Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mikrofluidisk model af nekrotiserende enterocolitis, der inkorporerer humane neonatale intestinale enteroider og et dysbiotisk mikrobiom

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en in vitro-model for nekrotiserende enterocolitis (NEC), som kan anvendes til mekanistiske undersøgelser af sygdomspatogenese. Den har en mikrofluidisk chip podet med intestinale enteroider afledt af den humane neonatale tarm, endotelceller og tarmmikrobiomet hos en nyfødt med svær NEC.

Abstract

Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en alvorlig og potentielt dødelig tarmsygdom, der har været vanskelig at studere på grund af dens komplekse patogenese, som forbliver ufuldstændigt forstået. Patofysiologien af NEC omfatter forstyrrelse af tarmtætte kryds, øget tarmbarrierepermeabilitet, epitelcelledød, mikrobiel dysbiose og dysreguleret inflammation. Traditionelle værktøjer til at studere NEC omfatter dyremodeller, cellelinjer og tarmorganoider fra mennesker eller mus. Mens undersøgelser ved hjælp af disse modelsystemer har forbedret feltets forståelse af sygdomspatofysiologi, er deres evne til at rekapitulere kompleksiteten af human NEC begrænset. En forbedret in vitro-model af NEC ved hjælp af mikrofluidisk teknologi, kaldet NEC-on-a-chip, er nu blevet udviklet. NEC-on-a-chip-modellen består af en mikrofluidisk enhed podet med intestinale enteroider afledt af en for tidlig nyfødt, co-dyrket med humane endotelceller og mikrobiomet fra et spædbarn med svær NEC. Denne model er et værdifuldt værktøj til mekanistiske studier af NEC's patofysiologi og en ny ressource til lægemiddelopdagelsestest for neonatale tarmsygdomme. I dette manuskript vil der blive givet en detaljeret beskrivelse af NEC-on-a-chip-modellen.

Introduction

Nekrotiserende enterocolitis (NEC) påvirker for tidligt fødte spædbørn med en forekomst på op til 10% hos dem, der fødes med en vægt < 1500 g1. Patofysiologien af NEC er kompleks og omfatter skader på tarmepitelet, forstyrrelse af tarmtætte kryds, øget tarmbarrierepermeabilitet, immundysregulering og epitelcelledød 2,3. Vores forståelse af de mekanismer, der er involveret i patogenesen af NEC, forbliver ufuldstændig, og på trods af årtiers forskning er der stadig ingen effektive målrettede terapier.

En væsentlig hindring for at fremme NEC-forskning er den begrænsede tilgængelighed og lille størrelse af primært tarmvæv isoleret fra spædbørn. Tarmvæv resekteret fra spædbørn med NEC er ofte nekrotisk og alvorligt beskadiget, hvilket komplicerer undersøgelser af mekanismer, der går forud for sygdomsdebut. For eksempel oversvømmes tyndtarmen hos spædbørn med NEC med immunceller, og et reduceret antal intestinale stamceller, nedsat epitelcelleproliferation og øget epitelcelleapoptose observeres også 4,5,6,7. Dette fører til vanskeligheder med at dyrke intestinale epitelceller fra disse prøver og isolere RNA og proteiner, som kan nedbrydes i dette fjendtlige inflammatoriske miljø. Da sygdomsprocessen allerede er avanceret hos spædbørn med kirurgisk NEC, er mekanistiske undersøgelser af faktorer, der fremkalder sygdom, desuden umulige. Disse begrænsninger har ført til en afhængighed af dyremodeller til mekanistiske undersøgelser af NEC.

Der er etableret dyremodeller af NEC for mus, rotter, smågrise, kaniner og bavianer 5,8,9,11. En styrke ved dyremodeller er, at NEC-lignende tarmsygdom induceres af faktorer forbundet med NEC-debut hos mennesker, herunder et dysbiotisk mikrobiom, gentagne episoder af hypoxi og fraværet af modermælksfoder 5,8,10,11. Derudover er det inflammatoriske respons og patologiske ændringer, der observeres under eksperimentel NEC-parallel human sygdom 5,9,12. Mens disse modeller efterligner mange af funktionerne i human NEC, er der iboende forskelle mellem patofysiologien af NEC hos dyr og mennesker. For eksempel induceres murine model af NEC i mus født på fuld sigt, og selvom deres tarmudvikling er ufuldstændig, er patofysiologien af NEC i sagens natur anderledes i denne kliniske sammenhæng. Murine intestinal genekspression ved fødslen svarer til et præ-levedygtigt menneskefoster og nærmer sig ikke en for tidlig nyfødt på 22-24 ugers svangerskab indtil dag 14 (P14)13. Dette forvirrer murine NEC-modellen, fordi tarmskade generelt ikke kan induceres hos mus efter P10. Derudover mangler indavlede stammer af mus den immunologiske14 og mikrobiologiske mangfoldighed af humane nyfødte15, hvilket tjener som en anden forvirrende faktor. Således forbedrer øget inkorporering af primære humane prøver i NEC-forskning den kliniske relevans af undersøgelser på dette område.

Undersøgelser af mekanismerne i NEC in vitro har traditionelt brugt monotypiske cellelinjer afledt af voksne tarmcancerceller, såsom kolorektal adenocarcinom (Caco2) og humane colon adenocarcinom (HT-29) celler16. Disse modeller er bekvemme, men begrænsede i fysiologisk relevans på grund af deres vækst fra voksne kræftceller, ikke-polariseret arkitektur og fænotypiske ændringer relateret til gentagne passager i kultur. Intestinale enteroider forbedrer disse modeller, da de kan dyrkes fra krypterne i tarmvæv, differentieret i alle tarmepitelundertyper og danne en tredimensionel (3D) villuslignende struktur17,18,19,20. For nylig er intestinale enteroider blevet kombineret med mikrofluidisk teknologi for at udvikle en tyndtarm-på-en-chip-model og give et mere fysiologisk relevant in vitro-modelsystem 21.

De første organ-on-a-chip mikrofluidiske enheder blev introduceret i begyndelsen af 2000'erne22,23,24. Den første organ-on-a-chip-model var den menneskelige vejrtrækning lunge-på-en-chip25. Dette blev efterfulgt af adskillige enkeltorganmodeller som tarm 21, lever 26, nyrer 27, knoglemarv 28, blod-hjernebarriere 29 og hjerte 30. Disse organ-on-a-chip-modeller er blevet brugt til at studere akutte, kroniske og sjældne sygdomme, herunder akut strålingssyndrom,31 kronisk obstruktiv lungesygdom,32 og neurodegenerative sygdomme 33. Den polariserede natur af cellerne på disse chips og tilstedeværelsen af to cellulære rum adskilt af en porøs membran muliggør modellering af komplekse fysiologiske processer såsom perfusion, kemiske koncentrationsgradienter og immuncellekemotakse34,35. Disse mikrofluidiske systemer giver således et nyt værktøj til at studere patofysiologi og mekanismer for menneskelig sygdom.

Tyndtarmen-på-en-chip-modellen blev beskrevet af Kasendra et al. i 2018, der brugte pædiatriske (i alderen 10-14 år) tyndtarmsbiopsiprøver differentieret i enteroider og dyrket på en mikrofluidisk enhed21. Vaskulære endotelceller, kontinuerlig mediestrøm og strækning / afslapning blev også indarbejdet i denne model. De observerede intestinal epitelsubtypedifferentiering, dannelse af 3D villus-lignende akser, slimproduktion og tyndtarmsgenekspressionsmønstre21. Denne mikrofluidiske model blev anvendt på neonatal sygdom med udviklingen af NEC-on-a-chip-systemet, som inkorporerer neonatal intestinal enteroider, endotelceller og mikrobiomet fra en nyfødt med NEC36. NEC-on-a-chip rekapitulerer mange af de kritiske træk ved human NEC, herunder inflammatorisk genekspression, tab af specialiserede epitelceller og reduceret tarmbarrierefunktion36. Således har denne model adskillige anvendelser i undersøgelsen af NEC, herunder mekanistiske undersøgelser og lægemiddelopdagelse. I dette manuskript findes en detaljeret protokol for udførelsen af NEC-on-a-chip-modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enteroider blev afledt af tyndtarmsprøver fra for tidligt fødte spædbørn (født ved 22 til 36 ugers svangerskab) opnået på tidspunktet for operation for NEC eller andre tarmtilstande med ikke-inflammatoriske ætiologier. Al indsamling og behandling af prøver blev udført efter informeret samtykke og godkendelse fra Institutional Review Boards ved Washington University i St. Louis (IRB-protokolnummer 201706182 og 201804040) og University of North Carolina i Chapel Hill (IRB-protokolnummer 21-3134).

1. Isolering og plettering af krypter fra human neonatal tyndtarm for at etablere enteroider

  1. Forberedelse af medierne
    1. Klargør alle nødvendige medier som beskrevet i tabel 1. Sørg for, at der anvendes aseptisk teknik til fremstilling af alle medier. Steriliser mediet filtreres med et 0,2 μm filter og opbevares ved 4 °C indtil brug.
  2. Vask og hakning af tarmvæv
    1. Placer cellekulturmatrixhydrogelen på is for at tø op. Få humant tarmvæv fra operationsstuen. Anbring straks prøven i 5 ml vaskemedie af iskoldt væv for at inaktivere endogene proteaser.
    2. Tarmindholdet skylles med iskold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS) ved hjælp af en 10 ml sprøjte udstyret med en trimmet P1000-pipettespids. Overfør tarmvævet til en 35 mm skål indeholdende 5 ml iskold D-PBS.
    3. Skær tarmvævet i længderetningen for at udsætte lumen, og skær det i små stykker ved hjælp af en fin saks. Skyl tarmvævet ved forsigtigt at omrøre D-PBS i vævskulturskålen.
    4. Overfør vævsfragmenter til en ren 35 mm skål. Hakket væv med fin saks. Den optimale størrelse er 0,5 cm2 pr. Stykke. Tarmvævet skal passere gennem en trimmet 1 ml pipettespids.
  3. Dissociering af tarmvæv
    1. Tilsæt 1 ml forvarmet collagenase I til vævet. Bland væv med kollagenase ved pipettering 10-15 gange, og overfør til et 15 ml konisk rør.
    2. Fastgør røret vandret på en ryster, der er indstillet til 50 o / min. Ryst i 20 min ved stuetemperatur.
    3. Efter inkubationen fjernes rørene fra rysteren, og opløsningen resuspenderes ved pipettering 10-15 gange. Valgfrit: Fjern en lille prøve for at kontrollere tilstedeværelsen af enkelte krypter ved hjælp af fasekontrastmikroskopi.
  4. Isolering af tarmkrypter
    1. Filtrer krypter gennem en 70 μm sil ind i et 50 ml konisk rør på is. Sien vaskes med 9 ml iskoldt vaskemedie. Overfør filtratet til et 15 ml konisk rør.
    2. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt. Der vil være ca. 200 μL medier tilbage i røret. Opslæmm pillen igen i 5 ml af det iskolde vaskemedie.
    3. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender pellet i 1 ml vævsvaskemedie og overfør til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    4. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere krypterne. Supernatanten suges forsigtigt og fuldstændigt så meget som muligt med en pipette. Placer røret på is.
  5. Plating tarmkrypter
    1. Resuspender pellet i cellekulturmatrixhydrogel (20 μL / hul i en 48-brønds vævskulturplade) ved hjælp af en forkølet pipettespids for at fremstille en homogen suspension af krypter, mens røret forbliver på is. Undgå at lave bobler, når du pipetterer. Hold røret på is, indtil det er klar til brug.
      BEMÆRK: Cellekulturmatrixhydrogelen polymeriserer ved temperaturer over 8 °C. Krypter isoleret fra et stykke tarmvæv 0,5 cm-1 cm i længden er generelt belagt i 10 brønde af en 48-brønds vævskulturplade.
    2. Krypt/cellekulturmatrix-hydrogelsuspensionen anbringes i en forvarmet vævskulturplade med 48 brønde. Varm pladen for at hjælpe med størkning af matrixen. Placer suspensionen i midten af brønden. Undgå bobler ved plettering.
    3. Pladerne inkuberes i 20 minutter ved 37 °C for at polymerisere matrixen. Det er vigtigt for cellekulturmatrixhydrogelen at polymerisere fuldt ud, før der tilsættes medier.
    4. Når matrixen polymeriserer, tilsættes 300 μL forvarmede 50% L-WRN-konditionerede medier til hvert hul. Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
    5. Skift medie hver 2. til 3. dag. Udskift med varme 50 % L-WRN-konditionerede medier. Passage hver 7. til 10. dag. Passage enteroider, når de er 50% -90% sammenflydende og udviser knoppedannelse.
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at skifte mediet oftere, hvis det bliver gult. Hyppigheden af passage afhænger af enteroiddensiteten og væksthastigheden for en bestemt patients celler. Enteroider skal passeres, hvis deres centre bliver mørke i udseende.
  6. Passerer enteroiderne
    1. Aspirer forsigtigt medier fra brøndene. Vask forsigtigt brøndene med 500 μL varm D-PBS. Pas på ikke at forstyrre matrixen.
    2. Tilsæt 250 μL koldcellegenvindingsopløsning til hvert hul. Skrab bunden af hvert hul med en frisk pipettespids for at forstyrre cellekulturmatrixhydrogelen. Inkuber pladen på is i 30 min.
    3. Enteroider adskilles ved kraftig pipettering (~25-50 gange med P200-pipette), og der tilsættes 500 μL vævsvaskemedier.
    4. Overfør enteroid suspension til et 15 ml rør og tilsæt yderligere 5 ml vaskemiddel til koldt væv. Pipette forsigtigt for at danne en homogen opløsning.
    5. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere enteroiderne. Anbring røret på is og sug supernatanten så fuldstændigt som muligt. Der vil være ca. 30-60 μL tilbage i røret.
      BEMÆRK: Hvis der er vanskeligheder med at bryde enteroiderne op med pipettering, kan 0,25% trypsin-EDTA eller enzymatisk dissociationsreagens anvendes til at lette denne proces.
    6. Enteroider i restmængden af vaskemedier resuspenderes med en P200-pipette. Undgå bobledannelse under pipettering.
    7. Der tilsættes 20 μL cellekulturmatrixhydrogel pr. ny hul i en 48 brøndplade til enteroidsuspensionen. Opdel enteroiderne 1: 3, 1: 4 eller 1: 5, afhængigt af deres tæthed.
    8. Tilsæt suspensionen til en forvarmet plade med 48 brønde. Pladen inkuberes ved 37 °C i 20 minutter for at størkne matricen.
    9. Efter polymerisation tilsættes 300 μL forvarmede 50% L-WRN-konditionerede medier til hvert hul. Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.

2. Neonatal tarm-på-en-chip model

BEMÆRK: For detaljerede instruktioner om håndtering af mikrofluidiske chips og brug af dette udstyr, se producentens tolvfingertarm-chipkulturprotokol37.

  1. Forberedelse af medierne
    1. Forbered alle nødvendige medier som beskrevet i tabel 2. Sørg for, at der anvendes aseptisk teknik. Steriliser mediet filtreres med et 0,2 μm filter og opbevares ved 4 °C indtil brug.
  2. Dag (-3): Optøning og udvidelse af humane intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMEC'er)
    1. Optø et hætteglas med HIMEC'er og plade i henhold til producentens anbefalinger.
    2. Overtræk en 25 cm 2 kolbe med gelatinebaseret belægningsopløsning i2 min. Fjern overskydende opløsning. Der tilsættes HIMEC'er (ca. 0,5-1 x 10 6 celler) resuspenderet i6 ml HIMEC-medier til kolben. Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
    3. Skift HIMEC-medier hver 48. time. Tilføj HIMEC'er til chippens endotelkanal (nederst) inden for 48-72 timer efter at være blevet 100% sammenflydende.
  3. Dag (-1): Aktivering og belægning af chipsene før tilsætning af enteroiderne
    1. Rekonstituer chipaktiveringsreagens 1 (CR-1) pulver for at fremstille CR-1-opløsning. Sørg for, at CR-1 pulver- og chipaktiveringsreagens 2 (CR-2) opløsning er ved stuetemperatur til dette trin.
      BEMÆRK: Hold CR-1-pulveret og CR-1-opløsningen, der fremstilles i følgende trin, altid beskyttet mod lys. Lyset skal være slukket i emhætten til disse trin.
      1. Placer chippen og chipbæreren i chipholderen, og læg dem derefter i en vævskulturskål i cellekulturhætten. Se producentens protokol for den korrekte teknik til chipplacering i holderen37.
      2. Tilsæt 1 ml CR-2 opløsning til hætteglasset med CR-1 pulver og overfør derefter opløsningen direkte fra CR-1 pulverhætteglasset til et 15 ml rør indpakket i aluminiumsfolie for at beskytte det mod lys. Bland ikke opløsningen med pipetten. Målet er at undgå bobledannelse.
      3. Tilsæt yderligere 1 ml CR-2 opløsning til CR-1 hætteglasset, og overfør til 15 ml røret. Gentag i alt 4 skylninger og i alt 4 ml CR-2 skyllet gennem CR-1 hætteglasset. Tilsæt hætten til hætteglasset og vend den på hovedet til den sidste skylning for at fjerne eventuelt resterende pulver.
      4. Tilsæt yderligere 6 ml CR-2 til 15 ml røret indeholdende CR-1 for et endeligt volumen på 10 ml (0,5 mg / ml). Bland denne opløsning med en pipette uden at indføre bobler. Sørg for, at CR-1 er helt opløst, før du fortsætter til næste trin.
    2. Tilsætning af CR-1-opløsning til chip
      BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at introducere bobler til kanalerne, mens du tilføjer disse løsninger. CR-1-opløsningen skal forblive beskyttet mod lys i dette trin.
      1. Brug en 200 μL pipettespids til at tilføje 20 μL CR-1-opløsning til bundkanalindgangen, indtil opløsningen begynder at forlade bundkanaludløbet. Der tilsættes 50 μL CR-1-opløsning gennem det øverste kanalindtag, indtil opløsningen begynder at forlade den øverste kanaludgang. Fjern overskydende CR-1-opløsning fra overfladen af chippen ved forsigtig aspiration.
        BEMÆRK: Løsninger skal altid føjes til den nederste kanal før den øverste kanal. Hvis der konstateres bobler, skylles begge kanaler med CR-1-opløsning, og 2.3.2.1 gentages.
      2. Hvis låget på vævskulturskålen, der indeholder chipsene, er på plads, skal du fjerne det i dette trin. Placer chips under UV-lys i 15 min. Fjern CR-1 fra den øverste og nederste kanal.
      3. Gentag trin 2.3.2.1 til 2.3.2.2 for i alt to UV-aktiveringstrin. Efter dette trin er chipsene ikke længere lysfølsomme.
      4. Fjern CR-1 fra den øverste og nederste kanal. Begge kanaler vaskes med 100 μL CR-2-opløsning. Fjern CR-2-løsningen fra den øverste og nederste kanal.
      5. Begge kanaler vaskes med 100 μL steril D-PBS. Gentag vaskerne 2x. Der tilsættes 100 μL D-PBS til begge kanaler. Fjern overskydende fra overfladen af chipsene, men lad kanalerne være fulde.
    3. Coat kanaler med den ekstracellulære matrix.
      1. Optø fibronectin, kollagen IV og cellekulturmatrixhydrogel på is umiddelbart før dette trin, og hold disse opløsninger på is i resten af dette afsnit.
      2. Forbered følgende ekstracellulære matrixopløsninger (ECM) til chipens øverste og nederste kanaler:
        Topkanal: 100 μL 200 μg/ml type IV kollagen og 100 μg/ml cellekulturmatrixhydrogel i D-PBS pr. chip.
        Bundkanal: 100 μL 200 μg / ml type IV kollagen og 30 μg / ml fibronectin i D-PBS pr. Chip.
      3. Fjern D-PBS helt fra den øverste og nederste kanal. Tilsæt 50 μL ECM til det nederste kanalindløb, indtil der vises et fald på udløbet. Gentag for den øverste kanal. Sørg for at bruge de relevante ECM-løsninger til hver kanal, og tilføj løsningen til den nederste kanal først.
      4. Der tilsættes D-PBS til spånholderen, og låget på vævskulturpladen sættes på igen. Placer chipsene i en befugtet 37 ° C, 5% CO2 -inkubator natten over.
  4. Dag (0): Seedning af chips med HIMEC'er og enteroider
    1. Vakuum ligevægt af medier
      1. Tilsæt den nødvendige mængde HIMEC-medier og chipudvidelsesmedier for at fuldføre eksperimentet til et sterilt 50 ml konisk rør. Medier bringes i ligevægt til 37 °C i vandbad i mindst 1 time.
      2. Tilslut vakuumfiltreringsanordningen til 50 ml rør, der indeholder opvarmede medier. Rørene skal orienteres med det forvarmede medie i bunden af det 50 ml koniske rør. Vakuum ved -70 kPa eller højere i 10 s.
      3. Vend rørene, så mediet bevæger sig gennem filteret. Fortsæt med at støvsuge i 5 min. Når vakuumfiltreringen er afsluttet, fjernes vakuumfiltreringsanordningen, og de 50 ml medierede rør anbringes i 37 °C-inkubatoren.
    2. Vask af chips
      1. Endotelkanalen vaskes ved at skylle med 100 μL forvarmet HIMEC-medie.
        Epitelkanalen vaskes ved at skylle med 100 μL forvarmede chipudvidelsesmedier. Fjern ethvert medie, der spredes på overfladen af chipsene.
      2. Gentag vasketrinnet. Medier skal forblive i kanalerne samt indløbs- og udløbsportene efter disse skylninger. Udskift låget på kulturskålen, der indeholder chipsene, og vend tilbage til inkubatoren, indtil den er klar til brug.
    3. Høst af HIMEC'er
      1. Aspirationsmedier fra 25 cm2-kolben indeholdende HIMEC'er. Vask monolaget forsigtigt med D-PBS. Tilsæt 2 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA til kolben og skyl forsigtigt over monolaget.
      2. Kolben inkuberes ved 37 °C i 2-5 minutter. Neutraliser trypsin med 10 ml HIMEC-medier. Resuspender celler i medier og overfør til et 15 ml rør.
      3. Spin ved celler 150 x g i 5 min. ved 4 °C. Resuspender celler i 200 μL HIMEC-medier.
      4. Fjern 10 μL celler og læg røret på is. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Den ønskede koncentration af HIMEC'er er 6 x 10 6 til 8 x 106 celler/ml.
    4. Såning af HIMEC'er på chippen
      1. Fjern chippen fra inkubatoren og bring den ind i emhætten. Opsug ethvert medie, der kan have lækket på overfladen af chippen.
      2. Skyl chippens epitelkanal (øverste) med 100 μL forvarmet chipudvidelsesmedie. Skyl chippens endotelkanal (nederst) med 100 μL forvarmet HIMEC-medie.
      3. Genopslæft forsigtigt HIMEC'er for at opnå en homogen fordeling. Fjern mediet helt fra endotelkanalen (nederst). Tilsæt 10 μL HIMEC'er (~36.000 celler/chip) til endotelkanalen (nederst).
        BEMÆRK: Hvis det er vanskeligt at fylde HIMEC-kanalen uden bobledannelse, når du bruger 10 μL HIMEC'er, skal du øge mængden af tilføjede celler. Det skal være det samme antal celler pr. Chip.
      4. Tilføj yderligere organoid vækstmedier til epitelkanalen (øverst), hvis den ikke er fuld. Kontroller såtætheden af HIMEC'erne. Hvis de ikke er jævnt fordelt og ikke dækker 80% -90% af chipoverfladen, skal du skylle kanalen og gentage såningen.
      5. Inverter chippen i chipholderen i cellekulturskålen. Tilsæt D-PBS til reservoiret i chipholderen. Udskift låget til cellekulturskålen og læg det i inkubatoren.
      6. Lad chippen stå omvendt ved 37 °C i 2-3 timer, så HIMEC'er kan fastgøres til chipmembranen. Når inkubationen er afsluttet, sættes spån-/spånholderen tilbage i lodret position.
      7. Vask forsigtigt endotelkanalen (nederst) med 100 μL varmt HIMEC-medie. Lad medier være i kanalen. Vask forsigtigt epitelkanalen (øverst) med 100 μL organoid vækstmedie. Lad medier være i kanalen.
      8. Sæt chips tilbage i 37 °C-inkubatoren, mens du gennemfører de næste trin.
    5. Høstning af enteroider og såning på chip
      BEMÆRK: Chips er podet med enteroider, der blev delt 10-14 dage før, er 50% -75% sammenflydende og ved passage 7 og 20. Se figur 2 for forekomsten af enteroider på dag 0. Den tid, der kræves for enteroider at være klar til såning, afhænger af væksthastigheden for en bestemt patients celler.
      1. Aspirer forsigtigt medier fra brøndene. Vask forsigtigt huller, der indeholder cellekulturmatrixhydrogel, med 500 μL varm D-PBS. Pas på ikke at forstyrre cellekulturmatrixhydrogelen.
      2. Tilsæt 250 μL koldcellegenvindingsopløsning til hvert hul. Skrab bunden af hvert hul med en frisk pipettespids for at forstyrre cellekulturmatrixhydrogel. Tilsæt indholdet af brønde til et koldt 15 ml rør på is.
      3. Inkuber røret på is i 45 min, og vend røret hver 3-5 min. I løbet af dette trin skal du forberede enteroid dissociationsmedier. Dette medie anbringes i 37 °C vandbad, når der er 10 minutter tilbage i inkubationstrinnet.
      4. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere enteroiderne. Supernatanten fjernes.
      5. Der tilsættes 2 ml enteroiddissociationsmedier pr. høstet plade til pelleten, og den anbringes i et 37 °C vandbad i 60 s til 120 s. Rør forsigtigt røret under inkubation. Inkuber længe nok til at opnå fragmenterede enteroider, men uden dissociation i en enkelt cellesuspension.
      6. Efter inkubation tilsættes 10 ml vaskemedie af koldt væv til hvert 15 ml glas. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere enteroiderne. Supernatanten suges helt op.
      7. Opslæm pillen igen i 200 μL spånekspansionsmedier. Dissocier enteroider ved kraftig pipettering (~ 25-50 gange med P200 pipette).
      8. Kombiner celler i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pipette forsigtigt for at danne en homogen opløsning. Målet er at frø chippen med fragmenterede enteroider i små klynger på 10-30 celler.
      9. Fjern 10 μL cellesuspension til tælling. Anbring den resterende cellesuspension på is. Juster volumen af chipudvidelsesmedier for at opnå en koncentration på 6 x 106 celler/ml.
        BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at centrifugere enteroiderne og resuspendere dem i et mindre volumen medier for at opnå den krævede densitet.
      10. Bring de mikrofluidiske chips ind i emhætten og aspirer medierne fra chipens epitelkanal (øverste). Indlæs chippens øverste kanal med 30 μL ophvirvlede celler (~180.000 celler/chip). Sørg for fuldstændig og ensartet dækning af chipens epitelkanal til dannelse af et monolag. Hvis dette ikke opnås, skylles enteroiderne gennem chippen og sås igen.
        BEMÆRK: Hvis der er vanskeligheder med at opnå en ensartet suspension under påfyldning af flere chips, kan enteroiderne adskilles i 40 μL alikvoter i individuelle 1,5 ml mikrocentrifugerør. Dette minimerer variabiliteten i enteroidtallene og fragmentstørrelsen, efterhånden som indlæsningen fortsætter.
      11. Sæt chipsene tilbage i chipsholderen i cellekulturskålen (hvis de er fjernet). Tilsæt D-PBS til reservoiret i chipholderen. Sæt låget på cellekulturskålen, og læg spånerne ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
  5. Dag (1): Klargøring af pods og introduktion af flow til chips
    1. Bring chipsene ind i vævskulturhætten. Skyl forsigtigt epitelkanalen to gange med 100 μL chipudvidelsesmedier. Skyl forsigtigt endotelkanalen to gange med 100 μL HIMEC-medier. Fjern overskydende medier fra chipoverfladen.
    2. Prime pods og regulere i henhold til producentens protokol37. Tilsæt 2 ml passende medier til indløbsbeholderne. Der tilsættes 300 μL af det relevante medie til udløbsbeholderne. Strømningshastigheden vil være 30 μL / h. Stretch vil ikke blive indledt endnu.
  6. Dag (2): Overvågning af monolagsudvikling og medieskift
    1. Sæt kulturmodulet på pause, og bring bælgene ind i emhætten.
    2. Undersøg chips og bælg for bobler. Undersøg epitelmonolaget ved hjælp af et fasekontrastmikroskop. Tag billeder på ensartede steder på tværs af chippen for at overvåge fremskridt. Billede chipsene, mens de forbliver i bælgene.
    3. Fjern mediet fra de øverste kanalindløbsbeholdere, og erstat det med 2 ml spåndifferentieringsmedier. Tilsæt 1 ml HIMEC-medier til den nedre kanals indløbsbeholder. Efterlad nok medier i indløbsreservoirerne for at sikre, at bunden af reservoiret forbliver dækket af et tyndt lag medier.
    4. Sæt bælgene tilbage i kulturmodulet, og genstart flowet ved 30 μL/h.
  7. Dag (3): Overvågning af monolagsudvikling, start af strækning og tilføjelse af medier
    1. Gentag trin 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilføj 1 ml chipdifferentieringsmedier til den øvre kanals indløbsbeholder, og tilføj 1 ml HIMEC-medier til den nedre kanals indløbsreservoir.
      BEMÆRK: Fjern medier fra udløbsbeholderne på begge kanaler, når de begynder at nå 50-75% kapacitet.
    2. Sæt bælgene tilbage i kulturmodulet. Genstart flowet ved 30 μL/h, og start strækning ved 2 % belastning og en frekvens på 0,2 Hz.
  8. Dag (4): Overvågning af monolagsudvikling, øget strækning og tilføjelse af medier
    1. Gentag trin 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilføj 1 ml chipdifferentieringsmedier til den øvre kanals indløbsbeholder, og tilføj 1 ml HIMEC-medier til den nedre kanals indløbsreservoir.
      BEMÆRK: Fjern medier fra udløbsbeholderne på begge kanaler, når de begynder at nå 50-75% kapacitet.
    2. Sæt bælgene tilbage i kulturmodulet. Genstart flowet ved 30 μL/h og øg strækningen til 10 % belastning og en frekvens på 0,2 Hz.
  9. Dag (5) til dag (7): Overvågning af monolagsudvikling og tilføjelse af medier
    1. Gentag trin 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilføj 1 ml chipdifferentieringsmedier til den øvre kanals indløbsbeholder, og tilføj 1 ml HIMEC-medier til den nedre kanals indløbsreservoir.
    2. Sæt bælgene tilbage i kulturmodulet, og genstart flow og stræk. Når villuslignende akser er visualiseret, fortsæt til NEC-on-a-chip-modellen.

3. NEC-on-a-chip-model

  1. Tarmbakterier kultur
    BEMÆRK: Dette trin kræver en prætitreret frossen bestand af enteriske bakterier fra en patient med NEC, der er forberedt forud for initiering af denne protokol. Til disse forsøg blev en tidligere beskrevet polymikrobiel enterisk bakterieopslæmning fra en patient med svær kirurgisk NEC anvendt38.
    1. Lav en 50% glycerolbestand af enteriske bakterier og opbevar i en -80 °C fryser indtil yderligere brug.
    2. Optø en prøve af tarmbakterierne og pod 10 μL i 3 ml Luria-Bertani (LB) medier. Der inkuberes ved 37 °C med omrystning ved 150 o/min natten over.
    3. Samme dag vaskes forsigtigt kanaler med 100 μL forvarmede antibiotikafrie chipdifferentieringsmedier (topkanal) eller 100 μL forvarmede antibiotikafrie HIMEC-medier (nederste kanal). Rør mediet helt og gentag skylningen i i alt 3 vaske.
    4. Efter opsugning af den tredje vask skal du udskifte mediet i kanalerne og lade det være på plads.
    5. Skyl de øverste og nederste kanalindløbsbeholdere med steril D-PBS, og fyld derefter med 3 ml af de relevante antibiotikafrie medier. Prime pods og regulere som i 2.5.2.
    6. Sæt chippen tilbage i kulturmodulet, og start strækning og flow igen.
    7. Den følgende morgen skal du tage 1 ml af bakteriekulturen natten over og pode den i 25 ml friske LB-medier.
    8. Denne nye kultur sættes tilbage på 37 °C-rysteapparatet, indtil OD600 når 0,6 ± 0,02 målt med en 1 cm kuvette. Fortynd bakteriekulturen til 7 x 108 kolonidannende enheder/ml i antibiotikafrie chipudvidelsesmedier.
    9. Gem en prøve af denne kultur for at bekræfte koncentrationen af podestoffet39. Det kan være nødvendigt at justere koncentrationen af bakterierne afhængigt af epitelets respons.
    10. Fjern mediet fra epitelkanalen (øverst). Der tilsættes 30 μL af bakteriekulturen fortyndet i antibiotikafrie chipekspansionsmedier til chippens øverste kanal. Vær meget forsigtig med at undgå krydskontaminering af HIMEC (endotel) kanalen med bakterier. Fjern eventuelle ekstra medier fra chippens overflade.
    11. Lad chipsene forblive under statiske forhold i 30 minutter for at lette bakteriel vedhæftning til den apikale side af det neonatale epitel. Efter inkubationen skylles den øverste kanal med 100 μL antibiotikafrie ekspansionsmedier for at fjerne ikke-bundne bakterier. Sæt chips tilbage i kulturmodulet, og start strækningen og flowet igen.
    12. For hver 24. time fjernes bælgene fra kulturmodulet, og 100 μL antibiotikafrie chipudvidelsesmedier skylles langsomt gennem epitelkanalen. Dette vil hjælpe med at forhindre bakteriel overvækst.

4. Intestinal permeabilitetsanalyse

BEMÆRK: Dette kan udføres på ethvert trin i protokollen. Hvis det initieres, når chips podes, kan tarmpermeabilitetsanalysen bruges til serielt at vurdere enkeltlagssammenløb. Hvis dette assay påbegyndes ved tilsætning af tarmbakterier, kan det bruges til at bestemme tarmbakteriers indflydelse på tarmepitelens monolagsintegritet.

  1. Fjern medier fra indløbsbeholderen til epitelkanalen (øverst). Der tilsættes passende medier indeholdende permeabilitetsfarvestof (50 μg/ml) til indløbsbeholderen. Brug antibiotikafrie chipdifferentieringsmedier til NEC-on-a-chip-modellen.
  2. Opsaml spildevandet fra epitel- og endotelkanalerne hver 24. time. Kvantificer koncentrationen af permeabilitetsfarvestof ved hjælp af en mikropladelæser i henhold til Lanik et al.36.

5. Immunhistokemi

  1. Vask forsigtigt chippens nederste kanal og øverste kanal med 200 μL D-PBS. Helt aspirere D-PBS fra kanalerne.
  2. Fastgør cellerne ved at skylle begge kanaler med 4% paraformaldehyd og efterlade opløsning i kanalerne. Aspirer overskydende fra chipoverfladen. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
  3. Begge kanaler vaskes med 200 μL D-PBS. Lad D-PBS være i den nederste kanal, og fjern den helt fra den øverste kanal.
  4. Permeabiliser epitellaget ved at skylle den øverste kanal med 100 μL 0,1% vaskemiddelopløsning, hvilket efterlader opløsning i kanalerne. Opsug overskydende fra chipoverfladen og inkuber ved stuetemperatur i 45 min.
  5. Begge kanaler vaskes med 200 μL D-PBS. Lad D-PBS være i den nederste kanal, og fjern den helt fra den øverste kanal.
  6. Tilsæt 10% æselserum (eller et passende blokeringsmiddel) til den øverste kanal i 1 time ved stuetemperatur. Begge kanaler vaskes med 200 μL D-PBS. Lad D-PBS være i den nederste kanal, og fjern den helt fra den øverste kanal.
  7. Fortynd primære antistoffer i 5% æselserum og tilsæt til chipens øverste kanal (antistoffer og koncentrationer, der tidligere er testet, er tilgængelige i Lanik et al.36). Der inkuberes ved 4 °C natten over.
  8. Begge kanaler vaskes 3x med 200 μL D-PBS. Lad D-PBS være i den nederste kanal, og fjern den helt fra den øverste kanal.
  9. Fortyndede fluorescerende mærkede sekundære antistoffer fortyndet 1:200 i 5% æselserum i D-PBS og enten Hoechst 33342 eller DAPI (nukleare pletter). Tilføj sekundære antistoffer til chipens øverste kanal. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time, beskyttet mod lys.
  10. Begge kanaler vaskes 3x med 200 μL D-PBS. Lad kanalerne være fyldt med D-PBS efter den sidste vask. Placer chippen i en billedbehandlingsskål med D-PBS til billedoptagelse ved hjælp af konfokal mikroskopi.
    BEMÆRK: Faste chips, enten farvede eller ubejdsede, kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge i PBS. Sørg for, at kanalerne ikke tørrer op i denne periode.

6. Isolering af RNA, fremstilling af cDNA og kvantitativ PCR i realtid

  1. Vask forsigtigt chippens nederste kanal og øverste kanal med 200 μL D-PBS. Helt aspirere D-PBS fra kanalerne.
  2. Uddrag total RNA fra cellerne ved hjælp af et RNA-ekstraktionsreagens i henhold til producentens anvisninger. For kun at isolere RNA fra epitelet, infunderes kun gennem den øverste kanal.
  3. Kvantificer RNA-koncentrationen ved hjælp af et nanovolumenspektrofotometer. Omvendt transskribere 1 μg total RNA. Udfør kvantitativ PCR i realtid. Primere, der tidligere blev brugt i denne model, fås i Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enteroider blev podet på den mikrofluidiske enhed (figur 1) og dyrket som beskrevet ovenfor. Vækst af enteroiderne i cellekulturmatrixhydrogel før såning og derefter den efterfølgende udvidelse af tarmepitelcellemonolaget efter såning af enheden blev overvåget via brightfieldmikroskopi (figur 2). Et sammenflydende tarmepitelcellemonolag dannet og efterfølgende udviklet til en moden 3D villus-lignende struktur (figur 2). Denne mikrofluidiske enhed podet med et enteroidafledt neonatalt tarmepitel og HIMEC'er er kendt som neonatal tarm-på-en-chip model36.

NEC-on-a-chip-modellen blev udviklet til at rekapitulere den mikrobielle dysbiose, der var til stede under neonatal NEC. Denne model inkluderer tilføjelsen af et dysbiotisk mikrobiom fra en nyfødt med svær NEC til neonatal tarm-på-en-chip-model. Med tilføjelsen af dette dysbiotiske mikrobiom øges signifikant ekspressionen af en række proinflammatoriske cytokiner, herunder tumornekrosefaktor alfa (TNFα; Figur 3), interleukin (IL)-1 beta (IL-1β)36 og IL-8 blev påvist 36. Denne stigning i proinflammatoriske cytokiner afspejler, hvad der observeres for human NEC36.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af enteroidkultur og mikrofluidikplatformen. Krypter isoleres fra et kirurgisk resekteret stykke neonatal tarm, og de podes i cellekulturmatrixhydrogel og dyrkes til intestinale enteroider. Enteroider dissocieres og podes i den øverste kanal af mikrofluidikindretningen belagt med ekstracellulær matrix (ECM). Endotelceller (HIMEC'er) tilføjes derefter til bundkanalen. Figur oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Progression af tarmepitelceller dyrket ved hjælp af neonatal tarm-på-en-chip-modellen. Billeder erhvervet ved hjælp af brightfieldmikroskopi demonstrerer neonatal enteroider på dag 0, et epitelcellemonolag i chippen på dag 3 og synlige villuslignende strukturer på dag 7. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. NEC-on-a-chip intestinal epitelcelle TNFα mRNA-ekspression. Sammenligning af TNFα mRNA-niveauer ved inkubation med medier alene (kontrol) eller et dysbiotisk mikrobiom fra et spædbarn med NEC (NEC-on-a-chip) i 24 timer eller 72 timer. **** p < 0,0001 vs. kontrol 24 timer; ** p < 0,005 vs. kontrol 72 timer ved Mann-Whitney U-test. n=9 for kontrol 24 timer n=10 for NEC-on-a-chip 24 timer n=6 for kontrol 72 timer n=5 for NEC-on-a-chip 72 timer. Data er gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Mediesammensætning til kryptisolering og enteroid vækst. Der henvises til Van Dussen et al.40 og Miyoshi et al.41 for detaljerede metoder, der beskriver fremstillingen af L-WRN-konditionerede medier. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2. Mediekomposition til NEC-on-a-chip-modellen. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette NEC-on-a-chip-system er et kraftfuldt nyt værktøj, der kan bruges til at modellere NEC's patofysiologi. Denne platform giver et komplekst mikromiljø, der mere ligner in vivo-tarmmiljøet end tidligere modeller ved at inkorporere et co-kultursystem med kontinuerlig luminal flow og stretch. Disse forhold fremmer udviklingen af 3D villus-lignende arkitektur foret med et stærkt polariseret epitel bestående af modne epitelundertyper og tætte kryds (figur 2)36. Derudover er den apikale epiteloverflade let tilgængelig for eksponering for eksperimentelle stimuli, såsom patientafledt mikrobiota eller ny terapi. Endelig kan denne model også bruges til at studere en række inflammatoriske og ikke-inflammatoriske tarmsygdomme samt mekanismer for normal intestinal epiteludvikling ved at anvende enteroider afledt af de relevante patientpopulationer. Denne model giver mulighed for maksimering af dataindsamling fra en enkelt patientprøve, hvilket er vigtigt i betragtning af den begrænsede tilgængelighed og størrelse af neonatale tarmprøver.

Ved hjælp af denne model blev mange af de fysiologiske ændringer i tarmepitelet, der forekommer under NEC hos spædbørn, observeret. Tilføjelsen af det dysbiotiske mikrobiom fra en patient med svær NEC førte til opregulering af inflammatoriske cytokiner (figur 3), øget tarm-på-en-chip-barrierepermeabilitet, forbedret celledød, nedsat proliferation og tab af modne epitelundertyper36. Således kan fremtidige undersøgelser, der anvender denne model, fokusere på at bestemme de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af NEC og mulige terapeutiske interventioner.

Der er iboende begrænsninger i implementeringen af en kompleks model som NEC-on-a-chip. Dette system kræver specialudstyr, reagenser og træning for at udnytte mikrofluidikplatformen. Derudover kræver modellen nøje opmærksomhed på detaljer med nøjagtig forberedelse af de forskellige medier, korrekt såning af chippen og vedligeholdelse af steril teknik, hvilket er afgørende for succes. Efterforskere skal også have adgang til tarmprøver eller enteroider fra neonatale patienter, som generelt kun er tilgængelige på kvaternære plejecentre med pædiatriske kirurger, medmindre de opnås gennem samarbejdspartnere. Endelig øger inkorporering af yderligere vigtige komponenter i patofysiologien af NEC, såsom immunceller eller hypoxi, yderligere vanskeligheden ved denne model, selvom den psykologiske relevans øges.

Sammenfattende er NEC-on-a-chip et vigtigt fremskridt inden for NEC-forskning, der vil forbedre kvaliteten af mekanistiske undersøgelser og lette testningen af nye lægemidler til NEC. Det ultimative mål med denne forskning er at designe og teste målrettede terapier, der forbedrer resultaterne for spædbørn med tarmbetændelse og NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i forbindelse med dette manuskript.

Acknowledgments

Dette manuskript blev støttet af R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) og R01HD105301 (MG) fra National Institutes of Health, Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), en Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), et UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) gennem generøs støtte fra donorer til University of North Carolina i Chapel Hill, og Institut for Pædiatri ved University of North Carolina i Chapel Hill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Mikrofluidisk model nekrotiserende enterocolitis humane neonatale intestinale enteroider dysbiotisk mikrobiom kompleks patogenese tarmtætte kryds tarmbarrierepermeabilitet epitelcelledød mikrobiel dysbiose dysreguleret inflammation dyremodeller cellelinjer intestinale organoider in vitro-model mikrofluidisk teknologi NEC-on-a-chip for tidlig nyfødt humane endotelceller test af lægemiddelopdagelse
Mikrofluidisk model af nekrotiserende enterocolitis, der inkorporerer humane neonatale intestinale enteroider og et dysbiotisk mikrobiom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter