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Genetics

मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में 53बीपी1 और 1 के दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

यह प्रोटोकॉल ब्लीमाइसिन-उपचारित मानव परिधीय लिम्फोसाइटों के इंटरफेज नाभिक में डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के गठन और मरम्मत का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) सबसे गंभीर घावों में से एक है जो सेल नाभिक में हो सकता है, और, यदि मरम्मत नहीं की जाती है, तो वे कैंसर सहित गंभीर परिणामों का कारण बन सकते हैं। इसलिए, सेल को डीएसबी की मरम्मत के लिए जटिल तंत्र प्रदान किया जाता है, और इन मार्गों में हिस्टोन एच 2 ए एक्स को सेर -139 (अर्थात् एच 2 एएक्स) और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1) में फॉस्फोराइलेटेड रूप में शामिल किया जाता है। चूंकि दोनों प्रोटीन डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं, इन मार्करों की पहचान को डीएसबी और मरम्मत के उनके कैनेटीक्स दोनों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त तरीका माना जाता है। आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार जो कि H2AX और 53BP1 फॉसी के गठन की ओर ले जाती हैं, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए DSB के पास उनके सह-स्थानीयकरण की जांच करना अधिक उपयोगी हो सकता है जो दो डीएनए क्षति मार्करों का एक साथ पता लगाकर DSB को निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में 3H2AX और 53BP1 फॉसी की उपस्थिति के माध्यम से रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करना है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स का अध्ययन करने के प्रारंभिक प्रयास के रूप में, समय के साथ 3H2AX और 53BP1 फॉसी की संख्या में भिन्नता को भी चित्रित किया।

Introduction

डीएनए क्षति लगातार एजेंटों द्वारा प्रेरित होती है जो अंतर्जात हो सकते हैं, जैसे कि सेलुलर ऑक्सीडेटिव चयापचय द्वारा उत्पन्न आरओएस, या बहिर्जात, रसायन और भौतिकदोनों 1। सबसे हानिकारक घावों में, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) जीनोमिक अस्थिरता में योगदान करने में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि वे क्रोमोसोम विपथन का कारण बनते हैं जो बदले में कार्सिनोजेनेसिस प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं। इस प्रकार, कोशिकाओं को डीएसबी मरम्मत के जटिल और कुशल तंत्रप्रदान किए जाते हैं।

जब डीएसबी होता है, तो कोशिका डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) को ट्रिगर करती है, जहां एमआरई 11 / आरएडी 50 / एनबीएस 1 कॉम्प्लेक्स के साथ, एटीएम या एटीआर किनेसेस को अन्य प्रोटीनों को सक्रिय करने के लिए भर्ती किया जाता है जो सेल चक्र3 को धीमा या रोकते हैं। इन किनेसेस का एक आवश्यक लक्ष्य हिस्टोन एच 2 ए एक्स है, जो डीएसबी से कुछ मेगाबेस के भीतर सेर -139 पर फॉस्फोराइलेटेड है (अर्थात् एच 2 एएक्स), जिससे कई मरम्मत कारकों की भर्ती की अनुमति मिलती है, जैसे कि दूसरों के बीच, बीआरसीए 1 और पी 53 बाइंडिंग प्रोटीन 1 (53 बीपी 1)3। बाद में, डीएसबी 4,5 की मरम्मत के लिए होमोलोगस पुनर्संयोजन (एचआर), गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे), या सिंगल-स्ट्रैंड एनीलिंग (एसएसए) के बीच एक मार्ग शुरू किया जाता है। इसलिए, 53BP1 HR या NHEJ के बीच चयन को निर्धारित करने में शामिल है, मुख्य रूप से HR6 के बजाय NHEJ के सक्रियण को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, एच 2 ए एक्स हिस्टोन और 53 बीपी 1 के फॉस्फोराइलेटेड रूप दोनों डीएसबी की साइटों पर फॉसी बना सकते हैं। चूंकि ये फॉसी तब तक बनी रहती हैं जब तक कि डबल स्ट्रैंड की अखंडता बहाल नहीं हो जाती है, एक समय अंतराल के भीतर 3H2AX या 53BP1 फॉसी की उपस्थिति / गायब होने का आकलन करना सेल सिस्टम 6,7 में DSB की घटना और मरम्मत का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका माना जाता है। हालांकि, ऊपर वर्णित आणविक प्रक्रियाओं के अनुसार, चूंकि डीडीआर8,9 के दौरान डीएसबी के पास 5एच2एएक्स और 53बीपी1 फॉसी के सह-स्थानीयकरण की उम्मीद है, इसलिए दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में इन मार्करों की उपस्थिति का समवर्ती रूप से पता लगाना उपयोगी हो सकता है।

इस प्रकार, इस पांडुलिपि का उद्देश्य रेडियोमिमेटिक एजेंट ब्लीमाइसिन द्वारा मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में प्रेरित जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक साथ परिमाणीकरण की उपयुक्तता का मूल्यांकन करना था। उसी पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने पहले से स्थापित प्रयोगात्मक प्रक्रिया10 के अनुसार ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स को चित्रित करने का भी प्रयास किया।

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Protocol

अध्ययन को पीसा विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रत्येक दाता से सूचित और हस्ताक्षरित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. 3H2AX और 53BP1 फॉसी का गठन

  1. नमूने और म्यूटाजेनिक उपचार की तैयारी
    1. एंटीकोआगुलेंट के रूप में लिथियम हेपरिन युक्त रक्त संग्रह (जैसे, वैकुटेनर) ट्यूबों में स्वस्थ वयस्क व्यक्तियों से वेनिपंक्चर द्वारा पूरे रक्त के नमूने एकत्र करें।
    2. उचित रक्त नमूना संरक्षण की गारंटी देने के लिए, नमूने के 24 घंटे के भीतर प्रक्रिया शुरू करें।
    3. नमूने के 300 μL को एक ट्यूब में जोड़ें जिसमें 4.7 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम (0.5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.75% फाइटोहेमग्लूटिनिन, 10% एफबीएस पहले निष्क्रिय, 88.75% आरपीएमआई 1640) है।
    4. फिर 5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में ब्लीमाइसिन सल्फेट जोड़ें।
      सावधानी: ब्लीमाइसिन सल्फेट एक उत्परिवर्तन है। त्वचा के संपर्क और साँस लेने से बचें। घोल तैयार करें और एक हुड के नीचे नमूना जोड़ें।
    5. प्रत्येक नमूने के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण (उत्परिवर्तन की अनुपस्थिति) सेट करें।
    6. ट्यूब को थर्मोस्टेट में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. ग्रस्तता
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 540 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
    2. सतह पर तैरने वाला पदार्थ डालें और गोली को भंवर से फिर से सस्पेंड करें।
    3. लाल रक्त कोशिकाओं के हेमोलिसिस का कारण बनने के लिए 5 एमएल हाइपोटोनिक समाधान (500 एमएल विआयनीकृत पानी में 2.87 ग्राम केसीएल घुलित) और 400 μL प्री-फिक्सेटिव समाधान (5: 3 एसिटिक एसिड: मेथनॉल) जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 540 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
    5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मेथनॉल के 5 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
    6. वैकल्पिक रूप से, उपयोग तक कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. स्लाइड ्स की तैयारी
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 540 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
    2. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 3: 1 मेथनॉल: एसिटिक एसिड समाधान के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। इन चरणों को एक बार और दोहराएं।
    3. अंत में, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 540 x g पर घोल को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सतह पर तैरने वाले को फिर से पेलेट को फिर से निलंबित करने के लिए पर्याप्त समाधान (0.5 एमएल) छोड़ते हुए, पिपेट को जोर से बंद करने, पुन: निलंबित सेल गोली को स्लाइड पर छोड़ने और हवा को सूखने के लिए पर्याप्त समाधान (0.5 एमएल) छोड़ दें। स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस।
    नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट सेल लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक प्रतिरक्षाविज्ञानी विधि है जो लक्ष्य को बांधती है और एक फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी प्राथमिक को बांधती है जो लक्ष्य11 को स्थानीय बनाने की अनुमति देती है। इस मामले में, एक माउस मोनोक्लोनल एंटी-53बीपी1 (1:50) और एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-एच2एएक्स (1:50) का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है, जबकि एलेक्साफ्लुर 568 एंटी-माउस (1:400) और डायलाइट 488 एंटी-खरगोश (1:200) का उपयोग क्रमशः द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में किया जाता है।
    1. कूपलिन जार में 5 मिनट के लिए 1x PBS के 50 मिलीलीटर में स्लाइड को दो बार धोएं (16 स्लाइड बैक-टू-बैक)।
    2. फिर उन्हें ब्लॉकिंग समाधान में 30 मिनट के लिए रखें (10 एमएल एफबीएस, 10 एमएल 10 एमएल 10 एक्स पीबीएस, 80 एमएल विआयनीकृत पानी, 300 μL ट्राइटन-एक्स)।
    3. ब्लॉकिंग समाधान में घुले प्राथमिक एंटीबॉडी वाले दो समाधानों में से प्रत्येक की प्रत्येक स्लाइड में 10 μL जोड़ें। स्लाइड को पैराफिन टेप से कवर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन बाद, 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में तीन धुलाई करें।
    5. ब्लॉकिंग समाधान में घुले द्वितीयक एंटीबॉडी वाले दो समाधानों में से प्रत्येक की प्रत्येक स्लाइड 10 μL में जोड़ें। स्लाइड को पैराफिन टेप से कवर करें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में तीन धुलाई करें।
    7. नाभिक का मुकाबला करने के लिए असेंबली से पहले कवरलिप्स पर डीएपीआई के साथ 2.5 μL एंटीफैड समाधान जोड़ें।
      नोट: फॉसी कैनेटीक्स का आकलन करने के लिए, प्रक्रिया 1.1 से 1.4 तक वर्णित है, यह देखते हुए कि सेल कटाई और दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस 0 घंटे पर किया जाता है, 2 घंटे पोस्ट-ब्लीमाइसिन उपचार के बाद और फिर, उत्परिवर्तन को हटाने के बाद, 4 घंटे, 6 घंटे और 24 घंटे के उपचार के बाद।

2. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से विश्लेषण

नोट: "फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप" किसी भी माइक्रोस्कोप को संदर्भित करता है जो एक छवि उत्पन्न करने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है। नमूना एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (या तरंग दैर्ध्य) के प्रकाश से रोशन होता है जो फ्लोरोफोरद्वारा अवशोषित होता है, जिससे वे लंबे तरंग दैर्ध्य12 के प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं। AlexaFluor568 और Dylight 488 लगभग 568 और 488 nm के प्रकाश को अवशोषित करते हैं और क्रमशः 603 और 520 nm के प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं। इस प्रकार, वे क्रमशः TRITC या FITC फ़िल्टर का उपयोग करके लाल या हरे रंग की प्रतिदीप्ति के रूप में दिखाई देते हैं।

  1. 100x विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 1) के तहत प्रत्येक स्लाइड में फॉसी की उपस्थिति स्कोर करें।
  2. प्रति स्लाइड 200 नाभिक स्कोर करें और प्रत्येक नाभिक में 3H2AX/53BP1 फॉसी की संख्या की गणना करें।
  3. स्कोर किए गए कुल नाभिक में फॉसी की औसत संख्या के संदर्भ में परिणाम व्यक्त करें। इनमें 53बीपी1 पॉजिटिव (कम से कम एक फ्लोरेसेंस सिग्नल दिखाते हुए) और नेगेटिव (कोई फ्लोरेसेंस सिग्नल नहीं दिखा रहे) दोनों न्यूक्लियस शामिल हैं।

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Representative Results

परिधीय लिम्फोसाइटों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप विश्लेषण द्वारा प्राप्त डेटा हमें तीन मुख्य पहलुओं का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है: इसके म्यूटाजेनिक प्रभाव के कारण 5एच2एएक्स और 53बीपी1 फॉसी (और इस प्रकार डीएसबी) की संख्या बढ़ाने में ब्लीमाइसिन उपचार की प्रभावशीलता, डीएसबी की साइट पर दोनों फॉसी किस हद तक सह-स्थानीयकृत हैं, और ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स को चित्रित करने के लिए 3एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी का समय-पाठ्यक्रम। जैसा कि अपेक्षित था, अनुपचारित और उपचारित कोशिकाओं के बीच दोनों की एक बहुत अधिक आवृत्ति देखी गई, इस प्रकार पुष्टि की गई कि ब्लीमाइसिन परिधीय लिम्फोसाइटों में डीएसबी के गठन को प्रेरित करता है (चित्रा 2)।

दो मार्करों के फॉसी की संख्या में एक बड़ा अंतर देखा गया; विशेष रूप से, 53BP1 फॉसी की तुलना में H2AX फॉसी अधिक संख्या में थे, इस प्रकार यह दर्शाता है कि सह-स्थानीयकरण हमेशा नहीं होता है और कई कारकों पर निर्भर हो सकता है (चित्रा 3)।

डीएसबी की मरम्मत कैनेटीक्स के बारे में, सबसे पहले, यह रेखांकित करना महत्वपूर्ण है कि फॉसी की वास्तविक मरम्मत पहले चयनित समय बिंदु से पहले कैसे शुरू हो सकती है, जो 2 घंटे है, और यह कि विभिन्न समय बिंदुओं पर, हम नवगठित फॉसी के साथ-साथ फॉसी का निरीक्षण कर सकते हैं जो पहले बने हैं और जिनकी अभी तक मरम्मत नहीं की गई है।

पहले जो कहा गया था, उसे ध्यान में रखते हुए, समय के साथ H2AX और 53BP1 फॉसी के समय-पाठ्यक्रम ने एक अलग व्यवहार दिखाया, हालांकि वे एक ही कार्य में योगदान करते हैं। उपचार के बाद 2 घंटे के बाद H2AX फॉसी में वृद्धि हुई, और फिर उन्होंने एक प्रगतिशील कमी शुरू की, हालांकि, उपचार के बाद 24 घंटे पर नियंत्रण मूल्य तक पहुंचने के बिना। भिन्नता पर, 53बीपी1 फॉसी की आवृत्ति उपचार के बाद 4 घंटे तक बढ़ी, फिर 6 घंटे में कम हो गई और उपचार के बाद 24 घंटे के उच्चतम मूल्य पर लौट आई (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए 53बीपी1: (ए) ब्लीमाइसिन उपचार से पहले 53बीपी1 फॉसी के बिना नाभिक, (बी) और (सी) ब्लीमाइसिन उपचार के कारण अलग-अलग मात्रा में एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी के साथ नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दो डीएसबी मार्करों के लिए अनुपचारित और ब्लीमाइसिन-उपचारित (5 μg / mL) लिम्फोसाइटों के बीच तुलना। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 53BP1 फॉसी और H2AX की कुल राशि (सहज और उत्परिवर्तन-प्रेरित दोनों) के बीच तुलना। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: H2AX और 53BP1 फॉसी कैनेटीक्स। 0 घंटे, 2 घंटे, 4 एच, 6 घंटे और 24 घंटे अलग-अलग समय का प्रतिनिधित्व करते हैं जिस पर लिम्फोसाइटों की कटाई की गई थी; त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक सेल सिस्टम के इंटरफेज नाभिक में जीनोमिक क्षति का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त विधि है। इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं जो प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, मुख्य रूप से, निर्धारण और परमेबिलाइजेशन में उपयोग किए जाने वाले एजेंट, एंटीबॉडी का प्रकार और उनके कमजोर पड़ने वाले कारक, और उत्परिवर्तन की एकाग्रता।

प्रोटीन अखंडता का रखरखाव मौलिक है क्योंकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि एंटीजन की पहचान करने की उम्मीद करती है जो मुख्य रूप से प्रोटीन हैं। इस प्रोटोकॉल में, मेथनॉल का उपयोग लिम्फोसाइटों को ठीक करने के लिए किया जाता है। यह कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अल्कोहल पानी को विस्थापित करके और घुलनशील प्रोटीन की वर्षा का कारण बनता है, जबकि अन्य निश्चित सेलुलर घटकों को खारा बफर घोल, जैसे पीबीएस13 में धोकर हटाया जा सकता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण मार्ग परमेबिलाइजेशन है जो एक ब्लॉकिंग समाधान के माध्यम से किया जाता है, जो इस मामले में परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग दोनों की अनुमति देता है। ब्लॉकिंग समाधान में एफबीएस जोड़कर किया जाता है: यह नमूने में प्रोटीन को बांधता है और एंटीबॉडी को गलत लक्ष्य को बांधने से रोकता है क्योंकि एफबीएस और एंटीबॉडी के विशिष्ट लक्ष्य के बीच का बंधन बाद में एंटीबॉडी और लक्ष्य के बीच उच्च संबंध के कारण टूट सकता है। परमेबिलाइजेशन कई सॉल्वैंट्स का उपयोग करके किया जा सकता है, इस मामले में, नॉनआयनिक डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 का उपयोग किया जाता है: यह फॉस्फोलिपिड बाइलेयर में इंटरकेलेट करता है, प्लाज्मा झिल्ली को घुलनशील करता है औरफिर इसे बाधित करता है।

चूंकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस की सफलता के लिए कुशल एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 एंटीबॉडी का विकल्प महत्वपूर्ण है, इसलिए सिद्ध विश्वसनीयता के एंटीबॉडी के उपयोग की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। यह भी सुझाव दिया जाता है कि सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाली एकाग्रता की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी के कई कमजोर पड़ने की कोशिश करें।

प्रारंभिक प्रयोगों के रूप में, हमने संभावित पृष्ठभूमि शोर या ऑटोफ्लोरेसेंस का आकलन करने के लिए विभिन्न नियंत्रणों का अध्ययन किया। विशेष रूप से, हमने विभिन्न प्रयोगों में, केवल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया, केवल द्वितीयक एंटीबॉडी, प्रत्येक दाग व्यक्तिगत रूप से, और कोई धुंधला नहीं था। जैसा कि अपेक्षित था, केवल प्राथमिक / द्वितीयक एंटीबॉडी की उपस्थिति में, हमने कोई ध्यान केंद्रित नहीं किया, जबकि हमने प्रत्येक दाग के साथ व्यक्तिगत रूप से प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय हरे या लाल फ्लोरोसेंट स्पॉट (या तो H2AX या 53BP1 फॉसी की उपस्थिति का संकेत) देखा। कोई धुंधला नियंत्रण नहीं होने के संबंध में, हमने पृष्ठभूमि शोर / ऑटोफ्लोरेसेंस देखा, जो खुद को फैलाने वाले धुंधलापन के साथ प्रकट होता है। इसके बजाय, इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल करने के बाद, उपयोग किए गए फ्लोरोक्रोम (एफआईटीसी या टीआरआईटीसी) के लिए उपयुक्त फिल्टर के तहत हरे या लाल संकेतों के रूप में भूरे-अंधेरे नाभिक में 53बीपी1 फॉसी स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। इस प्रकार, पृष्ठभूमि शोर / ऑटोफ्लोरेसेंस फॉसी की पहचान को एक महत्वपूर्ण तरीके से प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि हमने यह आकलन करने के लिए विशिष्ट मानदंडों का उपयोग किया है कि क्या एक फ्लोरोसेंट स्पॉट एक उचित फोकस है (यानी, माइक्रोस्कोप के फोकस के दौरान, γ-एच 2 ए एक्स और 53 बीपी 1 फॉसी सेल नाभिक के बाहर संभावित रूप से मौजूद अन्य फ्लोरोसेंट स्पॉट के एक ही फोकल प्लेन पर नहीं होना चाहिए)। इन मानदंडों को चुना गया है क्योंकि वे दोनों हमें व्यक्तिपरकता को कम करने और पृष्ठभूमि शोर / ऑटोफ्लोरेसेंस के प्रभाव को नगण्य बनाने देते हैं।

ब्लीमाइसिन एक कट्टरपंथी-आधारित उत्परिवर्तन है जो डीऑक्सीराइबोज पर अत्यधिक विशिष्ट मुक्त कण हमले द्वारा डीएसबी को प्रेरित करता है, बहुत ही समान तरीके से कि कम एलईटी आयनीकरण विकिरण (आईआर) कैसे कार्य करता है। इस प्रकार, ब्लीमाइसिन को रेडियोमिमेटिक एजेंट15 के रूप में परिभाषित किया गया है। चूंकि ब्लीमाइसिन-प्रेरित डीएसबी की एक बड़ी मात्रा लिम्फोसाइटों के प्रसार को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकती है, सबसे खराब परिदृश्य में, एपोप्टोसिस की सक्रियता, एक खुराक की पहचान करने के लिए म्यूटाजेन की कई सांद्रता का परीक्षण करने का सुझाव दिया जाता है जो साइटोटॉक्सिसिटी के परिणामस्वरूप डीएसबी गठन का कारण बन सकता है।

कई अध्ययनों से पता चलता है कि आईआर-प्रेरित डीएसबी की मरम्मत के लिए प्रमुख मार्ग एनएचईजे है, जिसे घाव16,17 के पास 53बीपी1 की उपस्थिति से बढ़ावा दिया जाता है। हालांकि, हालांकि ब्लीमाइसिन के साथ उपचार के बाद 53बीपी1 फॉसी की एक बड़ी मात्रा होने की उम्मीद की जा सकती है, जो आईआर के समान कार्य करता है, हमारे अध्ययन में, हमने 53बीपी1 फॉसी की तुलना में 3एच2एएक्स की उच्च आवृत्ति देखी। H2AX और 53BP1 फॉसी विश्लेषण का मुख्य लाभ जोखिम या रोग संबंधी संदर्भों में सेलुलर प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने की क्षमता पर निर्भर करता है। वास्तव में, यह सर्वविदित है कि 3H2AX और 53BP1 फॉसी आईआर प्रभाव18 के विश्वसनीय और स्थापित मार्कर हैं, साथ ही साथ H2AX फॉसी कीउपस्थिति कैंसर के कई रूपों में एक महत्वपूर्ण रोगसूचक कारक का प्रतिनिधित्व करती है, या, अधिक आम तौर पर, वे DSB घटना को बढ़ाने के लिए एजेंटों या रसायनों की क्षमता निर्धारित करने के लिए सहमति देते हैं। इसके अलावा, डीएसबी वृद्धि और एक निश्चित बीमारी20,21 के बीच संभावित संबंध स्थापित करने के लिए 3H2AX और 53BP1 फॉसी का मूल्यांकन किया जा सकता है, उपचार 22,23 की प्रतिक्रिया के संदर्भ में एक चिकित्सा को सत्यापित करने के लिए, या ट्यूमर रेडियोसंवेदनशीलता 24 का अनुमान लगाने के लिए।

डीएसबी को मापने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हालांकि, लेखकों को यह रेखांकित करना चाहिए कि दोनों विधियों की सीमाएं हैं: मुख्य चिंता इस तथ्य में निहित है कि वे स्वयं डीएसबी का पता नहीं लगाते हैं, लेकिन मरम्मत प्रक्रियाओं में शामिल दो विशिष्ट कारक हैं। इस प्रकार, यह देखते हुए कि मरम्मत कैनेटीक्स अत्यधिक परिवर्तनशील25 है, परिणामों की व्याख्या अस्पष्ट हो सकती है।

हालांकि, वर्तमान अध्ययन इंगित करता है कि दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग एक साथ 3H2AX और 53BP1 फॉसी की मात्रा निर्धारित करने के लिए परिणामों की व्याख्या में कई मुद्दों को जन्म दे सकता है। यह मुख्य रूप से डीएसबी साइटों पर 53बीपी1 की तुलना में 3एच2एएक्स की उच्च उपस्थिति और दो मार्करों के लिए सह-स्थानीयकृत प्रतिदीप्ति संकेतों के निम्न स्तर के कारण है जो हमने ब्लीमाइसिन उपचार के बाद देखा है। दूसरी ओर, हिस्टोन एच 2 ए एक्स सेर -13 9 पर फॉस्फोराइलेटेड रहता है जब तक कि डीएसबी दिखाई नहीं देता है जब तक कि इसकी मरम्मत नहीं की जाती है, जबकि 53 बीपी 1 एक प्रोटीन है जिसे अधिक विशिष्ट परिस्थितियों में भर्ती किया जाता है, उदाहरण के लिए जब केवल एनएचईजे को सक्रिय किया जा सकता है, इसके अलावा, सेल चक्र25 के जी 1 चरण के दौरान 53 बीपी 1 दृढ़ता से प्रमुख है। इसके अलावा, 53BP1 को वास्तव में भर्ती किया गया हो सकता है जहां एक DSB एक साथ हुआ है, लेकिन कम समय के लिए बना रहता है, और इसलिए दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस इसे और एक साथ H2AX को स्थानीयकृत करने में असमर्थ है। हालांकि, अगर शोधकर्ता दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए अधिक उपयुक्त समझता है, जिसके लिए हमने एक विस्तृत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान किया है, तो यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि यह विधि स्वाभाविक रूप से घटना की वास्तविक आवृत्ति को कम कर सकती है, जैसा कि ऊपर वर्णित है। उसी समय, घटना को अधिक महत्व न देने के लिए, सह-स्थानीयकृत 3H2AX और 53BP1 फॉसी को दो अलग-अलग स्थानों के रूप में गिनने से बचना चाहिए क्योंकि यह वास्तव में केवल एक DSB की उपस्थिति को इंगित करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पूरे रक्तदाताओं और सभी स्वास्थ्य कर्मियों के आभारी हैं जिन्होंने रक्त के नमूने लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

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References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

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मानव परिधीय लिम्फोसाइटों में 53बीपी1 और 1 के दोहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस
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Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

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