Summary
Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.
Abstract
Le rotture del doppio filamento (DSB) sono una delle lesioni più gravi che possono verificarsi nei nuclei cellulari e, se non riparate, possono portare a esiti gravi, incluso il cancro. La cellula è quindi dotata di meccanismi complessi per riparare le DSB, e queste vie coinvolgono l'istone H2AX nella sua forma fosforilata a Ser-139 (cioè γH2AX) e p53 binding protein 1 (53BP1). Poiché entrambe le proteine possono formare focolai nei siti delle DSB, l'identificazione di questi marcatori è considerata un metodo adatto per studiare sia le DSB che la loro cinetica di riparazione. Secondo i processi molecolari che portano alla formazione di focolai di γH2AX e 53BP1, potrebbe essere più utile indagare la loro co-localizzazione vicino alle DSB al fine di impostare un approccio alternativo che consenta di quantificare le DSB mediante la rilevazione simultanea di due marcatori di danno al DNA. Pertanto, questo protocollo mira a valutare il danno genomico indotto nei linfociti umani dall'agente radiomimetico bleomicina attraverso la presenza di focolai di γH2AX e 53BP1 in una doppia immunofluorescenza. Utilizzando questa metodologia, abbiamo anche delineato la variazione del numero di focolai di γH2AX e 53BP1 nel tempo, come tentativo preliminare di studiare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina.
Introduction
Il danno al DNA è continuamente indotto da agenti che possono essere endogeni, come i ROS generati dal metabolismo ossidativo cellulare, o esogeni, sia chimici che fisici1. Tra le lesioni più dannose, le rotture a doppio filamento (DSB) svolgono un ruolo fondamentale nel contribuire all'instabilità genomica, poiché causano aberrazioni cromosomiche che a loro volta possono avviare il processo di carcinogenesi. Pertanto, le cellule sono dotate di meccanismi complessi ed efficienti di riparazione dei DSB2.
Quando si verifica un DSB, la cellula innesca la risposta al danno del DNA (DDR) dove, insieme al complesso MRE11 / RAD50 / NBS1, vengono reclutate chinasi ATM o ATR per attivare altre proteine che rallentano o fermano il ciclo cellulare3. Un bersaglio essenziale di queste chinasi è l'istone H2AX, che è fosforilato su Ser-139 entro poche megabasi dai DSB (vale a dire γH2AX), consentendo così il reclutamento di diversi fattori di riparazione come, tra gli altri, BRCA1 e p53 binding protein 1 (53BP1)3. Successivamente, viene attivato un percorso tra ricombinazione omologa (HR), giunzione finale non omologa (NHEJ) o ricottura a singolo filamento (SSA) per riparare i DSB 4,5. Pertanto, 53BP1 è coinvolto nel dettare la scelta tra HR o NHEJ, promuovendo principalmente l'attivazione di NHEJ piuttosto che HR6. Inoltre, sia la forma fosforilata dell'istone H2AX che il 53BP1 possono formare focolai nei siti delle DSB. Poiché questi focolai persistono fino a quando non viene ripristinata l'integrità del doppio filamento, valutare l'aspetto/scomparsa dei focolai di γH2AX o 53BP1 entro un intervallo di tempo è considerato un metodo utile per valutare l'insorgenza e la riparazione di DSB in un sistema cellulare 6,7. Tuttavia, secondo i processi molecolari sopra descritti, poiché ci si aspetta che γH2AX e 53BP1 si co-localizzino vicino ai DSB durante DDR8,9, può essere utile rilevare contemporaneamente la presenza di questi marcatori in una doppia immunofluorescenza.
Pertanto, lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l'idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di γH2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dall'agente radiomimetico bleomicina. Utilizzando la stessa metodologia, abbiamo anche tentato di delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina secondo una procedura sperimentale precedentemente impostata10.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università di Pisa e il consenso informato e firmato è stato ottenuto da ciascun donatore.
1. Formazione di focolai γH2AX e 53BP1
- Preparazione dei campioni e trattamento mutageno
- Raccogliere campioni di sangue intero mediante venipuntura da individui adulti sani in provette di raccolta del sangue (ad esempio, Vacutainer) contenenti eparina di litio come anticoagulante.
- Al fine di garantire una corretta conservazione del campione di sangue, avviare la procedura entro 24 ore dal prelievo.
- Aggiungere 300 μL del campione in una provetta contenente 4,7 mL di terreno completo (0,5% penicillina-streptomicina, 0,75% fitoemoagglutinina, 10% FBS precedentemente inattivato, 88,75% RPMI 1640).
- Quindi aggiungere bleomicina solfato ad una concentrazione finale di 5 μg/ml.
ATTENZIONE: La bleomicina solfato è un mutageno. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Preparare la soluzione e aggiungere il campione sotto un cappuccio. - Per ogni campione, impostare un controllo negativo (assenza di mutageno).
- Posizionare il tubo in un termostato a 37 °C per 2 ore.
- Fissazione
- Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con vortice.
- Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (2,87 g di KCl sciolto in 500 ml di acqua deionizzata) e 400 μL di soluzione prefissativa (acido acetico 5:3: metanolo) per provocare l'emolisi dei globuli rossi.
- Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di metanolo a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per fissare le cellule.
- In alternativa, conservare le celle a -20 °C fino all'uso.
- Preparazione diapositive
- Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di una soluzione di metanolo 3:1: acido acetico. Ripeti questi passaggi ancora una volta.
- Alla fine, centrifugare nuovamente la soluzione a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare nuovamente il surnatante lasciando una soluzione sufficiente (0,5 ml) per risospendere il pellet, pipettare energicamente, far cadere il pellet cellulare risospeso sui vetrini e asciugare all'aria. Conservare i vetrini a 4 °C.
- Immunofluorescenza
NOTA: L'immunofluorescenza è un metodo immunologico per identificare bersagli cellulari specifici utilizzando un anticorpo primario che lega il bersaglio stesso e un anticorpo secondario fluorescente che lega il primario che consente di localizzare il bersaglio11. In questo caso, un monoclonale di topo anti-53BP1 (1:50) e un policlonale di coniglio anti-γH2AX (1:50) sono usati come anticorpi primari, mentre AlexaFluor568 anti-mouse (1:400) e DyLight488 anti-coniglio (1:200) sono usati come anticorpi secondari, rispettivamente.- Lavare i vetrini due volte in 50 ml di 1x PBS per 5 minuti in barattolo di couplin (16 vetrini uno dopo l'altro).
- Quindi tenerli per 30 minuti in soluzione bloccante (10 ml di FBS, 10 ml di 10x PBS, 80 ml di acqua deionizzata, 300 μL di Triton-X).
- Aggiungere a ciascun vetrino 10 μL di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi primari disciolti nella soluzione bloccante. Coprire i vetrini con nastro di paraffina e incubare a 4 °C per una notte.
- Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi in 1x PBS per 5 minuti.
- Aggiungere a ciascun vetrino 10 μL di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari disciolti nella soluzione bloccante. Coprire i vetrini con nastro di paraffina e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Eseguire tre lavaggi in 1x PBS per 5 min.
- Aggiungere 2,5 μL di soluzione antisbiadimento con DAPI sui vetrini di copertura prima del montaggio per controcolorare i nuclei.
NOTA: Al fine di valutare la cinetica dei fuochi, la procedura è la stessa descritta da 1.1 a 1.4, osservando che il prelievo cellulare e la doppia immunofluorescenza vengono eseguiti a 0 ore, dopo 2 ore di trattamento post-bleomicina e quindi, dopo aver rimosso il mutageno, a 4 ore, 6 ore e 24 ore post-trattamento.
2. Analisi al microscopio a fluorescenza
NOTA: "Microscopio a fluorescenza" si riferisce a qualsiasi microscopio che utilizza la fluorescenza per generare un'immagine. Il campione viene illuminato con luce di una specifica lunghezza d'onda (o lunghezze d'onda) che viene assorbita dai fluorofori, inducendoli ad emettere luce di lunghezze d'onda più lunghe12. AlexaFluor568 e DyLight 488 assorbono luce di circa 568 e 488 nm ed emettono luce rispettivamente di 603 e 520 nm. Pertanto, sono visibili come fluorescenza rossa o verde utilizzando rispettivamente un filtro TRITC o FITC.
- Assegna un punteggio alla presenza di fuochi in ogni diapositiva sotto un obiettivo di immersione 100x (Figura 1).
- Assegna un punteggio a 200 nuclei per vetrino e conta il numero di focolai γH2AX/53BP1 in ciascun nucleo.
- Esprimere i risultati in termini di numero medio di focolai per nuclei totali valutati. Questi includono sia γH2AX/53BP1 positivi (che mostrano almeno un segnale di fluorescenza) che negativi (che non mostrano alcun segnale di fluorescenza).
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Representative Results
I dati ottenuti dall'analisi al microscopio a fluorescenza dei linfociti periferici ci permettono di valutare tre aspetti principali: l'efficacia del trattamento con bleomicina nell'aumentare il numero di focolai di γH2AX e 53BP1 (e quindi di DSB) a causa del suo effetto mutageno, in che misura entrambi i focolai sono co-localizzati nel sito delle DSB e il decorso temporale dei focolai di γH2AX e 53BP1 per delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina. Come previsto, è stata osservata una frequenza molto più elevata di focolai di γH2AX e 53BP1 tra cellule non trattate e trattate, confermando così che la bleomicina induce la formazione di DSB nei linfociti periferici (Figura 2).
Una grande differenza è stata osservata nel numero di fuochi dei due marcatori; in particolare, i focolai di γH2AX erano più numerosi dei focolai di 53BP1, indicando così che la co-localizzazione non si verifica sempre e può dipendere da molteplici fattori (Figura 3).
Per quanto riguarda la cinetica di riparazione dei DSB, prima di tutto, è importante sottolineare come la riparazione effettiva dei fuochi possa iniziare prima del primo punto temporale selezionato, che è di 2 ore, e che in vari punti temporali possiamo osservare fuochi appena formati e fuochi che si sono formati in precedenza e che non sono stati ancora riparati.
Tenendo conto di quanto detto in precedenza, il decorso temporale dei fuochi di γH2AX e 53BP1 nel tempo ha mostrato un comportamento diverso sebbene contribuiscano alla stessa funzione. I focolai di γH2AX sono aumentati dopo 2 ore post-trattamento, e poi hanno iniziato una progressiva riduzione, senza però raggiungere il valore di controllo a 24 ore dopo il trattamento. In caso di varianza, la frequenza dei focolai di 53BP1 è aumentata fino a 4 ore dopo il trattamento, quindi è diminuita a 6 ore ed è tornata al valore più alto 24 ore dopo il trattamento (Figura 4).
Figura 1: Doppia immunofluorescenza nei linfociti periferici umani per γH2AX e 53BP1: (A) nuclei senza focolai di γH2AX e 53BP1 prima del trattamento con bleomicina, (B) e (C) nuclei con diverse quantità di focolai di γH2AX e 53BP1 dovuti al trattamento con bleomicina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Confronto tra linfociti non trattati e trattati con bleomicina (5 μg/ml) per i due marcatori DSB. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Confronto tra la quantità totale (sia spontanea che indotta da mutageni) di γH2AX e focolai di 53BP1. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: cinetica dei focolai γH2AX e 53BP1. 0 h, 2 h, 4h, 6 h e 24 h rappresentano i diversi momenti in cui i linfociti sono stati prelevati; le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'analisi di immunofluorescenza dei focolai di γH2AX e 53BP1 è un metodo adatto per valutare il danno genomico nei nuclei interfase di un sistema cellulare. Questa procedura presenta diversi punti critici che possono influenzare l'esito degli esperimenti, principalmente gli agenti utilizzati nella fissazione e permeabilizzazione, il tipo di anticorpi e i loro fattori di diluizione e la concentrazione del mutageno.
Il mantenimento dell'integrità proteica è fondamentale poiché il metodo dell'immunofluorescenza prevede di identificare antigeni che sono principalmente proteine. In questo protocollo, il metanolo viene utilizzato per fissare i linfociti. Questo passaggio è particolarmente importante poiché l'alcol agisce spostando l'acqua e causando la precipitazione delle proteine solubili, mentre gli altri componenti cellulari non fissi possono essere rimossi mediante lavaggio in una soluzione tampone salina, come PBS13.
Un altro passaggio chiave è la permeabilizzazione che viene eseguita attraverso una soluzione di blocco, che in questo caso consente sia la permeabilizzazione che il blocco. Il blocco viene eseguito aggiungendo FBS alla soluzione: lega le proteine nel campione e impedisce agli anticorpi di legare il bersaglio sbagliato poiché il legame tra FBS e il bersaglio specifico dell'anticorpo può essere successivamente rotto a causa dell'elevata affinità tra l'anticorpo e il bersaglio stesso. La permeabilizzazione può essere eseguita utilizzando diversi solventi, in questo caso viene utilizzato il detergente non ionico Triton X-100: si intercala in un doppio strato fosfolipidico, solubilizzando la membrana plasmatica e quindi interrompendola14.
Poiché la scelta di anticorpi γH2AX e 53BP1 efficienti è cruciale per il successo dell'immunofluorescenza, l'uso di anticorpi di provata affidabilità è fortemente raccomandato. Si suggerisce inoltre di provare diverse diluizioni degli anticorpi per identificare la concentrazione più performante.
Come esperimenti preliminari, abbiamo studiato diversi controlli al fine di valutare il possibile rumore di fondo o l'autofluorescenza. In particolare, abbiamo usato, in diversi esperimenti, solo gli anticorpi primari, solo gli anticorpi secondari, ogni macchia individualmente e nessuna colorazione. Come previsto, solo in presenza di anticorpi primari / secondari, non abbiamo osservato alcun focus, mentre abbiamo osservato macchie fluorescenti verdi o rosse (che indicano la presenza di focolai γH2AX o 53BP1) quando abbiamo eseguito il protocollo con ciascuna colorazione individualmente. Per quanto riguarda l'assenza di controlli di colorazione, abbiamo osservato rumore di fondo / autofluorescenza, che si manifesta con colorazione diffusa. Invece, dopo aver eseguito il protocollo di immunofluorescenza, i focolai γH2AX o 53BP1 sono chiaramente visibili nei nuclei marrone-scuro come segnali verdi o rossi sotto il filtro appropriato per i fluorocromi utilizzati (FITC o TRITC). Pertanto, il rumore di fondo/autofluorescenza non influenza in modo significativo l'identificazione dei fuochi, anche perché abbiamo utilizzato criteri specifici per valutare se un punto fluorescente è un focus appropriato (cioè, durante la messa a fuoco del microscopio, i fuochi di γ-H2AX e 53BP1 non dovrebbero essere sullo stesso piano focale di altri punti fluorescenti potenzialmente presenti al di fuori del nucleo cellulare). Questi criteri sono stati scelti in quanto entrambi consentono di ridurre la soggettività e di rendere trascurabile l'impatto del rumore di fondo / autofluorescenza.
La bleomicina è un mutageno a base radicalica che induce DSB dall'attacco altamente specifico dei radicali liberi sul desossiribosio, in modo molto simile a come agiscono le radiazioni ionizzanti (IR) LET basse. Pertanto, la bleomicina è definita come un agente radiomimetico15. Poiché una grande quantità di DSB indotte da bleomicina potrebbe influenzare gravemente la proliferazione dei linfociti innescando, nel peggiore dei casi, l'attivazione dell'apoptosi, si suggerisce di testare diverse concentrazioni del mutageno per identificare una dose che possa portare alla formazione di DSB senza provocare citotossicità.
Diversi studi dimostrano che la via principale per riparare le DSB indotte da IR è la NHEJ, che è promossa dalla presenza di 53BP1 vicino alla lesione16,17. Tuttavia, sebbene ci si possa aspettare che si verifichi una maggiore quantità di focolai di 53BP1 dopo il trattamento con bleomicina, che agisce in modo simile all'IR, nel nostro studio, abbiamo osservato una frequenza più elevata di γH2AX rispetto ai focolai di 53BP1. Il vantaggio principale dell'analisi dei focolai γH2AX e 53BP1 risiede nella capacità di valutare la risposta cellulare sia in contesti di esposizione che patologici. Infatti, è ben noto che i focolai di γH2AX e 53BP1 sono marcatori affidabili e consolidati degli effetti IR18, così come la presenza di focolai di γH2AX rappresentano un importante fattore prognostico in diverse forme di cancro19, o, più in generale, consentono di determinare la capacità di agenti o sostanze chimiche di aumentare l'insorgenza di DSB. Inoltre, i focolai di γH2AX e 53BP1 possono essere valutati per stabilire una possibile relazione tra l'aumento delle DSB e una certa malattia 20,21, per verificare una terapia in termini di risposta al trattamento 22,23, o per stimare la radiosensibilità tumorale 24.
I test dei fuochi γH2AX e 53BP1 sono ampiamente utilizzati per quantificare le DSB, tuttavia, gli autori devono sottolineare che entrambi i metodi hanno dei limiti: la preoccupazione principale consiste nel fatto che non rilevano le DSB stesse, ma due fattori specifici coinvolti nei processi di riparazione. Pertanto, considerando che la cinetica di riparazione è altamente variabile25, l'interpretazione dei risultati potrebbe essere ambigua.
Tuttavia, il presente studio indica che l'uso della doppia immunofluorescenza per quantificare simultaneamente i focolai di γH2AX e 53BP1 potrebbe portare a diversi problemi nell'interpretazione dei risultati. Ciò è dovuto principalmente sia alla maggiore presenza di γH2AX rispetto a 53BP1 nei siti DSB sia ai bassi livelli di segnali di fluorescenza co-localizzati per i due marcatori che abbiamo osservato dopo il trattamento con bleomicina. D'altra parte, l'istone H2AX rimane fosforilato su Ser-139 dal momento in cui appare un DSB fino a quando non viene riparato, mentre 53BP1 è una proteina che viene reclutata in condizioni più specifiche, ad esempio quando solo NHEJ può essere attivato, inoltre, 53BP1 è fortemente dominante durante la fase G1 del ciclo cellulare25. Inoltre, 53BP1 potrebbe essere stato effettivamente reclutato dove si è verificato un DSB insieme a γH2AX, ma persiste per un tempo più breve, e quindi la doppia immunofluorescenza non è in grado di localizzarlo e γH2AX contemporaneamente. Tuttavia, se il ricercatore ritiene più opportuno eseguire una doppia immunofluorescenza, per la quale abbiamo fornito un protocollo dettagliato e affidabile, è importante considerare che questo metodo può intrinsecamente portare a sottostimare la vera frequenza dell'evento, come descritto sopra. Allo stesso tempo, per non sovrastimare l'evento, si dovrebbe evitare di contare i focolai co-localizzati di γH2AX e 53BP1 come due punti diversi poiché indica effettivamente la presenza di un solo DSB.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a tutti i donatori di sangue e a tutto il personale sanitario che ha prelevato i campioni di sangue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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