichtbaar door specifieke hybridisatie met een DIG-gelabelde sonde in de dot-blot 24,25,26.

De dot-blot-techniek is eenvoudig, robuust en geschikt voor tal van monsters, waardoor het toegankelijk is voor laboratoria met beperkte middelen. Het is gebruikt in een verscheidenheid aan bacteriestudies, waaronder (1) orale bacteriën27, (2) andere soorten monsters zoals voedsel en ontlasting28, en (3) de identificatie van niet-kweekbare bacteriën29, vaak in overeenstemming met andere moleculaire technieken. Een van de voordelen van de dot-blot-techniek zijn: (1) Het membraan heeft een hoge bindingscapaciteit, in staat om meer dan 200 μg/cm2 nucleïnezuren en tot 400 μg/cm2 te binden; (2) Dot-blot-resultaten kunnen visueel worden geïnterpreteerd zonder dat er speciale apparatuur nodig is, en (3) ze kunnen gemakkelijk jarenlang bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.

Het geslacht Leptospira is ingedeeld in pathogene, intermediaire en saprofytische clades30,31. Het onderscheid tussen deze clades kan worden bereikt op basis van specifieke genen zoals lipL41, lipL32 en het 16S rRNA. LipL32 is aanwezig in de pathogene clades en vertoont een hoge gevoeligheid in verschillende serologische en moleculaire instrumenten, terwijl het afwezig is in saprofytensoorten21. Het huishoudgen lipL41 staat bekend om zijn stabiele expressie en wordt gebruikt in moleculaire technieken32, terwijl het 16S rRNA-gen wordt gebruikt voor hun classificatie.

Deze methodologie kan worden toegepast op grote hoeveelheden water nadat ze zijn geconcentreerd door centrifugeren. Het maakt het mogelijk om verschillende punten en diepten in een waterlichaam te beoordelen om de aanwezigheid van leptospiraalvormig DNA en de clade waartoe het behoort te detecteren. Deze tool is waardevol voor zowel ecologische als algemene screeningsdoeleinden en kan ook worden gebruikt om andere niet-kweekbare bacteriën te detecteren die in water aanwezig kunnen zijn.

Bovendien zijn PCR- en dot-blot-assays technisch en economisch betaalbaar voor een breed scala aan laboratoria, zelfs voor laboratoria die niet over geavanceerde of dure apparatuur beschikken. Deze studie heeft tot doel de op digoxigenine gebaseerde dot-blot toe te passen voor de identificatie van de drie Leptospira-clades in watermonsters die zijn verzameld uit natuurlijke waterlichamen.

Bacteriestammen
Twaalf Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi en Wolffi) werden in deze studie opgenomen. Deze serovars maken deel uit van de collectie van de afdeling Microbiologie en Immunologie, Faculteit Diergeneeskunde en Zoötechniek, Nationale Autonome Universiteit van Mexico, en ze worden momenteel gebruikt in de microagglutinatietest (MAT).

Alle Leptospira-serovars werden gekweekt in EMJH en hun DNA werd geëxtraheerd met behulp van een commerciële DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel). Een genomische DNA-mix van de twaalf serovars werd gebruikt als positieve controle voor de pathogene clade van Leptospira . Als positieve controle van de Leptospira-intermediaire clade werd ook genoom-DNA van Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 opgenomen, en als positieve controle voor de Leptospira-saprofytenclade werd ook genomisch DNA van Leptospira biflexa serovar Patoc-stam Patoc I opgenomen.

Negatieve controles bestonden uit een leeg plasmide, DNA van niet-verwante bacteriën (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii en Escherichia coli), en water van PCR-kwaliteit, dat diende als niet-sjablooncontrole.

Monsters van water
Twaalf proefmonsters werden verzameld met behulp van een gestratificeerde-lukrake bemonsteringsmethode van het Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Deze monsters werden verkregen op drie diepten: oppervlakkig, 10 en 30 cm (figuur 1A, B). De procedures voor het verzamelen van water hadden geen invloed op bedreigde of beschermde diersoorten. Elk monster werd verzameld in een steriele microcentrifugebuis van 15 ml. Om het monster te verzamelen, werd elke buis voorzichtig ondergedompeld in het water, op de geselecteerde diepte gevuld en vervolgens verzegeld. De monsters werden op 22 °C gehouden en onmiddellijk naar het laboratorium vervoerd voor verwerking.

Elk monster werd geconcentreerd door centrifugatie in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml bij 8000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Deze stap werd herhaald totdat alle monsters waren geconcentreerd in één buis, die vervolgens werd gebruikt voor DNA-extractie (Figuur 1C).

Figure 1
Figuur 1: Concentratie van watermonsters door centrifugatie. (A) Waterbemonsteringsvijvers en (B) Natuurlijke beken. (C) Verwerking van watermonsters op basis van centrifugatie in herhaalde stappen, zo vaak als nodig is (n). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNA-extractie
Totaal DNA werd geïsoleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare genomische DNA-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). DNA-extracties werden geëlueerd in 20 μL elutiebuffer en de DNA-concentratie werd bepaald door een UV-spectrofotometer bij 260-280 nm en bewaard bij 4 °C tot gebruik.

PCR-amplificatie
De PCR-doelen waren de 16S rRNA-, lipL41- en lipL32-genen, die DNA van het geslacht Leptospira identificeren en het onderscheid tussen de drie clades mogelijk maken: pathogeen, saprofytische en intermediairen. Zowel de primers als de sondeontwerpen waren gebaseerd op de eerdere werken van Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., en Branger et al.33,34,35,36,37. De volgorde van elke sonde, primer en geamplificeerd fragment wordt beschreven in tabel 1 en hun uitlijning met referentiesequenties wordt gegeven in aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2, aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5. De PCR-reagentia en thermocyclusvoorwaarden worden beschreven in het protocolgedeelte.

Amplificatieproducten werden gevisualiseerd door elektroforetische scheiding op een 1% agarosegel in TAE (40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA; pH 8,3), bij 60 V gedurende 45 minuten met ethidiumbromidedetectie, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Genoom-DNA verkregen van elke serovar werd gebruikt met concentraties variërend van 6 x 106 tot 1 x 104 genomische equivalente kopieën (GEq) in elke PCR-reactie, gebaseerd op de genoomgrootte van L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 voor pathogene Leptospira, de genoomgrootte van L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 voor saprofytische Leptospira, en de genoomgrootte van L. fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 (4, 267, 324 bp) met toetredingsnummer AKWZ00000000.2.

De gevoeligheid van de sondes werd beoordeeld met DNA van elke pathogene serovar, L. biflexa serovar Patoc stam Patoc I en L. fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 in elk experiment. Om de specificiteit van de PCR- en dot-blot-hybridisatietest te beoordelen, werd DNA van niet-verwante bacteriën opgenomen.

Tabel 1: PCR-primers en -sondes om producten te amplificeren voor het identificeren van de pathogene, saprofyt- en intermediaire clades van Leptospira. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Dot-blot hybridisatie-test
De techniek wordt dot-blot genoemd omdat de gaten waarin het DNA-monster wordt geplaatst een puntvorm hebben, en wanneer ze worden opgezogen om op hun plaats te worden gefixeerd door vacuümzuiging, krijgen ze deze vorm. Deze techniek is ontwikkeld door Kafatos et al.40. De techniek maakt de semi-kwantificering van Leptospira in elk PCR-positief monster mogelijk. Het protocol bestaat uit een denaturatie met NaOH 0,4 M bij kamertemperatuur, monsters met Leptospira-DNA van 30 ng tot 0,05 ng, overeenkomend met 6 x 106 tot 1 x 104 leptospiren, worden gedept op een nylon membraan met een dot-blot-apparaat met 96 putjes. Na immobilisatie wordt het DNA aan het membraan gebonden door blootstelling aan 120 mJ UV-licht. Elke DNA-sonde wordt geconjugeerd met digoxigenine-11 dUTP door een terminale transferasekatalysestap aan het 3'-uiteinde (Digoxigenine is een plantaardige steroïde verkregen uit Digitalis purpurea, gebruikt als verslaggever41). Na de strikte hybridisatie van de gelabelde DNA-sonde (50 pmol) bij de specifieke temperatuur op het doel-DNA, worden de DNA-hybriden gevisualiseerd door de chemiluminescentiereactie met het anti-digoxigenine alkalische fosfatase-antilichaam dat covalent is geconjugeerd met zijn substraat CSPD. De luminescentie wordt vastgelegd door blootstelling aan een röntgenfilm (figuur 2).

Figure 2
Figuur 2: Stappen van de procedure voor de PCR-dot-blot-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

  1. Concentreer elk watermonster in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml door centrifugatie bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stap, zo vaak als nodig is, om het monster te concentreren tot een volume van 250 μl.
  2. Gebruik de DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
  3. Voer de specifieke PCR uit volgens de dot-blot-sonde die zal worden gebruikt (tabel 1).
    1. Voer de amplificaties uit in PCR-buisjes met het uiteindelijke volume van 25 μL met 1 X buffer, 2,5 eenheden Taq-polymerase, 1 μM van elke primer, 0,2 mM van elke dNTP, 1,5 mM MgCl2 en 100 ng doel-DNA van elk watermonster of referentiegenoom-DNA.
    2. Programmeer de PCR-reactie in een thermocycler volgens de thermocyclusomstandigheden (tabel 2).
    3. Bewaar de reacties bij 4 °C tot gebruik.
  4. Plaats 10 μl van elk te deppen PCR-product in een apart putje van een plaat met 96 putjes.
  5. Voeg 40 μL TE toe aan elk putje en meng door te pipetteren.
    OPMERKING: De plaat met 96 putjes kan worden verzegeld en een nacht bij 4 °C worden bewaard. Volg de instructies in aanvullend bestand 6 om buffers en oplossingen voor het protocol voor te bereiden. Figuur 3 geeft de stappen van de monstervoorbereiding weer.

Tabel 2: PCR-thermocycluscondities voor de 16S-, lipL41- en lipL32-genen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 3
Figuur 3: PCR en monstervoorbereiding. Door het specifieke PCR-protocol toe te passen, werd het PCR-product overgebracht naar een microtiterplaat en werd 40 μL TE aan elk putje toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Montage van het dot-blot-apparaat

OPMERKING: De montage van het dot-blot-apparaat wordt weergegeven in afbeelding 4. Draag tijdens de procedure handschoenen om de alkalische oplossingen te hanteren en het nylonmembraan te beschermen tegen verontreiniging.

Figure 4
Figuur 4: Montage van dot-blot-apparaten. Het filtreerpapier en het nylon membraan (eerder bevochtigd in 10 X SSPE) moeten in de juiste volgorde worden gerangschikt. Het geheel moet stevig met de schroeven worden vastgezet voordat het vacuüm wordt aangebracht. Elke put moet worden gewassen met TE en de PCR-producten worden in hun respectievelijke putten geladen. Na het overbrengen van het PCR-product door het membraan, wordt elk putje opnieuw gewassen met TE en gedroogd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Snijd het nylonmembraan (zie Materiaaltabel) en filtreerpapier in vellen van 12 x 8,5 cm.
  2. Markeer het membraan met een permanente marker.
  3. Maak een inkeping met een schaar aan één rand om de juiste oriëntatie aan te geven. Gebruik de markering om de monsterbestelling te onthouden.
  4. Bevochtig het membraan en het filtreerpapier met 10 x zoutoplossing-natriumfosfaat-EDTA-buffer (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 en 0,02 M EDTA, pH 7,4) (aanvullend bestand 6). Pak het membraan vast met een schoon, stomp pincet.
  5. Monteer de dot-blot-kamer; Eerst het filtreerpapier, gevolgd door het membraan over de plastic afdichting. Zet het deksel kruislings vast met de schroeven.
  6. Sluit de kamer aan op het vacuüm, plaats 100 μL TE in elk putje, houd het vacuüm 1 minuut vast en stop het dan.
  7. Schakel het vacuüm met lage snelheid in en laad 50 μL van elk monster in het overeenkomstige putje op het membraan van het dot-blot-apparaat (volgens de vooraf bepaalde membraanverdeling).
    OPMERKING: Homogeniseer elk monster in de hemagglutinatieplaat met 96 putjes voordat u het in de dot-blot-kamer plaatst.
  8. Laat het vacuüm het membraan drogen. Sla indien nodig voorzichtig op de kamer om de luchtbellen in het monster vrij te maken.
  9. Was elk putje door er 100 μL TE in te doen met een continu vacuüm en het te laten drogen.
    NOTITIE: Na het voltooien van de overdracht is het van cruciaal belang om eerst de pomp uit te schakelen en los te koppelen. Als u dit niet doet, kan er reflux in het apparaat komen. DNA heeft geen denaturatiestap nodig als een positief geladen nylonmembraan wordt gebruikt, maar als er een andere inerte drager wordt gebruikt, kan een pre-denaturatiestap en denaturatie op basis van alkali nodig zijn41.

3. DNA-denaturatie en -fixatie

OPMERKING: Figuur 5 illustreert de procedure voor het fixeren van het DNA-membraan.

Figure 5
Figuur 5: DNA-membraan fixatie procedure. Het DNA wordt gedenatureerd in een alkalische oplossing. Vervolgens wordt het geneutraliseerd met 10 X SSPE en wordt het membraan gedroogd. Vervolgens wordt het membraan getransillumineerd. Het membraan wordt gerehydrateerd met 2 X SSPE en 's nachts geprehybridiseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Incubeer het membraan met 0,4 M NaOH gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Breng het membraan in evenwicht met 10 X SSPE gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Droog het membraan gedurende 2 uur bij 80 °C.
  4. Transillumineer met 120 mJ UV-licht gedurende 3 min. Zorg ervoor dat de monsters met de voorkant naar beneden in de richting van de UV-lichtbron zijn gericht. Als u een UV-crosslinker gebruikt, controleer dan of de monsters naar boven wijzen en herhaal deze stap twee keer.
    OPMERKING: Het membraan moet volledig droog zijn voordat UV-verknopingsapparatuur wordt gebruikt. DNA wordt geïmmobiliseerd door een covalente binding aan het nylonmembraan. Elke verknoping duurt ongeveer 18'' tot 1' met een optimale UV-stralingsdosis, voor de meeste hybridisatie-experimenten, van ongeveer 0,6-0,8 kJ/m2.
    Blootstelling aan UV-straling is schadelijk voor de ogen en de huid. Draag geschikte beschermende uitrusting en vermijd blootstelling aan de blote huid.
  5. Was het membraan met 2 X SSPE gedurende 10 min.
  6. Vouw het membraan voorzichtig dicht en steek het in de hybridisatiebuis (gebruik een microcentrifugebuis van 15 ml).
  7. Voeg 10 ml van de prehybridisatieoplossing (aanvullend bestand 6) toe aan de buis en incubeer gedurende een nacht bij 42 °C. Zorg ervoor dat de buis goed is afgedicht om lekkage te voorkomen.

4. Hybridisatie

  1. Verwijder 5 ml van de pre-hybridisatieoplossing uit de hybridisatiebuis. Om de 5 ml voor een tweede keer te gebruiken, bewaart u deze in een andere tube en bewaart u deze bij -4 °C.
  2. Voeg 15 μL van de gelabelde sonde (tabel 1) toe aan de hybridisatiebuis. Spoel de punt in de oplossing om ervoor te zorgen dat de gelabelde sonde grondig in de verdunning is gedruppeld.
    OPMERKING: De binding van de DNA-sonde is niet zo sterk als de antigeen-antilichaambinding. Daarom kunnen veranderingen in de concentratie van de sonde of het DNA in het monster de intensiteit van de uitgezonden fluorescentie beïnvloeden. DNA-sondes zijn stoichiometrisch, wat betekent dat het aantal sondemoleculen dat aan DNA is gebonden, gelijk is aan het aantal DNA-moleculen dat in de oplossing aanwezig is. Figuur 6 toont de hybridisatie van de sonde.
  3. 's Nachts uitbroeden bij 42 °C.
  4. Voer DNA-sonde DIG-etikettering uit. Volg de instructies in tabel 3 om de reagentia te mengen en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 1 uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 80 μL gedestilleerd water toe en bewaar de staartsonde bij 4 °C.

Figure 6
Figuur 6: Hybridisatie van de sonde. Het volume van de hybridisatiebuffer wordt aangepast en de met digoxigenine gelabelde sonde wordt opgenomen om de hybridisatie van de sonde 's nachts mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 3: Reagentia voor de sondes die worden geëtiketteerd met digoxigenine (DIG). Klik hier om deze tabel te downloaden.

5. Chemiluminescentie (anti-DIG-markering)

  1. Was het membraan twee keer met 2 X SSPE/0,1% SDS op kamertemperatuur gedurende 10 min.
  2. Incubeer het membraan met 5 X SSPE/0,1% SDS bij de gloeitemperatuur van de sonde gedurende 15 minuten.
    NOTITIE: Gebruik in deze stap een bak met deksel om de temperatuur zo lang mogelijk vast te houden. Zorg voor een uniforme en constante temperatuur over het membraan. Het geschatte volume in elke wasbeurt is 100 ml van de aangegeven oplossing.
  3. Was het membraan eenmaal met Buffer 1 (aanvullend bestand 6) op kamertemperatuur gedurende 5 min.
  4. Was het membraan eenmaal met Buffer 2 (aanvullende vijl 6) op kamertemperatuur gedurende 30 min.
  5. Was het membraan met Buffer 2 en voeg het anti-digoxigenine-antilichaam (15 μL) toe (zie materiaaltabel) en incubeer vervolgens gedurende 45 minuten (de incubatietijd kan variëren van 30-60 minuten). Dit secundaire antilichaam labelt de sonde voor detectie.
    OPMERKING: Het membraan kan een nacht in buffer 2 met het anti-digoxigenine-antilichaam bij 4-8 °C worden bewaard. Anti-DIG-tagging van het chemiluminescentieproces is weergegeven in figuur 7.

Figure 7
Figuur 7: Anti-DIG tagging van het chemiluminescentieproces. De ongebonden nucleïnezuren worden verwijderd met bufferoplossingen. De sonde wordt uitgelijnd met het doel-DNA en het overtollige wordt verwijderd. Het membraan wordt geblokkeerd met de blokkerende 1 X-buffer en het anti-DIG-antilichaam wordt toegevoegd (1:10000). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Chemiluminescentie (toepassing op het substraat)

  1. Was het membraan twee keer in Buffer 1 op kamertemperatuur gedurende 15 min.
  2. Was eenmaal in buffer 3 (zie aanvullend bestand 6) op kamertemperatuur gedurende 5 minuten, zodat het membraan het grootste deel van de buffer kan afvoeren en bijna droog blijft.
  3. Voeg CSPD gebruiksklaar toe (Dinatrium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloor) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}-4-yl) fenylfosfaat, zie Materiaaltabel) en laat 5 minuten intrekken (homogeniseer de CSPD met vochtige vingers van de ene naar de andere kant).
  4. Plaats het membraan in een doorzichtige plastic zak (12,5 x 9 cm) die past bij de membraanmaat. Verwijder voorzichtig de luchtbellen, verdeel de CSPD gelijkmatig en sluit de zak met een heatseal.
  5. Incubeer het membraan in een waterbad bij 37 °C gedurende 15 minuten (dit kan tot 30 minuten duren) en zorg ervoor dat het membraan met monsters naar beneden wordt geplaatst zodat het goed ondergedompeld is. Zorg ervoor dat de temperatuur constant blijft en goed verdeeld over het membraan.
  6. Droog de plastic zak af en bevestig deze met plakband op een reeds gebruikte radiografische film. Dit zorgt voor een gemakkelijke hantering tijdens de belichtingsprocedure.
    OPMERKING: Figuur 8 toont de substraattoepassing van het chemiluminescentieproces.

Figure 8
Figuur 8: Substraattoepassing van het chemiluminescentieproces. Het vrije antilichaam wordt verwijderd en het substraat CSPD (1:250) wordt aan het membraan toegevoegd. De reactie wordt geactiveerd door incubatie bij 37 °C en het membraan wordt zo gerangschikt dat de chemiluminescentie in een röntgenfilm wordt vastgelegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Chemiluminescentie (detectie)

  1. Voer de belichtingsprocedure uit. Bereid in de donkere kamer de ontwikkelaars- en fixeeroplossingen voor (zie Materiaaltabel) in de respectievelijke trays.
  2. Plaats in het donker het vaste membraan voorzichtig in de richting van een nieuwe radiografische film en plaats deze in een radiografische cassette (zie Materiaaltabel).
  3. Registreer het tijdstip van blootstelling. De belichtingstijd kan variëren van 1 minuut tot 30 minuten of langer. Begin met 5 minuten en pas de tijd dienovereenkomstig aan.
  4. Bevochtig de röntgenfilm 1-3 minuten in ontwikkeloplossing en spoel voorzichtig af met kraanwater (15-45 s).
  5. Bevochtig de röntgenfilm 1-3 minuten in fixeeroplossing en spoel voorzichtig af met kraanwater (45 s).
  6. Laat de röntgenfilm aan de lucht drogen en documenteer de test in een zichtbare witte lichtbak.
    NOTITIE: Vermijd het schudden van het membraan tijdens de belichtingstijd voor röntgenstralen. Het detectieproces is weergegeven in figuur 9.
  7. Ga verder met de interpretatie van het resultaat. In de blootgestelde röntgenfilm kunnen de stippen met emissie visueel worden gelokaliseerd en overeenkomen met de DNA-fragmenten met de hybridisatie van de sonde. De intensiteit van het uitgezonden signaal is afhankelijk van de luminescentie en de duur van de belichting.
    OPMERKING: Membranen kunnen enkele maanden gedroogd tussen filtreerpapier bij kamertemperatuur worden bewaard.

Figure 9
Figuur 9: Detectie van het chemiluminescentieproces. Onder donkere omstandigheden wordt het membraan blootgesteld aan een röntgenfilm in een röntgencassette. Vervolgens mocht het tijdens de expositietijd staan, en vervolgens werd de röntgenfilm ontwikkeld en gefixeerd. Ten slotte werd het aan de lucht gedroogd en geïnterpreteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Procedure voor membraandehybridisatie

  1. Was het membraan twee keer gedurende 10 minuten met gedestilleerd water.
  2. Was het membraan gedurende 20 minuten met 0,4 M NaOH op 53 °C (tweemaal).
  3. Was tweemaal het membraan gedurende 10 minuten met 2 X SSPE.
  4. Laat het membraan bij kamertemperatuur drogen.
  5. Bewaar het membraan en keer terug naar stap 3.5 van het protocol.
    OPMERKING: Het membraan kan 's nachts bij 4-8 °C in de prehybridisatiebuffer worden opgeslagen. Start de volgende dag opnieuw met een incubatie bij 42 °C gedurende 1 uur, zodat de pre-hybridisatiebuffer de temperatuur kan bereiken. Ga vervolgens verder met stap 3.5 van het protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de effectiviteit van de techniek te beoordelen, werd genomisch DNA uit zuivere culturen van elke Leptospira serovar gebruikt, samen met de clade-specifieke sonde. Membranen werden geprepareerd met 100 ng genoom-DNA per PCR-reactie voor elke serovar, gevolgd door acht genomische DNA van niet-verwante bacteriën en variabele concentraties genomisch DNA van de ad-hoc Leptospira-serovars . Elke test omvatte positieve, negatieve en niet-sjablooncontrole. Dit niet-verwante genomische DNA vertoonde geen affiniteit met de dot-blot-sondes. De membraanverdeling en dot-blot-membranen zijn weergegeven in aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 3, aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5, aanvullende figuur 6, aanvullende figuur 7. Wat de saprofytenclade betreft, met behulp van de DB_Saproprobe met het PCR-product van 1059 bp geamplificeerd met primers DB_16SPathoREV en DB_16S PathoFWD, en het PCR-product van 517 bp geamplificeerd met primers DB_16SSapREV en DB_16SSapFWD met genoom-DNA van Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I, het was mogelijk om tussen 0,05-0,1 ng saprofyt-DNA te detecteren (aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3). Evenzo, voor de detectie van de intermediaire clade, met behulp van de DB_Interprobe met het PCR-product van 1059 bp geamplificeerd met primers DB_16S PathoREVen DB_16S PathoFWD, en het PCR-product van 299-301 bp geamplificeerd met de primers DB_16SInterREV en DB_16SInterFWD met genomisch DNA van Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 (aanvullende figuur 4 en aanvullende figuur 5), was het mogelijk om ongeveer 0,1 ng van het intermediaire DNA te detecteren. Evenzo, voor de pathogene clade met behulp van de DB_16SPathoprobe met het PCR-product van 1059 bp geamplificeerd door primers DB_16S PathoREVen DB_16S PathoFWD, of de DBlipL41probe met het PCR-product van 479 bp geamplificeerd door primers DB_lipL41REV en DB_lipL41FWD met genomische DNA-mix van pathogene Leptospira-serovars , het was mogelijk om DNA-concentraties van 0,3-0,6 ng pathogeen DNA te detecteren (aanvullende figuur 6 en aanvullende figuur 7).

De tests die zijn ontworpen om de drie clades te identificeren, kunnen voor elke clade afzonderlijk worden gebruikt. In het geval van waardevolle en schaarse monsters kan echter een enkel membraan worden bereid met primers DB_16SPathoREV en DB_16S PathoFWD, die een product van 1058-1069 bp versterken. Dit product kan vervolgens worden gehybridiseerd met de DB_Interprobe, de DB_Saproprobe en de DB_16SPathoprobe afzonderlijk, met de dehybridisatiestap (stap 8) voor elk van hen. Deze aanpak maakt het mogelijk om alle clades in hetzelfde membraan te identificeren.

In de veldwatermonsters werd het lipL32-sondeprotocol toegepast. Het DNA van elk watermonster werd gebruikt in een concentratie van 100 ng per PCR-reactie. Daarnaast werd een controle van het DNA-extractieprotocol opgenomen, die bestond uit het pieken van 100 ng Leptospira-genoom-DNA in een gedestilleerd watermonster van 15 ml. Negatieve en positieve controles werden ook opgenomen (figuur 10).

Tabel 4: Beschrijving en diepte van watermonsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 10
Figuur 10: Dot-blot-analyse van elk watermonster. (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van het DB_lipL32probe en het product (262 bp) van primers DB_lipL32REV en DB_lipL32FWD van de veldwatermonsters. Het oppervlak van vijver 3 laat een positief resultaat zien en zowel de controle van het extractieprotocol als de positieve controles hebben een intens signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De beschrijving van het watermonster is weergegeven in tabel 4 en de punt-vlekmembraanverdeling en het beeld zijn weergegeven in figuur 9. De stip A7 laat zien dat Leptospiral DNA aanwezig was op het oppervlak van vijver 3. Om de DNA-concentratie te bepalen die aanwezig was in vijver 3, werd een dot-blot-test uitgevoerd met bekende DNA-concentraties van een mix van Leptospira-serovars en de lipL32-sonde (Figuur 11). Het membraan werd geprepareerd met genomisch DNA verdeeld van 100 ng tot 1 x 10-13 ng in elke stip. De minimale concentratie die zonder twijfel kan worden gedetecteerd was ongeveer 0,3 ng, wat overeenkomt met 6 x 105 GEq in de watermonsters.

Figure 11
Figuur 11: Dot-blot-test met bekende DNA-concentraties van een mix van Leptospira-serovars en de lipL32-sonde. (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_lipL32probe en het product (262 bp) van primers DB_lipL32REV en DB_lipL32FWD met verdunningen (1:2) van een genomische DNA-mix van pathogene Leptospira serovars. Het signaal van de sonde kan eenvoudig worden gedetecteerd tot 3,91 x 10-1 ng Leptospira DNA-mix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: PCR-amplificatieproducten gevisualiseerd door elektroforetische scheiding. Baan 1. Molecuulgewicht marker 100 bp DNA-ladder. Baan 2. PCR op basis van het lipL32-gen met pathogene Leptospira DNA-mix als sjabloon; Baan 3. PCR op basis van het lipL41-gen met pathogene Leptospira DNA-mix als sjabloon; Baan 4. PCR op basis van het 16S rRNA-gen met pathogene Leptospira DNA-mix als sjabloon; Rijstrook 5. PCR op basis van het 16S rRNA-gen met primers DB_16SSapREV en DB_16SSapFWD, en Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I DNA als sjabloon; Rijstrook 6. PCR op basis van het 16S rRNA-gen met primers DB_16SPathoREV en DB_16SPathoFWD, en Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I DNA als sjabloon; Rijstrook 7. PCR op basis van het 16S rRNA-gen met primers DB_16SInterREV en DB_16SInterFWD, en Leptospira fainei, serovar Hurstbridge-stam BUT6-DNA als sjabloon; Rijstrook 8. PCR op basis van het 16S rRNA-gen met primers DB_16SPathoREV en DB_16S PathoFWD, en Leptospira fainei, serovar Hurstbridge-stam BUT6-DNA als sjabloon. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_Saproprobe en het product (1059 bp) van primers DB_16SPathoREV en DB_16S PathoFWDvan genomisch DNA van Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_Saproprobe met het product (517 bp) van primers DB_16SSapREV en DB_16SSapFWD van genomisch DNA van Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_Interprobe met het product (1059 bp) van primers DB_16SPathoREV en DB_16S PathoFWDen genomisch DNA van Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: (A) Membraanverdeling en B) dot-blot van de DB_Interprobe en het product (299-301 bp) van primers DB_16SInterREV en DB_16SInterFWD met genoom-DNA van Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_16SPathoprobe en het product (1059 bp) van primers DB_16S PathoREVen DB_16S PathoFWDmet genomische DNA-mix van pathogene Leptospira serovars. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: (A) Membraanverdeling en (B) dot-blot van de DB_lipL41probe met het product (479 bp) van primers DB_lipL41REV en DB_lipL41FWD met genomische DNA-mix van pathogene Leptospira serovars. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Uitlijning van saprofyt Leptospira-soorten met de primers en sonde op basis van de 16S ribosomale RNA-sequentie. Primers zijn vetgedrukt en zwart gemarkeerd voor hun identificatie, waarbij hun richting wordt aangegeven door zwarte pijlen. De sonde is vetgedrukt en grijs gemarkeerd en de positie is gemarkeerd met een grijze lijn. De uitgelijnde sequenties zijn lichtgrijs gemarkeerd, terwijl de niet-corresponderende sequenties in zwart-wit zijn gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Uitlijning van intermediaire Leptospira-soorten met de primers en sonde op basis van de 16S ribosomale RNA-sequentie. Primers zijn vetgedrukt en zwart gemarkeerd voor hun identificatie, waarbij hun richting wordt aangegeven door zwarte pijlen. De sonde is vetgedrukt en grijs gemarkeerd en de positie is gemarkeerd met een grijze lijn. De uitgelijnde sequenties zijn in lichtgrijs, terwijl de niet-corresponderende sequenties in zwart-wit worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Uitlijning van pathogene Leptospira-soorten met de primers en sonde op basis van de lipL32-gensequentie. Primers zijn vetgedrukt en zwart gemarkeerd voor hun identificatie, waarbij hun richting wordt aangegeven door zwarte pijlen. De sonde is vetgedrukt en grijs gemarkeerd en de positie is gemarkeerd met een grijze lijn. De uitgelijnde sequenties zijn in lichtgrijs, terwijl de niet-corresponderende sequenties in zwart-wit worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: Uitlijning van pathogene Leptospira-soorten met de primers en sonde op basis van de lipL41-gensequentie. Voor hun identificatie zijn de primers vetgedrukt en zwart gemarkeerd, waarbij de richting wordt aangegeven door zwarte pijlen. De sonde is vetgedrukt aangegeven en donkergrijs gemarkeerd, en de positie is gemarkeerd met een grijze lijn. De uitgelijnde sequenties zijn in lichtgrijs, terwijl de niet-corresponderende sequenties in zwart-wit zijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: Uitlijning van Leptospira-soorten met de primers gericht op de 16S ribosomale RNA-sequentie en de sondes voor saprofyten-, tussenliggende en pathogene soorten. Voor hun identificatie zijn primers vetgedrukt en zwart gemarkeerd, waarbij hun richting wordt aangegeven door zwarte pijlen. De sondes zijn vetgedrukt aangegeven en grijs gemarkeerd, waarbij hun posities worden weergegeven door grijze lijnen. De uitgelijnde sequenties zijn in lichtgrijs en de niet-corresponderende sequenties zijn in wit en zwart. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Buffers en oplossingen voor de dot-blot assay. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritieke stappen van de dot-blot-techniek omvatten (1) DNA-immobilisatie, (2) blokkering van de vrije bindingsplaatsen op het membraan met niet-homoloog DNA, (3) de complementariteit tussen de sonde en het doelfragment onder gloeiomstandigheden, (4) verwijdering van de niet-gehybridiseerde sonde en (5) de detectie van het reportermolecuul41.

De PCR-Dot-blot heeft bepaalde beperkingen, zoals het feit dat de techniek geen informatie geeft over de grootte van het gehybridiseerde fragment37, het vereist dehybridisatie van een enkel membraan voordat het opnieuw wordt gehybridiseerd met een tweede of derde sonde, en het kost veel tijd en moeite om tot het eindresultaat te komen.

Deze techniek is consistent gebleken met andere moleculaire technieken 42,43 en de toepassingen ervan. Reverse dot-blot, nanogold dot-blot21 en dot-ELISA42 zijn gebruikt voor de detectie van specifieke genen in organismen zoals Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 en Mycobacterium tuberculosis48,49 op basis van het 16S rRNA29,43, en voor de detectie van DNA of RNA van planten virussen41. De detectielimiet (LOD), gedefinieerd als de laagste concentratie van het micro-organisme die met deze techniek consistent en betrouwbaar kan worden gemeten50, varieerde van 100 pg (5 x 104 bacteriën) voor H. pylori47, tot een enkele cel van B. burgdorferi in klinische monsters45, en een fg, die kleiner is dan een cel, van M. tuberculosis48,49.

Een waardevol aspect van deze gecombineerde methodologie is het vermogen om de detectielimiet met één bestelling te verlengen, waardoor vals-negatieve resultaten worden overwonnen als gevolg van twee monsteromstandigheden die tot inconsistente resultaten kunnen leiden: (1) monsters met onvoldoende DNA, of (2) monstercontaminatie, waardoor 100% detectie van positieve monsters mogelijk is 25,45,47,48,49. De PCR-Dot-blot heeft het vermogen om lagere hoeveelheden geamplificeerde producten te detecteren dan die welke kunnen worden gedetecteerd bij agarosegelelektroforese, en het vermijdt contaminatie als gevolg van tweede amplificatiestappen, zoals bij geneste en semi-geneste PCR. Deze voordelen zijn met name van cruciaal belang bij het werken met omgevingsmonsters met een lage bacteriële lading, die een breder scala aan remmers en DNA uit niet-verwante bronnen kunnen bevatten die de moleculaire technieken kunnen verstoren.

Eerder werk suggereert dat leptospistellen kunnen worden geïdentificeerd door DNA-sondes gelabeld met fotobiotine die een LOD van 5 pg bereiken (5 x 103 leptospiren)51. DIG-gelabelde sondes detecteren 0,1-1 pg (102 leptospiren), terwijl 32P-gelabelde sondes 1-5 pg (750 tot 1000 leptospiren)51 detecteren, en biotine-gelabelde sondes detecteren 5 pg (2500 leptospiren)52. Verder bereikten 32P-gelabelde sondes voor saprofyt Leptospira een LOD van 1,95 ng en voor pathogene Leptospira, 3,9 ng53. In deze studie werden vergelijkbare LOD's vastgesteld voor de drie clades. De LOD voor pathogene soorten was ongeveer 0,3 ng genomisch DNA (6-8 x 104 GEq) (figuur 11), en voor de saprofyt en intermediaire soorten was het gedaald tot 0,1 ng (2 x 104 GEq). Met name eerdere onderzoeken werden uitgevoerd met behulp van pure Leptospira-culturen 51 en sera van experimenteel geïnfecteerde goudhamsters, met als doel pathogene Leptospira54,55 te detecteren en DNA-hybridisatie toe te passen met 32P gelabeld als een hulpmiddel voor de identificatie en classificatie van Leptospira56. Deze sondes vertonen een hoge specificiteit en vertonen geen kruishybridisatie met niet-homoloog DNA van andere micro-organismen 19,51,54,55,56,57, en kunnen zelfs onderscheid maken tussen nauw verwante soorten zoals Leptonema 57. Evenzo werd in dit werk geen hybridisatie met niet-homoloog DNA waargenomen. Hoewel niet-isotopische sondes niet zo gevoelig zijn als isotopensondes58 of andere technieken43, kan worden verwacht dat de PCR-Dot-blot-combinatie een tienvoudige toename van de gevoeligheid mogelijk maakt in vergelijking met andere op PCR gebaseerde technieken, zoals te zien is bij de detectie van Leishmania en het boviene herpesvirus 4 (BHV4)24,26.

Aan de andere kant is de dot-blot-test voor Leptospira-identificatie vaker gebruikt met antilichamen en de laatste tijd met monoklonale antilichamen als alternatief voor het diagnosticeren van mens en dier in urinemonsters 59,60,61,62. In deze onderzoeken wordt het monster rechtstreeks op het membraan verwerkt zonder voorafgaande stappen, en antilichamen richten zich op specifieke Leptospira-oppervlakte-eiwitten die verband houden met pathogenese. Mab-Dot-blot ELISA vertoont bijvoorbeeld een hoge gevoeligheid en specificiteit en detecteert slechts 1 μg bacterieel homogenaat62. De resultaten van de Mab-Dot-blot-test kunnen vergelijkbaar zijn met PCR-tests, die doorgaans een LOD hebben van ongeveer 103 leptospiren/ml urine of 9,3 ng leptospira-homogenaat 63. De hoeveelheid genomisch DNA die met PCR kan worden geamplificeerd is 100 cellen (500 fg DNA)61. Deze eerdere studies gebruikten zuivere culturen of klinische monsters zonder verrijkingsprocedures en waren gericht op een betere diagnose. Aangezien geïnfecteerde ratten maar liefst 107 leptospiren/ml urine64 kunnen uitscheiden, en honden tussen 102 en 106 leptospiren/ml urine65 kunnen uitscheiden, die dienen als bronnen van besmetting voor waterlichamen, vereisen de milieumonsters leptospirale verrijking. De in vitro PCR-amplificatie van het beoogde DNA vóór het deppen zorgt voor een verbetering van de proceduregevoeligheid tot tienvoudig52,55. Gewoonlijk zou het product dat wordt geamplificeerd door een eindpunt-PCR niet worden gevisualiseerd in een agarosegelelektroforese; niettemin wordt het duidelijk door de specifieke hybridisatie van de DIG-gelabelde sonde in de dot-blot.

Hoewel veel onderzoek naar leptospira en leptospirose zich heeft gericht op de diagnose van ziekten, is er weinig bekend over hun ecologie in waterlichamen en hun verspreiding daarin. De PCR-Dot-blot-techniek is een aanvulling op de gereedschapskist voor het bestuderen van leptospira en leptospirose en biedt het voordeel dat een groot aantal monsters wordt gescreend en de resultaten en interpretatie worden versneld. PCR-Dot-blot is een relatief goedkope, eenvoudige en niet-radioactieve techniek die plaats biedt aan meerdere sondes op een enkel membraan. Bovendien elimineert het de noodzaak van geavanceerde apparatuur en complexe workflows, wat een uitdaging kan zijn in omgevingen met beperkte middelen.

De impact van deze studie ligt in de toekomstige toepassing ervan om grote watermassa's op verschillende diepten te bestuderen, evenals andere ecologische niches en monstertypes, waaronder bodem, stilstaand water, uitwerpselen, bloed en weefsels.

Concluderend demonstreert dit werk de toepassing van de PCR-Dot-blot-techniek, gebaseerd op de digoxigenine-etikettering van DNA-sondes voor de identificatie van de drie clades binnen het geslacht Leptospira. Deze methode stroomlijnt het identificatieproces door het terug te brengen tot een enkele amplificatiestap en maakt drie gelijktijdige hybridisaties of drie opeenvolgende hybridisaties mogelijk met behulp van een enkel membraan. De detectielimieten die met deze techniek worden bereikt, zijn vergelijkbaar met die van radioactieve sondes53, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het identificeren van Leptospira in watermonsters uit natuurlijke bronnen. Bijgevolg biedt deze techniek een verhoogde gevoeligheid en levert het nauwkeurige en consistente resultaten op bij het evalueren van monsters met minimale hoeveelheden bacterieel DNA. Het dient als een alternatieve benadering voor het bestuderen van de dynamiek van Leptospira in waterlichamen en kan helpen bij de beoordeling en bewaking van bredere milieumonsters, en helpen bij de implementatie van preventieve maatregelen tegen de overdracht van dit micro-organisme.

In geval van problemen met de techniek, overweeg dan de volgende hoogtepunten voor het oplossen van problemen: (1) Als de stippen onregelmatige vormen hebben, controleer dan of het vacuümsysteem goed kruiselings gesloten is en herhaal vervolgens de overdracht. (2) In het geval dat de hybridisatiebuis tijdens de nachtelijke procedure breekt, waardoor het membraan de hybridisatiebuffer verliest, raadpleeg dan het gedeelte "Dehybridisatieprocedure" en start het proces opnieuw. (3) Als er geen stippen zichtbaar zijn, gooi het membraan dan niet weg; ga verder met het gedeelte "Dehybridisatieprocedure" om de hybridisatiestappen te herhalen. (3) Als er ongelijke witte gebieden worden opgemerkt op de ontwikkelde röntgenfilm, zorg er dan voor dat er geen luchtbellen worden opgesloten tijdens het sealen van de zak. (5) Als er ongelijke zwarte gebieden worden waargenomen op de ontwikkelde röntgenfilm, controleer dan of de CSPD grondig is verdeeld met behulp van vochtige vingers. (6) Als de röntgenfilm schaduwen van de stippen vertoont, zorg er dan voor dat de film tijdens de belichtingstijd niet wordt bewogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We zijn dank verschuldigd aan de Leptospira-collectie van de afdeling Microbiologie en Immunologie, Faculteit Diergeneeskunde en Zoötechniek, Nationale Autonome Universiteit van Mexico. We zijn dankbaar voor de genereuze donatie van de referentie Leptospira-stammen ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 en Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I aan Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Wij danken Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, de CIBAC-coördinator, en het personeel voor hun logistieke steun. EDT maakte deel uit van het Terminal Project-programma voor niet-gegradueerde studenten van de Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. We erkennen de Biorender.com software voor het maken van figuren 1 en 3 tot en met 9.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 208 Leptospira Dot-blot PCR Digoxigenin
Polymerasekettingreactie en dot-blot-hybridisatie voor <i>leptospira-detectie</i> in watermonsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgadillo-Tellez, E.,… More

Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter