Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Двойная иммунофлуоресценция γH2AX и 53BP1 в периферических лимфоцитах человека

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

В этом протоколе представлен метод оценки образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем одновременного обнаружения очагов γH2AX и 53BP1 в интерфазных ядрах периферических лимфоцитов человека, обработанных блеомицином.

Abstract

Двухцепочечные разрывы (DSB) являются одним из самых тяжелых поражений, которые могут возникнуть в ядрах клеток, и, если их не восстановить, они могут привести к тяжелым последствиям, включая рак. Таким образом, клетка снабжена сложными механизмами для восстановления DSB, и эти пути включают гистон H2AX в его фосфорилированной форме в Ser-139 (а именно γH2AX) и p53-связывающий белок 1 (53BP1). Поскольку оба белка могут образовывать очаги на участках DSB, идентификация этих маркеров считается подходящим методом для изучения как DSB, так и их кинетики репарации. В соответствии с молекулярными процессами, которые приводят к образованию очагов γH2AX и 53BP1, было бы более полезно исследовать их совместную локализацию вблизи DSB, чтобы создать альтернативный подход, позволяющий количественно оценивать DSB путем одновременного обнаружения двух маркеров повреждения ДНК. Таким образом, этот протокол направлен на оценку геномного повреждения, индуцированного в лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином из-за присутствия очагов γH2AX и 53BP1 в двойной иммунофлуоресценции. Используя эту методологию, мы также очертили изменение количества очагов γH2AX и 53BP1 с течением времени в качестве предварительной попытки изучить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB.

Introduction

Повреждение ДНК постоянно индуцируется агентами, которые могут быть эндогенными, такими как АФК, образующиеся в результате клеточного окислительного метаболизма, или экзогенными, как химическими, так и физическими1. Среди наиболее вредных поражений двухцепочечные разрывы (DSB) играют фундаментальную роль, способствуя геномной нестабильности, поскольку они вызывают хромосомные аберрации, которые, в свою очередь, могут инициировать процесс канцерогенеза. Таким образом, клетки обеспечены сложными и эффективными механизмами репарацииDSB 2.

Когда возникает DSB, клетка запускает реакцию повреждения ДНК (DDR), где вместе с комплексом MRE11 / RAD50 / NBS1 рекрутируются киназы ATM или ATR для активации других белков, которые замедляют или останавливают клеточный цикл3. Важной мишенью этих киназ является гистон H2AX, который фосфорилируется на Ser-139 в пределах нескольких мегабаз от DSB (а именно γH2AX), тем самым позволяя рекрутировать несколько факторов репарации, таких как, среди прочего, BRCA1 и p53-связывающий белок 1 (53BP1)3. Позже запускается один путь между гомологичной рекомбинацией (HR), негомологичным соединением концов (NHEJ) или одноцепочечным отжигом (SSA) для восстановления DSB 4,5. Таким образом, 53BP1 участвует в диктовке выбора между HR или NHEJ, в основном способствуя активации NHEJ, а не HR6. Более того, как фосфорилированная форма гистона H2AX, так и 53BP1 могут образовывать очаги на участках DSB. Поскольку эти очаги сохраняются до тех пор, пока целостность двойной цепи не будет восстановлена, оценка появления/исчезновения очагов γH2AX или 53BP1 в течение интервала времени считается полезным методом оценки возникновения и репарации DSB в клеточной системе 6,7. Однако, согласно описанным выше молекулярным процессам, поскольку ожидается, что очаги γH2AX и 53BP1 будут локализоваться вблизи DSB во время DDR8,9, может быть полезно одновременно обнаруживать присутствие этих маркеров в двойной иммунофлуоресценции.

Таким образом, цель данной рукописи состояла в том, чтобы оценить пригодность одновременного количественного определения очагов γH2AX и 53BP1 для оценки геномных повреждений, индуцированных в периферических лимфоцитах человека радиомиметическим агентом блеомицином. Используя ту же методологию, мы также попытались очертить кинетику репарации блеомицин-индуцированных DSB в соответствии с ранее установленной экспериментальной процедурой10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Исследование было одобрено этическим комитетом Пизанского университета, и от каждого донора было получено информированное и подписанное согласие.

1. Образование очагов γH2AX и 53BP1

  1. Подготовка проб и мутагенная обработка
    1. Соберите образцы цельной крови путем венепункции у здоровых взрослых людей в пробирках для сбора крови (например, Vacutainer), содержащих гепарин лития в качестве антикоагулянта.
    2. Чтобы гарантировать надлежащую сохранность образца крови, начните процедуру в течение 24 часов после забора пробы.
    3. Добавьте 300 мкл образца в пробирку, содержащую 4,7 мл полной среды (0,5% пенициллина-стрептомицина, 0,75% фитогемагглютинина, 10% предварительно инактивированного FBS, 88,75% RPMI 1640).
    4. Затем добавьте блеомицина сульфат до конечной концентрации 5 мкг/мл.
      ВНИМАНИЕ: Блеомицин сульфат является мутагеном. Избегайте контакта с кожей и вдыхания. Приготовьте раствор и добавьте образец под колпак.
    5. Для каждого образца установите отрицательный контроль (отсутствие мутагена).
    6. Поместите трубку в термостат при температуре 37 °C на 2 часа.
  2. Фиксация
    1. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу с помощью вихря.
    3. Добавьте 5 мл гипотонического раствора (2,87 г KCl, растворенного в 500 мл деионизированной воды) и 400 мкл предварительно фиксирующего раствора (5: 3 уксусная кислота: метанол), чтобы вызвать гемолиз эритроцитов.
    4. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 5 мл метанола при комнатной температуре в течение не менее 30 мин, чтобы зафиксировать клетки.
    6. В качестве альтернативы храните ячейки при температуре -20 °C до использования.
  3. Подготовка слайдов
    1. Центрифужные образцы при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 5 мл раствора метанола: уксусной кислоты в соотношении 3:1. Повторите эти действия еще раз.
    3. В конце снова центрифугируют раствор при 540 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Снова аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя достаточное количество раствора (0,5 мл) для ресуспендирования гранулы, энергично пипетку, капните ресуспендированную клеточную гранулу на предметные стекла и высушите на воздухе. Хранить предметные стекла при температуре 4 °C.
  4. Иммунофлюоресценция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресценция представляет собой иммунологический метод идентификации специфических клеточных мишеней с использованием первичного антитела, связывающего саму мишень, и флуоресцентного вторичного антитела, связывающего первичную мишень, что позволяет локализовать мишень11. В этом случае в качестве первичных антител используются мышиный моноклональный анти-53BP1 (1:50) и поликлональный анти-γH2AX кролика (1:50), в то время как AlexaFluor568 анти-мышь (1:400) и DyLight488 анти-кролик (1:200) используются в качестве вторичных антител соответственно.
    1. Промойте предметные стекла два раза в 50 мл 1x PBS в течение 5 минут в банке для муфты (16 слайдов подряд).
    2. Затем держите их в течение 30 мин в блокирующем растворе (10 мл FBS, 10 мл 10x PBS, 80 мл деионизированной воды, 300 мкл Triton-X).
    3. Добавляют к каждому предметному стеклу по 10 мкл каждого из двух растворов, содержащих первичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накройте предметные стекла парафиновой лентой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение ночи.
    4. После инкубации проведите три промывки в 1x PBS в течение 5 мин.
    5. Добавляют к каждому предметному стеклу по 10 мкл каждого из двух растворов, содержащих вторичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накрывают предметные стекла парафином и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч.
    6. Выполните три стирки в 1x PBS в течение 5 минут.
    7. Перед сборкой добавьте 2,5 мкл противозатухающего раствора с DAPI на покровных стеклах, чтобы скрыть ядра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки кинетики очагов процедура аналогична описанной с 1,1 по 1,4, отмечая, что сбор клеток и двойная иммунофлюоресценция выполняются через 0 часов после лечения блеомицином, а затем, после удаления мутагена, через 4 часа, 6 часов и 24 часа после обработки.

2. Анализ с помощью флуоресцентного микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения. Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами, заставляя их излучать свет с более длинными волнами12. AlexaFluor568 и DyLight 488 поглощают свет примерно 568 и 488 нм и излучают свет 603 и 520 нм соответственно. Таким образом, они видны как красная или зеленая флуоресценция с использованием фильтра TRITC или FITC соответственно.

  1. Оцените наличие фокусов на каждом слайде под объективом 100-кратного погружения (рис. 1).
  2. Оцените 200 ядер на предметное стекло и подсчитайте количество очагов γH2AX/53BP1 в каждом ядре.
  3. Экспресс-результаты в пересчете на среднее количество очагов на общее количество набранных ядер. К ним относятся как положительные (показывающие, по крайней мере, один сигнал флуоресценции), так и отрицательные (не показывающие сигнал флуоресценции) ядра γH2AX/53BP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Данные, полученные с помощью флуоресцентного микроскопического анализа периферических лимфоцитов, позволяют оценить три основных аспекта: эффективность лечения блеомицином в увеличении количества очагов γH2AX и 53BP1 (и, следовательно, DSB) за счет его мутагенного эффекта, степень локализации обоих очагов в месте DSB, а также временной ход очагов γH2AX и 53BP1 для определения кинетики репарации блеомицин-индуцированных DSB. Как и ожидалось, очень высокая частота очагов γH2AX и 53BP1 наблюдалась между необработанными и обработанными клетками, тем самым подтверждая, что блеомицин индуцирует образование DSB в периферических лимфоцитах (рис. 2).

Большая разница наблюдалась в количестве очагов двух маркеров; в частности, очаги γH2AX были более многочисленны, чем очаги 53BP1, что указывает на то, что колокализация происходит не всегда и может зависеть от множества факторов (рис. 3).

Что касается кинетики восстановления DSB, прежде всего, важно подчеркнуть, что фактическое восстановление очагов может начаться до первого выбранного момента времени, который составляет 2 часа, и что в различные моменты времени мы можем наблюдать вновь образованные очаги, а также очаги, которые были сформированы ранее и которые еще не были восстановлены.

Принимая во внимание то, что было сказано ранее, временной ход фокусов γH2AX и 53BP1 с течением времени показал разное поведение, хотя они вносят свой вклад в одну и ту же функцию. Очаги γH2AX увеличивались через 2 ч после обработки, а затем они начинали прогрессирующее снижение, не достигая, однако, контрольного значения через 24 ч после лечения. При дисперсии частота очагов 53BP1 увеличивалась до 4 ч после лечения, затем снижалась через 6 ч и возвращалась к наибольшему значению через 24 ч после лечения (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1: Двойная иммунофлюоресценция в периферических лимфоцитах человека для γH2AX и 53BP1: (A) ядра без очагов γH2AX и 53BP1 до лечения блеомицином, (B) и (C) ядра с различным количеством очагов γH2AX и 53BP1 из-за лечения блеомицином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сравнение необработанных и обработанных блеомицином (5 мкг/мл) лимфоцитов для двух маркеров DSB. Полосы погрешностей представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение общего количества (как спонтанного, так и индуцированного мутагеном) очагов γH2AX и 53BP1. Полосы погрешностей представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Кинетика очагов γH2AX и 53BP1. 0 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 24 ч представляют собой разное время сбора лимфоцитов; Полосы погрешностей представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Иммунофлуоресцентный анализ очагов γH2AX и 53BP1 является подходящим методом оценки геномных повреждений в интерфазных ядрах клеточной системы. Эта процедура имеет несколько критических моментов, которые могут повлиять на исход экспериментов, в основном, на агенты, используемые при фиксации и пермеабилизации, тип антител и факторы их разбавления, а также на концентрацию мутагена.

Поддержание целостности белка имеет основополагающее значение, поскольку метод иммунофлуоресценции предполагает идентификацию антигенов, которые в основном являются белками. В этом протоколе метанол используется для фиксации лимфоцитов. Этот этап особенно важен, поскольку спирт действует, вытесняя воду и вызывая осаждение растворимых белков, в то время как другие нефиксированные клеточные компоненты могут быть удалены путем промывки в солевом буферном растворе, таком как PBS13.

Другим ключевым моментом является пермеабилизация, которая выполняется через блокирующий раствор, который в этом случае допускает как пермеабилизацию, так и блокировку. Блокировка осуществляется путем добавления FBS в раствор: он связывает белки в образце и предотвращает связывание антител с неправильной мишенью, поскольку связь между FBS и специфической мишенью антитела впоследствии может быть разорвана из-за высокого сродства между антителом и самой мишенью. Пермеабилизация может быть выполнена с использованием нескольких растворителей, в этом случае используется неионогенное моющее средство Triton X-100: оно интеркалируется в фосфолипидный бислой, солюбилизируя плазматическую мембрану и затем разрушая ее14.

Поскольку выбор эффективных антител γH2AX и 53BP1 имеет решающее значение для успеха иммунофлуоресценции, настоятельно рекомендуется использовать антитела с доказанной надежностью. Также рекомендуется попробовать несколько разведений антител, чтобы определить наиболее эффективную концентрацию.

В качестве предварительных экспериментов мы изучили различные контрольные элементы, чтобы оценить возможный фоновый шум или автофлуоресценцию. Примечательно, что в разных экспериментах мы использовали только первичные антитела, только вторичные антитела, каждое окрашивание индивидуально и без окрашивания. Как и ожидалось, в присутствии только первичных/вторичных антител мы не наблюдали никакого очага, в то время как мы наблюдали либо зеленые, либо красные флуоресцентные пятна (указывающие на наличие очагов γH2AX или 53BP1), когда мы выполняли протокол с каждым пятном в отдельности. Что касается контроля без окрашивания, мы наблюдали фоновый шум / автофлуоресценцию, которая проявляется при диффузном окрашивании. Вместо этого после выполнения протокола иммунофлуоресценции очаги γH2AX или 53BP1 отчетливо видны в коричнево-темных ядрах в виде зеленых или красных сигналов под соответствующим фильтром для используемых флуорохромов (FITC или TRITC). Таким образом, фоновый шум/автофлуоресценция не оказывает существенного влияния на идентификацию очагов, в том числе потому, что мы использовали определенные критерии, чтобы оценить, является ли одно флуоресцентное пятно правильным фокусом (т.е. во время фокусировки микроскопа фокусы γ-H2AX и 53BP1 не должны находиться в одной фокальной плоскости с другими флуоресцентными пятнами, потенциально присутствующими вне ядра клетки). Эти критерии были выбраны потому, что они позволяют снизить субъективность и сделать влияние фонового шума / автофлуоресценции незначительным.

Блеомицин представляет собой мутаген на основе радикалов, который индуцирует DSB за счет высокоспецифичной атаки свободных радикалов на дезоксирибозу, очень похоже на то, как действует низкое ионизирующее излучение (IR) LET. Таким образом, блеомицин определяется как радиомиметический агент15. Поскольку большое количество блеомицин-индуцированных DSB может серьезно повлиять на пролиферацию лимфоцитов, вызывая, в худшем случае, активацию апоптоза, предлагается протестировать несколько концентраций мутагена, чтобы определить дозу, которая может привести к образованию DSB, не приводя к цитотоксичности.

Несколько исследований показывают, что основным путем восстановления ИК-индуцированных DSB является NHEJ, чему способствует присутствие 53BP1 вблизи поражения16,17. Однако, несмотря на то, что можно было бы ожидать большего количества очагов 53BP1 после лечения блеомицином, который действует аналогично IR, в нашем исследовании мы наблюдали более высокую частоту γH2AX, чем очаги 53BP1. Основное преимущество анализа очагов γH2AX и 53BP1 заключается в способности оценивать клеточный ответ как в условиях воздействия, так и в патологическом контексте. На самом деле, хорошо известно, что очаги γH2AX и 53BP1 являются надежными и установленными маркерами ИК-эффектов18, а также наличие очагов γH2AX представляют собой важный прогностический фактор при нескольких формах рака19, или, в более общем плане, они соглашаются определить способность агентов или химических веществ увеличивать возникновение DSB. Кроме того, очаги γH2AX и 53BP1 могут быть оценены для установления возможной взаимосвязи между увеличением DSB и определенным заболеванием20,21, для проверки терапии с точки зрения ответа на лечение 22,23 или для оценки радиочувствительности опухоли 24.

Анализы очагов γH2AX и 53BP1 широко используются для количественной оценки DSB, однако авторы должны подчеркнуть, что оба метода имеют ограничения: основная проблема заключается в том, что они обнаруживают не сами DSB, а два специфических фактора, участвующих в процессах репарации. Таким образом, учитывая, что кинетика репарации сильно варьирует25, интерпретация результатов может быть неоднозначной.

Тем не менее, настоящее исследование показывает, что использование двойной иммунофлуоресценции для одновременного количественного определения очагов γH2AX и 53BP1 может привести к нескольким проблемам в интерпретации результатов. В основном это связано как с более высоким присутствием γH2AX, чем 53BP1, на участках DSB, так и с низкими уровнями совместно локализованных флуоресцентных сигналов для двух маркеров, которые мы наблюдали после лечения блеомицином. С другой стороны, гистон H2AX остается фосфорилированным на Ser-139 с момента появления DSB до его восстановления, в то время как 53BP1 представляет собой белок, который рекрутируется в более специфических условиях, например, когда может быть активирован только NHEJ, также 53BP1 сильно доминирует во время фазы G1 клеточного цикла25. Кроме того, 53BP1 действительно мог быть рекрутирован там, где DSB возник вместе с γH2AX, но сохраняется в течение более короткого времени, и поэтому двойная иммунофлуоресценция не может локализовать его и γH2AX одновременно. Однако, если исследователь считает более целесообразным провести двойную иммунофлуоресценцию, для которой мы предоставили подробный и надежный протокол, важно учитывать, что этот метод по своей сути может привести к недооценке истинной частоты события, как описано выше. В то же время, чтобы не переоценивать событие, следует избегать учета совместно локализованных очагов γH2AX и 53BP1 как двух разных пятен, поскольку это действительно указывает на наличие только одного DSB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы благодарны донорам цельной крови и всему медицинскому персоналу, который взял образцы крови.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 197
Двойная иммунофлуоресценция γH2AX и 53BP1 в периферических лимфоцитах человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter