Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस का माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल जिसमें मानव नवजात आंतों के एंटरोइड्स और एक डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम शामिल हैं

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) के एक इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है, जिसका उपयोग रोग रोगजनन में यंत्रवत अध्ययन के लिए किया जा सकता है। इसमें मानव नवजात आंत, एंडोथेलियल कोशिकाओं और गंभीर एनईसी वाले नवजात शिशु के आंतों के माइक्रोबायोम से प्राप्त आंतों के एंटरोइड्स के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप होती है।

Abstract

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) एक गंभीर और संभावित घातक आंतों की बीमारी है जिसे इसके जटिल रोगजनन के कारण अध्ययन करना मुश्किल हो गया है, जो पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी में आंतों के तंग जंक्शनों का विघटन, आंत बाधा पारगम्यता में वृद्धि, उपकला कोशिका मृत्यु, माइक्रोबियल डिस्बिओसिस और अनियमित सूजन शामिल हैं। एनईसी का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक उपकरणों में पशु मॉडल, सेल लाइनें और मानव या माउस आंतों के ऑर्गेनोइड शामिल हैं। जबकि उन मॉडल प्रणालियों का उपयोग करने वाले अध्ययनों ने रोग पैथोफिज़ियोलॉजी की क्षेत्र की समझ में सुधार किया है, मानव एनईसी की जटिलता को पुन: परिभाषित करने की उनकी क्षमता सीमित है। माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक का उपयोग करके एनईसी का एक बेहतर इन विट्रो मॉडल, जिसे एनईसी-ऑन-ए-चिप नाम दिया गया है, अब विकसित किया गया है। एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल में एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस होता है जो एक अपरिपक्व नवजात शिशु से प्राप्त आंतों के एंटरोइड्स के साथ होता है, मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत होता है और गंभीर एनईसी वाले शिशु से माइक्रोबायोम होता है। यह मॉडल एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी में यंत्रवत अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण है और नवजात आंतों के रोगों के लिए दवा खोज परीक्षण के लिए एक नया संसाधन है। इस पांडुलिपि में, एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल का विस्तृत विवरण प्रदान किया जाएगा।

Introduction

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) प्रीटरम शिशुओं को प्रभावित करता है, जिसमें 1500 ग्राम1 से < वजन वाले पैदा हुए लोगों में 10% तक की घटना होती है। एनईसी का पैथोफिज़ियोलॉजी जटिल है और इसमें आंतों के उपकला को नुकसान, आंतों के तंग जंक्शनों का विघटन, आंत बाधा पारगम्यता में वृद्धि, प्रतिरक्षा विकृति और उपकला कोशिका मृत्यु 2,3 शामिल है। एनईसी के रोगजनन में शामिल तंत्र की हमारी समझ अधूरी है, और दशकों के शोध के बावजूद, अभी भी कोई प्रभावी लक्षित उपचार नहीं हैं।

एनईसी अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा मानव शिशुओं से अलग प्राथमिक आंतों के ऊतकों की सीमित उपलब्धता और छोटे आकार है। एनईसी के साथ शिशुओं से निकाले गए आंतों के ऊतक अक्सर नेक्रोटिक और गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त होते हैं, जो रोग की शुरुआत से पहले तंत्र में अध्ययन को जटिल बनाता है। उदाहरण के लिए, एनईसी वाले शिशुओं की छोटी आंत प्रतिरक्षा कोशिकाओं से भर जाती है, और आंतों की स्टेम कोशिकाओं की कम संख्या, उपकला कोशिका प्रसार में कमी, और उपकला कोशिका एपोप्टोसिस में वृद्धि भी 4,5,6,7 देखी जाती है। इससे इन नमूनों से आंतों के उपकला कोशिकाओं को संवर्धित करने और आरएनए और प्रोटीन को अलग करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, जो इस शत्रुतापूर्ण भड़काऊ वातावरण में खराब हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, चूंकि रोग प्रक्रिया पहले से ही सर्जिकल एनईसी वाले शिशुओं में उन्नत है, इसलिए रोग को प्रेरित करने वाले कारकों में यांत्रिक अध्ययन असंभव हैं। इन सीमाओं ने एनईसी के यांत्रिक अध्ययन के लिए पशु मॉडल पर निर्भरता पैदा की है।

चूहों, चूहों, सूअरों, खरगोशों और बबून 5,8,9,11 के लिए एनईसी के पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं। पशु मॉडल की एक ताकत यह है कि एनईसी जैसी आंतों की बीमारी मनुष्यों में एनईसी की शुरुआत से जुड़े कारकों से प्रेरित होती है, जिसमें एक डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम, हाइपोक्सिया के बार-बार एपिसोड और स्तन के दूध की अनुपस्थिति 5,8,10,11 शामिल है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक एनईसी समानांतर मानव रोग 5,9,12 के दौरान देखी गई भड़काऊ प्रतिक्रिया और पैथोलॉजिकल परिवर्तन। जबकि ये मॉडल मानव एनईसी की कई विशेषताओं की नकल करते हैं, जानवरों और मनुष्यों में एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी के बीच अंतर्निहित अंतर हैं। उदाहरण के लिए, एनईसी का मुराइन मॉडल पूर्णकालिक पैदा हुए चूहों में प्रेरित होता है, और हालांकि उनकी आंतों का विकास अधूरा है, एनईसी का पैथोफिज़ियोलॉजी इस नैदानिक संदर्भ में स्वाभाविक रूप से अलग है। जन्म के समय मुराइन आंतों की जीन अभिव्यक्ति एक पूर्व-व्यवहार्य मानव भ्रूण के समान होती है और 14 वें दिन (पी 14)13 तक 22-24 सप्ताह के गर्भ के अपरिपक्व नवजात शिशु के अनुमानित नहीं होती है। यह मुराइन एनईसी मॉडल को भ्रमित करता है क्योंकि आंतों की चोट आमतौर पर पी 10 के बाद चूहों में प्रेरित नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, चूहों के इनब्रेड उपभेदों में इम्यूनोलॉजिकल14 और मानव नवजात शिशुओं की माइक्रोबायोलॉजिक विविधता15 की कमी होती है, जो एक और भ्रामक कारक के रूप में कार्य करता है। इस प्रकार, एनईसी अनुसंधान में प्राथमिक मानव नमूनों के बढ़ते समावेश से इस क्षेत्र में अध्ययन की नैदानिक प्रासंगिकता में सुधार होता है।

इन विट्रो में एनईसी के तंत्र में अध्ययन ने पारंपरिक रूप से वयस्क आंतों के कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त मोनोटाइपिक सेल लाइनों का उपयोग किया है, जैसे कि कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (कैको 2) और मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा (एचटी -29) कोशिकाएं16। ये मॉडल सुविधाजनक हैं लेकिन वयस्क कैंसर कोशिकाओं, गैर-ध्रुवीकृत वास्तुकला और संस्कृति में बार-बार मार्ग से संबंधित फेनोटाइपिक परिवर्तनों से उनकी वृद्धि के कारण शारीरिक प्रासंगिकता में सीमित हैं। आंतों के एंटरोइड्स उन मॉडलों में सुधार करते हैं क्योंकि उन्हें आंतों के ऊतकों के क्रिप्ट से उगाया जा सकता है, सभी आंतों के उपकला उपप्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, और एक त्रि-आयामी (3 डी) विलस जैसी संरचना 17,18,19,20 बना सकते हैं। हाल ही में, आंतों के एंटरोइड्स को माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के साथ जोड़ा गया है ताकि एक छोटी आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल विकसित किया जा सके और एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल सिस्टम21 प्रदान किया जा सके।

प्रारंभिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 2000 के दशक की शुरुआत में 22,23,24 में पेश किए गए थे। पहला ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडल मानव श्वास फेफड़े-ऑन-ए-चिप25 था। इसके बाद कई एकल-अंग मॉडल जैसे आंत 21, यकृत 26, गुर्दे 27, अस्थि मज्जा 28, रक्त-मस्तिष्क बाधा 29, और हृदय30 थे। इन ऑर्गन-ऑन-ए-चिप मॉडल का उपयोग तीव्र विकिरण सिंड्रोम, 31 क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, 32 और न्यूरोडीजेनेरेटिवरोगों सहित तीव्र, पुरानी और दुर्लभ बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इन चिप्स पर कोशिकाओं की ध्रुवीकृत प्रकृति और एक छिद्रपूर्ण झिल्ली द्वारा अलग किए गए दो सेलुलर डिब्बों की उपस्थिति जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं जैसे छिड़काव, रासायनिक एकाग्रता ग्रेडिएंटऔर प्रतिरक्षा सेल केमोटैक्सिस34,35 के मॉडलिंग की अनुमति देती है। ये माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम इस प्रकार मानव रोग के पैथोफिज़ियोलॉजी और तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करते हैं।

छोटी आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल का वर्णन 2018 में कासेंद्र एट अल द्वारा किया गया था, जिन्होंने बाल चिकित्सा (10-14 वर्ष की आयु) छोटे आंतों की बायोप्सी नमूनों का उपयोग एंटरोइड्स में विभेदित किया और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस21 पर सुसंस्कृत किया। संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं, निरंतर मीडिया प्रवाह, और खिंचाव / विश्राम को भी इस मॉडल में शामिल किया गया था। उन्होंने आंतों के उपकला उपप्रकार भेदभाव, 3 डी विलस जैसी कुल्हाड़ियों का गठन, बलगम उत्पादन और छोटे आंतों के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न21 को देखा। इस माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल को एनईसी-ऑन-ए-चिप प्रणाली के विकास के साथ नवजात रोग पर लागू किया गया था, जिसमें एनईसी36 के साथ नवजात शिशु से आंतों के एंटरोइड्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और माइक्रोबायोम शामिल हैं। एनईसी-ऑन-ए-चिप मानव एनईसी की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है, जिसमें भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति, विशेष उपकला कोशिकाओं का नुकसान और आंत बाधा समारोहमें कमी शामिल है। इस प्रकार, इस मॉडल में एनईसी के अध्ययन में कई अनुप्रयोग हैं, जिसमें यांत्रिक अध्ययन और दवा की खोज शामिल है। इस पांडुलिपि में, एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल के प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एंटरोइड्स को समय से पहले शिशुओं (22 से 36 सप्ताह के गर्भ में पैदा हुए) से छोटे आंतों के नमूनों से प्राप्त किया गया था, जो एनईसी या गैर-भड़काऊ ईटियोलॉजी के साथ अन्य आंतों की स्थिति के लिए सर्जरी के समय प्राप्त किए गए थे। सभी नमूना संग्रह और प्रसंस्करण सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय (आईआरबी प्रोटोकॉल नंबर 201706182 और 201804040) में संस्थागत समीक्षा बोर्डों और चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय (आईआरबी प्रोटोकॉल नंबर 21-3134) से सूचित सहमति और अनुमोदन के बाद किया गया था।

1. एंटरोइड्स स्थापित करने के लिए मानव नवजात छोटी आंत से क्रिप्ट का अलगाव और चढ़ाना

  1. मीडिया की तैयारी
    1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में आवश्यक सभी मीडिया तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सभी मीडिया की तैयारी के लिए सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाता है। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके मीडिया को फ़िल्टर करें और उपयोग तक 4 °C पर स्टोर करें।
  2. आंतों के ऊतकों को धोना और धोना
    1. सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोजेल को पिघलाने के लिए बर्फ पर रखें। ऑपरेटिंग रूम से मानव आंतों के ऊतक प्राप्त करें। अंतर्जात प्रोटीज को निष्क्रिय करने के लिए तुरंत नमूने को बर्फ-ठंडे ऊतक धोने के मीडिया के 5 मिलीलीटर में रखें।
    2. आंतों की सामग्री को बर्फ-ठंडे डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डी-पीबीएस) के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ट्रिम पी 1000 पिपेट टिप के साथ फिट किया जाता है। आंतों के ऊतकों को 35 मिमी डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा डी-पीबीएस होता है।
    3. लुमेन को उजागर करने के लिए आंतों के ऊतकों को अनुदैर्ध्य रूप से काटें, और इसे ठीक कैंची का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में काट लें। ऊतक संवर्धन पकवान में डी-पीबीएस में धीरे से आंदोलन करके आंतों के ऊतकों को कुल्ला करें।
    4. ऊतक के टुकड़ों को एक साफ 35 मिमी डिश में स्थानांतरित करें। बारीक कैंची से ऊतक ों की कीमा। इष्टतम आकार 0.5 सेमी2 प्रति टुकड़ा है। आंतों के ऊतकों को एक छंटनी की गई 1 एमएल पिपेट टिप से गुजरना चाहिए।
  3. आंतों के ऊतकों को अलग करना
    1. ऊतक में 1 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड कोलेजनेस आई जोड़ें। 10-15 बार पाइपिंग करके कोलेजनेस के साथ ऊतक मिलाएं, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 50 आरपीएम पर एक शेकर सेट पर ट्यूब को क्षैतिज रूप से सुरक्षित करें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए हिलाएं।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, शेकर से ट्यूबों को हटा दें, और 10-15 बार पाइप करके समाधान को फिर से निलंबित करें। वैकल्पिक: चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल क्रिप्ट की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक छोटा एलिकोट निकालें।
  4. आंतों के क्रिप्ट का अलगाव।
    1. बर्फ पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 70 μm छन्नी के माध्यम से क्रिप्ट को फ़िल्टर करें। छन्नी को 9 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे ऊतक धोने वाले मीडिया के साथ धोएं। छानना 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और धीरे से सतह पर तैरने वाले को हटा दें। ट्यूब में लगभग 200 μL मीडिया शेष होगा। बर्फ-ठंडे ऊतक धोने वाले मीडिया के 5 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज। 1 एमएल ऊतक धोने के मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. क्रिप्ट्स को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके जितना संभव हो सके सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक और पूरी तरह से एस्पिरेट करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  5. आंतों के क्रिप्ट ्स चढ़ाना।
    1. सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल (48-वेल टिशू कल्चर प्लेट के 20 μL / वेल) में गोली को प्री-चिल्ड पिपेट टिप का उपयोग करके पुन: निलंबित करें ताकि ट्यूब के बर्फ पर रहने के दौरान क्रिप्ट का समरूप निलंबन हो सके। पिपिंग करते समय बुलबुले बनाने से बचें। ट्यूब को उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
      नोट: सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल 8 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर बहुलक होगा। आंतों के ऊतकों के एक टुकड़े से अलग क्रिप्ट 0.5 सेमी -1 सेमी लंबाई में आमतौर पर 48-वेल टिशू कल्चर प्लेट के 10 कुओं में चढ़ाए जाते हैं।
    2. सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल सस्पेंशन को पहले से गर्म 48-वेल टिशू कल्चर प्लेट में प्लेट करें। मैट्रिक्स के जमने में सहायता के लिए प्लेट को गर्म करें। निलंबन को कुएं के केंद्र में रखें। चढ़ाना करते समय बुलबुले से बचें।
    3. मैट्रिक्स को पॉलीमराइज़ करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। मीडिया जोड़ने से पहले सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल को पूरी तरह से पॉलीमराइज करना आवश्यक है।
    4. मैट्रिक्स पॉलीमराइजेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 300 μL पूर्व-गर्म 50% L-WRN वातानुकूलित मीडिया जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटकरें।
    5. हर 2 से 3 दिनों में मीडिया बदलें। गर्म 50% एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया के साथ बदलें। हर 7 से 10 दिनों में पारित होता है। पैसेज एंटरोइड्स तब होते हैं जब वे 50% -90% कंफ्लुएंट होते हैं और कली गठन का प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: मीडिया को अधिक बार बदलने की आवश्यकता हो सकती है यदि यह पीला हो जाता है। पारित होने की आवृत्ति एंटरोइड घनत्व और किसी विशेष रोगी की कोशिकाओं के विकास की दर पर निर्भर करेगी। एंटरोइड्स को पारित करने की आवश्यकता होगी यदि उनके केंद्र दिखने में अंधेरे हो जाते हैं।
  6. एंटरोइड्स को पास करना।
    1. कुओं से मीडिया को धीरे से बाहर निकालें। गर्म डी-पीबीएस के 500 μL के साथ अच्छी तरह से धोएं। मैट्रिक्स को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
    2. प्रत्येक कुएं में 250 μL कोल्ड सेल रिकवरी समाधान जोड़ें। सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल को बाधित करने के लिए प्रत्येक कुएं के तल को एक ताजा पिपेट टिप के साथ खरोंचें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. जोरदार पाइपिंग द्वारा एंटरोइड्स को अलग करें (पी 200 पिपेट के साथ ~ 25-50 गुना) और ऊतक धोने के मीडिया के 500 μL जोड़ें।
    4. एंटरोइड निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और अतिरिक्त 5 एमएल ठंडे ऊतक धोने का मीडिया जोड़ें। एक समरूप घोल बनाने के लिए धीरे से पिपेट।
    5. एंटरोइड्स को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें और सतह पर तैरनेवाला को यथासंभव पूरी तरह से एस्पिरेट करें। ट्यूब में लगभग 30-60 μL शेष होंगे।
      नोट: यदि पाइपिंग के साथ एंटरोइड को तोड़ने में कठिनाइयां हैं, तो इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए या एंजाइमेटिक पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग किया जा सकता है।
    6. पी 200 पिपेट के साथ वॉश मीडिया के अवशिष्ट मात्रा में एंटरोइड्स को पुन: निलंबित करें। पाइपिंग करते समय बुलबुला बनने से बचें।
    7. एंटरोइड सस्पेंशन में 48 वेल प्लेट के प्रति नए कुएं में सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल के 20 μL जोड़ें। एंटरोइड्स को उनके घनत्व के आधार पर 1: 3, 1: 4, या 1: 5 में विभाजित करें।
    8. सस्पेंशन को पहले से गर्म 48-वेल प्लेट में जोड़ें। मैट्रिक्स को ठोस बनाने के लिए प्लेट को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. पोलीमराइजेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 300 μL प्री-वार्म्ड 50% L-WRN वातानुकूलित मीडिया जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटकरें।

2. नवजात आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को संभालने और इस उपकरण का उपयोग करने के बारे में विस्तृत निर्देशों के लिए, कृपया निर्माता के ग्रहणी आंत-चिप संस्कृति प्रोटोकॉल37 देखें।

  1. मीडिया की तैयारी
    1. तालिका 2 में वर्णित के रूप में आवश्यक सभी मीडिया तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सड़न रोकनेवाली तकनीक का उपयोग किया जाता है। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके मीडिया को फ़िल्टर करें और उपयोग तक 4 °C पर स्टोर करें।
  2. दिन (-3): मानव आंतों के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआईएमईसी) को पिघलाना और विस्तारित करना।
    1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एचआईएमईसी और प्लेट की एक शीशी को पिघलाएं।
    2. 2 मिनट के लिए जिलेटिन-आधारित कोटिंग समाधान के साथ 25 सेमी2 फ्लास्क कोट करें। अतिरिक्त घोल निकालें। फ्लास्क में एचआईएमईसी (लगभग 0.5-1 x 10 6 सेल) को एचआईएमईसी मीडिया के6 एमएल में पुन: निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटकरें।
    3. हर 48 घंटे में HIMEC मीडिया बदलें। 100% कंफ्लुएंट बनने के 48-72 घंटे के भीतर चिप के एंडोथेलियल (नीचे) चैनल में एचआईएमईसी जोड़ें।
  3. दिन (-1): एंटरोइड्स को जोड़ने से पहले चिप्स को सक्रिय करना और कोटिंग करना।
    1. सीआर -1 समाधान बनाने के लिए चिप सक्रियण अभिकर्मक 1 (सीआर -1) पाउडर को पुनर्गठित करें। सुनिश्चित करें कि सीआर -1 पाउडर और चिप सक्रियण अभिकर्मक 2 (सीआर -2) समाधान इस चरण के लिए कमरे के तापमान पर हैं।
      नोट: सीआर -1 पाउडर और सीआर -1 समाधान जो निम्नलिखित चरणों में तैयार किया जाता है उसे हर समय प्रकाश से सुरक्षित रखें। इन चरणों के लिए हुड में प्रकाश बंद होना चाहिए।
      1. चिप और चिप वाहक को चिप पालने में रखें, फिर उन्हें सेल कल्चर हुड में एक ऊतक संस्कृति डिश में रखें। वाहक37 में चिप प्लेसमेंट के लिए उचित तकनीक के लिए निर्माता का प्रोटोकॉल देखें।
      2. सीआर -1 पाउडर की शीशी में सीआर -2 समाधान के 1 एमएल जोड़ें और फिर सीआर -1 पाउडर की शीशी से समाधान को सीधे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें ताकि इसे प्रकाश से बचाया जा सके। पिपेट के साथ घोल को न मिलाएं। लक्ष्य बुलबुला गठन से बचना है।
      3. सीआर -1 शीशी में सीआर -2 समाधान का एक और 1 एमएल जोड़ें, और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। सीआर -1 शीशी के माध्यम से कुल 4 मिलीलीटर सीआर -2 कुल्ला और कुल 4 मिलीलीटर के लिए दोहराएं। किसी भी अवशिष्ट पाउडर को हटाने के लिए शीशी में टोपी जोड़ें और अंतिम कुल्ला के लिए इनवर्ट करें।
      4. 10 एमएल (0.5 मिलीग्राम / एमएल) की अंतिम मात्रा के लिए सीआर -1 युक्त 15 एमएल ट्यूब में सीआर -2 का अतिरिक्त 6 एमएल जोड़ें। बुलबुले पेश किए बिना इस घोल को पिपेट के साथ मिलाएं। सुनिश्चित करें कि सीआर -1 अगले चरण में जाने से पहले पूरी तरह से भंग हो गया है।
    2. चिप में सीआर -1 समाधान को जोड़ना
      नोट: इन समाधानों को जोड़ते समय चैनलों में बुलबुले पेश करने से बचना महत्वपूर्ण है। सीआर -1 समाधान इस कदम के लिए प्रकाश से सुरक्षित रहना चाहिए।
      1. 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, नीचे चैनल इनलेट में CR-1 समाधान के 20 μL जोड़ें जब तक कि समाधान नीचे चैनल आउटलेट से बाहर निकलना शुरू न कर दे। शीर्ष चैनल इनलेट के माध्यम से सीआर -1 समाधान के 50 μL जोड़ें जब तक कि समाधान शीर्ष चैनल आउटलेट से बाहर निकलना शुरू न हो जाए। कोमल आकांक्षा द्वारा चिप की सतह से किसी भी अतिरिक्त सीआर -1 समाधान को हटा दें।
        नोट: समाधान हमेशा शीर्ष चैनल से पहले नीचे चैनल में जोड़ा जाना चाहिए। यदि बुलबुले नोट किए जाते हैं, तो सीआर -1 समाधान के साथ दोनों चैनलों को फ्लश करें और 2.3.2.1 दोहराएं।
      2. यदि चिप्स युक्त ऊतक संवर्धन डिश का ढक्कन जगह पर है, तो इस चरण के लिए इसे हटा दें। 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के नीचे चिप्स रखें। CR-1 को ऊपर और नीचे के चैनलों से निकालें।
      3. कुल दो यूवी सक्रियण चरणों के लिए चरण 2.3.2.1 से 2.3.2.2 तक दोहराएं। इस कदम के बाद, चिप्स अब प्रकाश-संवेदनशील नहीं हैं।
      4. CR-1 को ऊपर और नीचे के चैनलों से निकालें। सीआर -2 समाधान के 100 μL के साथ दोनों चैनलों को धो लें। CR-2 समाधान को शीर्ष और निचले चैनलों से निकालें।
      5. बाँझ डी-पीबीएस के 100 μL के साथ दोनों चैनलों को धो लें। धोने को 2 बार दोहराएं। दोनों चैनलों में डी-पीबीएस के 100 μL जोड़ें। चिप्स की सतह से अतिरिक्त निकालें लेकिन चैनलों को भरा छोड़ दें।
    3. बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोट चैनल।
      1. इस चरण से तुरंत पहले बर्फ पर फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन IV, और सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल को पिघलाएं और इस खंड के शेष भाग के लिए इन समाधानों को बर्फ पर रखें।
      2. चिप के शीर्ष और निचले चैनलों के लिए निम्नलिखित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) समाधान तैयार करें:
        शीर्ष चैनल: टाइप IV कोलेजन के 200 μg / mL के 100 μL और D-PBS प्रति चिप में सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल के 100 μg / mL।
        नीचे चैनल: टाइप IV कोलेजन के 200 μg / mL का 100 μl और D-PBS प्रति चिप में फाइब्रोनेक्टिन का 30 μg / mL।
      3. डी-पीबीएस को शीर्ष और निचले चैनलों से पूरी तरह से हटा दें। आउटलेट पर एक बूंद दिखाई देने तक निचले चैनल इनलेट में ईसीएम के 50 μL जोड़ें। ऊपरी चैनल के लिए दोहराएं। प्रत्येक चैनल के लिए उपयुक्त ईसीएम समाधान का उपयोग करना सुनिश्चित करें और समाधान को पहले निचले चैनल में जोड़ें।
      4. चिप पालना जलाशय में डी-पीबीएस जोड़ें और ऊतक संस्कृति प्लेट पर ढक्कन को बदलें। चिप्स को रात भर एक ह्यूमिडिफायर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  4. दिन (0): एचआईएमईसी और एंटरोइड्स के साथ चिप्स सीडिंग
    1. मीडिया का वैक्यूम संतुलन
      1. प्रयोग को पूरा करने के लिए, एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एचआईएमईसी मीडिया और चिप विस्तार मीडिया की आवश्यक मात्रा जोड़ें। कम से कम 1 घंटे के लिए पानी के स्नान में मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक समतुल्य करें।
      2. वैक्यूम निस्पंदन डिवाइस को गर्म मीडिया युक्त 50 एमएल ट्यूबों से कनेक्ट करें। ट्यूबों को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल पर पूर्वगर्म मीडिया के साथ उन्मुख किया जाना चाहिए। 10 सेकंड के लिए -70 kPa या उससे अधिक पर वैक्यूम।
      3. ट्यूबों को फ्लिप करें ताकि मीडिया फ़िल्टर के माध्यम से आगे बढ़े। 5 मिनट के लिए वैक्यूम करना जारी रखें। वैक्यूम निस्पंदन के पूरा होने पर, वैक्यूम निस्पंदन डिवाइस को हटा दें और मीडिया युक्त 50 एमएल ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    2. चिप्स धोना
      1. प्रीवार्म्ड एचआईएमईसी मीडिया के 100 μL के साथ फ्लश करके एंडोथेलियल चैनल को धोएं।
        प्रीवार्म्ड चिप विस्तार मीडिया के 100 μL के साथ फ्लश करके उपकला चैनल को धोएं। चिप्स की सतह पर फैलने वाले किसी भी मीडिया को हटा दें।
      2. धोने के चरण को दोहराएं। मीडिया को इन फ्लश के बाद चैनलों के साथ-साथ इनलेट और आउटलेट पोर्ट में भी रहना चाहिए। चिप्स युक्त कल्चर डिश के ढक्कन को बदलें और उपयोग के लिए तैयार होने तक इनक्यूबेटर पर लौटें।
    3. एचआईएमईसी की कटाई
      1. एचआईएमईसी युक्त 25 सेमी2 फ्लास्क से एस्पिरेट मीडिया। डी-पीबीएस के साथ मोनोलेयर को धीरे से धोएं। फ्लास्क में 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और मोनोलेयर पर धीरे से कुल्ला करें।
      2. फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 एमएल एचआईएमईसी मीडिया के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें। मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 x g कोशिकाओं पर स्पिन करें। HIMEC मीडिया के 200 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
      4. कोशिकाओं के 10 μL निकालें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। HIMECs की वांछित सांद्रता 6 x 10 6से 8 x 106 सेल / एमएल है।
    4. चिप पर एचआईएमईसी सीडिंग
      1. इनक्यूबेटर से चिप निकालें और इसे हुड में लाएं। चिप की सतह पर लीक होने वाले किसी भी मीडिया को एस्पिरेट करें।
      2. चिप के उपकला (शीर्ष) चैनल को 100 μL प्रीवार्मचिप विस्तार मीडिया के साथ फ्लश करें। चिप के एंडोथेलियल (नीचे) चैनल को 100 μL प्रीवार्म्ड HIMEC मीडिया के साथ फ्लश करें।
      3. एक समरूप वितरण प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे एचआईएमईसी को फिर से निलंबित करें। एंडोथेलियल (नीचे) चैनल से मीडिया को पूरी तरह से हटा दें। एंडोथेलियल (नीचे) चैनल में एचआईएमईसी (~ 36,000 कोशिकाओं / चिप) के 10 μL जोड़ें।
        नोट: यदि एचआईएमईसी के 10 μL का उपयोग करते समय बुलबुला गठन के बिना HIMEC चैनल को भरना मुश्किल है, तो जोड़े गए कोशिकाओं की मात्रा बढ़ाएं। यह प्रति चिप कोशिकाओं की समान संख्या होनी चाहिए।
      4. यदि यह पूर्ण नहीं है तो उपकला (शीर्ष) चैनल में अतिरिक्त ऑर्गेनॉइड विकास मीडिया जोड़ें। एचआईएमईसी के सीडिंग घनत्व की जांच करें। यदि वे समान रूप से वितरित नहीं होते हैं और चिप की सतह के 80% -90% को कवर नहीं करते हैं, तो चैनल को फ्लश करें और बीजारोपण को दोहराएं।
      5. सेल कल्चर डिश में चिप पालने में चिप को इनवर्ट करें। चिप पालने में जलाशय में डी-पीबीएस जोड़ें। ढक्कन को सेल कल्चर डिश में बदलें और इसे इनक्यूबेटर में रखें।
      6. चिप को 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा छोड़ दें ताकि एचआईएमईसी चिप झिल्ली से जुड़ सकें। इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, चिप / चिप पालने को एक सीधी स्थिति में वापस कर दें।
      7. धीरे से एंडोथेलियल (नीचे) चैनल को गर्म एचआईएमईसी मीडिया के 100 μL के साथ धोएं। मीडिया को चैनल में छोड़ दें। 100 μL ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडिया के साथ उपकला (शीर्ष) चैनल को धीरे से धोएं। मीडिया को चैनल में छोड़ दें।
      8. अगले चरणों को पूरा करते समय चिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें।
    5. एंटरोइड्स की कटाई और चिप पर बीज बोना।
      नोट: चिप्स को एंटरोइड्स के साथ बीज दिया जाता है जो 10-14 दिन पहले विभाजित होते हैं, 50% -75% कॉन्फ्लुएंट होते हैं, और मार्ग 7 और 20 पर। कृपया दिन 0 पर एंटरोइड्स की उपस्थिति के लिए चित्रा 2 देखें। सीडिंग के लिए एंटरोइड्स के तैयार होने के लिए आवश्यक समय किसी विशेष रोगी की कोशिकाओं के विकास की दर पर निर्भर करेगा।
      1. कुओं से मीडिया को धीरे से बाहर निकालें। गर्म डी-पीबीएस के 500 μL के साथ सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल युक्त कुओं को ध्यान से धोएं। सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
      2. प्रत्येक कुएं में 250 μL कोल्ड सेल रिकवरी समाधान जोड़ें। सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल को बाधित करने के लिए प्रत्येक कुएं के तल को एक ताजा पिपेट टिप के साथ खरोंचें। बर्फ पर एक ठंडी 15 एमएल ट्यूब में कुओं की सामग्री जोड़ें।
      3. 45 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें, और हर 3-5 मिनट में ट्यूब को इनवर्ट करें। इस चरण के दौरान, एंटरोइड पृथक्करण मीडिया तैयार करें। इस मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें जब इनक्यूबेशन चरण में 10 मिनट शेष हों।
      4. एंटरोइड्स को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
      5. गोली में प्रति कटाई प्लेट में 2 एमएल एंटरोइड पृथक्करण मीडिया जोड़ें और 60 सेकंड से 120 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। इनक्यूबेशन के दौरान धीरे से घुमाने वाली ट्यूब। खंडित एंटरोइड्स को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समय तक इनक्यूबेट करें लेकिन एकल सेल निलंबन में पृथक्करण के बिना।
      6. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 15 एमएल ट्यूब में 10 एमएल ठंडे ऊतक धोने का मीडिया जोड़ें। एंटरोइड्स को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
      7. चिप विस्तार मीडिया के 200 μL में गोली को पुन: निलंबित करें। जोरदार पाइपिंग द्वारा एंटरोइड्स को अलग करें (पी 200 पिपेट के साथ ~ 25-50 गुना)।
      8. कोशिकाओं को एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। एक समरूप घोल बनाने के लिए धीरे से पिपेट। लक्ष्य 10-30 कोशिकाओं के छोटे समूहों में खंडित एंटरोइड्स के साथ चिप को बीज देना है।
      9. गिनती के लिए सेल निलंबन के 10 μL निकालें। शेष सेल निलंबन को बर्फ पर रखें। 6 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए चिप विस्तार मीडिया की मात्रा को समायोजित करें।
        नोट: एंटरोइड्स को सेंट्रीफ्यूज करना और आवश्यक घनत्व प्राप्त करने के लिए उन्हें मीडिया की एक छोटी मात्रा में फिर से निलंबित करना आवश्यक हो सकता है।
      10. माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को हुड में लाएं और चिप के उपकला (शीर्ष) चैनल से मीडिया को अलग करें। चिप के शीर्ष चैनल को 30 μL पुन: निलंबित कोशिकाओं (~ 180,000 कोशिकाओं / चिप) के साथ लोड करें। एक मोनोलेयर के गठन के लिए चिप के उपकला चैनल का पूर्ण और समान कवरेज सुनिश्चित करें। यदि यह हासिल नहीं होता है, तो चिप के माध्यम से एंटरोइड्स को कुल्ला करें और फिर से बीज दें।
        नोट: यदि कई चिप्स लोड करते समय एक समान निलंबन प्राप्त करने में कठिनाइयां हैं, तो एंटरोइड्स को व्यक्तिगत 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 40 μL एलिकोट में विभाजित किया जा सकता है। यह लोडिंग की प्रगति के रूप में एंटरोइड संख्या और टुकड़े के आकार में परिवर्तनशीलता को कम करेगा।
      11. चिप्स को सेल कल्चर डिश में चिप क्रैडल में वापस करें (यदि उन्हें हटा दिया गया है)। चिप पालने में जलाशय में डी-पीबीएस जोड़ें। सेल कल्चर डिश में ढक्कन बदलें, और चिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर रखें।
  5. दिन (1): फली तैयार करना और चिप्स में प्रवाह का परिचय देना
    1. चिप्स को ऊतक संस्कृति हुड में लाएं। चिप विस्तार मीडिया के 100 μL के साथ उपकला चैनल को दो बार धीरे से फ्लश करें। धीरे से एंडोथेलियल चैनल को एचआईएमईसी मीडिया के 100 μL के साथ दो बार फ्लश करें। चिप की सतह से अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल37 के अनुसार प्राइम पॉड्स और विनियमन। इनलेट जलाशयों में 2 एमएल उपयुक्त मीडिया जोड़ें। आउटलेट जलाशयों में उपयुक्त मीडिया के 300 μL जोड़ें। प्रवाह दर 30 μL / घंटा होगी। खिंचाव अभी शुरू नहीं किया जाएगा।
  6. दिन (2): मोनोलेयर विकास और बदलते मीडिया की निगरानी
    1. संस्कृति मॉड्यूल को रोकें और फली को हुड में लाएं।
    2. बुलबुले के लिए चिप्स और फली का निरीक्षण करें। एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उपकला मोनोलेयर की जांच करें। प्रगति की निगरानी के लिए चिप में लगातार स्थानों में छवियों को कैप्चर करें। फली में रहने के दौरान चिप्स की छवि बनाएं।
    3. ऊपरी चैनल इनलेट जलाशयों से मीडिया को हटा दें और इसे 2 एमएल चिप भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। निचले चैनल इनलेट जलाशय में एचआईएमईसी मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए इनलेट जलाशयों में पर्याप्त मीडिया छोड़ दें कि जलाशय का तल मीडिया की एक पतली परत से ढका रहे।
    4. फली को संस्कृति मॉड्यूल में वापस करें और 30 μL / h पर प्रवाह को पुनरारंभ करें।
  7. दिन (3): मोनोलेयर विकास की निगरानी, खिंचाव शुरू करना और मीडिया को जोड़ना
    1. चरण 2.6.1.1 दोहराएँ। और 2.6.1.2. ऊपरी चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल चिप भेदभाव मीडिया जोड़ें और निचले चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल एचआईएमईसी मीडिया जोड़ें।
      नोट: 50-75% क्षमता तक पहुंचने के बाद दोनों चैनलों के आउटलेट जलाशयों से मीडिया को हटा दें।
    2. पॉड्स को कल्चर मॉड्यूल में वापस करें। 30 μL / h पर प्रवाह को पुनरारंभ करें, और 2% तनाव और 0.2 हर्ट्ज की आवृत्ति पर खिंचाव शुरू करें।
  8. दिन (4): मोनोलेयर विकास की निगरानी, खिंचाव बढ़ाना, और मीडिया जोड़ना
    1. चरण 2.6.1.1 दोहराएँ। और 2.6.1.2. ऊपरी चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल चिप भेदभाव मीडिया जोड़ें और निचले चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल एचआईएमईसी मीडिया जोड़ें।
      नोट: 50-75% क्षमता तक पहुंचने के बाद दोनों चैनलों के आउटलेट जलाशयों से मीडिया को हटा दें।
    2. पॉड्स को कल्चर मॉड्यूल में वापस करें। 30 μL / h पर प्रवाह को पुनरारंभ करें और खिंचाव को 10% तनाव और 0.2 हर्ट्ज की आवृत्ति तक बढ़ाएं।
  9. दिन (5) से दिन (7): मोनोलेयर विकास की निगरानी और मीडिया को जोड़ना
    1. चरण 2.6.1.1 दोहराएँ। और 2.6.1.2. ऊपरी चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल चिप भेदभाव मीडिया जोड़ें और निचले चैनल इनलेट जलाशय में 1 एमएल एचआईएमईसी मीडिया जोड़ें।
    2. फली को संस्कृति मॉड्यूल में वापस करें, और प्रवाह और खिंचाव को पुनरारंभ करें। एक बार विलस जैसी कुल्हाड़ियों की कल्पना करने के बाद, एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल पर आगे बढ़ें।

3. एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल

  1. आंतों के बैक्टीरिया संस्कृति
    नोट: इस चरण के लिए एनईसी के साथ एक रोगी से एंटरिक बैक्टीरिया के पूर्व-टाइटेटेड जमे हुए स्टॉक की आवश्यकता होती है जो इस प्रोटोकॉल को शुरू करने से पहले तैयार किया जाता है। इन प्रयोगों के लिए, गंभीर सर्जिकल एनईसी के साथ एक रोगी से पहले वर्णित पॉलीमाइक्रोबियल एंटरिक बैक्टीरिया घोलका उपयोग किया गया था।
    1. एंटरिक बैक्टीरिया का 50% ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    2. आंतों के बैक्टीरिया के एलिकोट को पिघलाएं और 10 μL को 3 मिलीलीटर लुरिया-बर्टानी (एलबी) मीडिया में टीका लगाएं। रात भर 150 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. उसी दिन, प्री-वार्म्ड एंटीबायोटिक-फ्री चिप भेदभाव मीडिया (शीर्ष चैनल) के 100 μL या पूर्व-गर्म एंटीबायोटिक मुक्त HIMEC मीडिया (निचला चैनल) के 100 μL के साथ चैनलों को धीरे से धोएं। माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और कुल 3 वॉश के लिए फ्लश दोहराएं।
    4. तीसरी बार धोने के बाद, चैनलों में मीडिया को बदलें और जगह छोड़ दें।
    5. बाँझ डी-पीबीएस के साथ शीर्ष और निचले चैनल इनलेट जलाशयों को कुल्ला करें और फिर उपयुक्त एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया के 3 एमएल से भरें। प्राइम पॉड्स और रेगुलेट 2.5.2 के रूप में।
    6. चिप को संस्कृति मॉड्यूल में वापस करें, और खिंचाव और प्रवाह को फिर से शुरू करें।
    7. अगली सुबह, रात भर बैक्टीरिया कल्चर का 1 एमएल लें और इसे 25 एमएल ताजा एलबी मीडिया में टीका लगाएं।
    8. इस नई संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में वापस करें जब तक कि ओडी600 1 सेमी क्यूवेट का उपयोग करके मापा गया 0.6 ± 0.02 तक न पहुंच जाए। एंटीबायोटिक-मुक्त चिप विस्तार मीडिया में बैक्टीरिया कल्चर को 7 x 108 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों / एमएल तक पतला करें।
    9. इनोकुलम39 की एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए इस संस्कृति का एक एलिकोट बचाएं। एपिथेलियम की प्रतिक्रिया के आधार पर बैक्टीरिया की एकाग्रता को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है।
    10. उपकला (शीर्ष) चैनल से मीडिया को हटा दें। चिप के शीर्ष चैनल में एंटीबायोटिक-मुक्त चिप विस्तार मीडिया में पतला बैक्टीरिया संस्कृति के 30 μL जोड़ें। बैक्टीरिया के साथ एचआईएमईसी (एंडोथेलियल) चैनल के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए बहुत सावधान रहें। चिप की सतह से किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
    11. नवजात उपकला के एपिकल पक्ष के जीवाणु पालन की सुविधा के लिए चिप्स को 30 मिनट के लिए स्थिर परिस्थितियों में रहने दें। इनक्यूबेशन के बाद, असंबद्ध बैक्टीरिया को हटाने के लिए 100 μL एंटीबायोटिक-मुक्त विस्तार मीडिया के साथ शीर्ष चैनल को फ्लश करें। चिप्स को संस्कृति मॉड्यूल में वापस करें और खिंचाव और प्रवाह को फिर से शुरू करें।
    12. हर 24 घंटे में, कल्चर मॉड्यूल से पॉड्स को हटा दें, और धीरे-धीरे एपिथेलियल चैनल के माध्यम से एंटीबायोटिक-मुक्त चिप विस्तार मीडिया के 100 μL को फ्लश करें। यह बैक्टीरिया अतिवृद्धि को रोकने में सहायता करेगा।

4. आंतों की पारगम्यता परख

नोट: यह प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी चरण में किया जा सकता है। यदि चिप्स को बीज दिया जाता है, तो आंतों की पारगम्यता परख का उपयोग मोनोलेयर संगम का क्रमिक रूप से आकलन करने के लिए किया जा सकता है। यदि आंतों के बैक्टीरिया के अतिरिक्त शुरू किया जाता है, तो इस परख का उपयोग आंत उपकला मोनोलेयर अखंडता पर आंतों के बैक्टीरिया के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

  1. उपकला (शीर्ष) चैनल के लिए इनलेट जलाशय से मीडिया को हटा दें। इनलेट जलाशय में पारगम्यता डाई (50 μg / mL) युक्त उपयुक्त मीडिया जोड़ें। एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल के लिए एंटीबायोटिक-मुक्त चिप भेदभाव मीडिया का उपयोग करें।
  2. हर 24 घंटे में उपकला और एंडोथेलियल चैनलों से अपशिष्ट एकत्र करें। लैनिक एट अल.36 के अनुसार माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके पारगम्यता डाई की एकाग्रता को निर्धारित करें।

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. चिप के निचले चैनल और शीर्ष चैनल को 200 μL D-PBS के साथ धीरे से धोएं। चैनलों से डी-पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें।
  2. चैनलों में समाधान छोड़ते हुए, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ दोनों चैनलों को फ्लश करके कोशिकाओं को ठीक करें। चिप की सतह से अतिरिक्त एस्पिरेट करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  3. डी-पीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनल धोएं। डी-पीबीएस को नीचे के चैनल में छोड़ दें और शीर्ष चैनल से पूरी तरह से हटा दें।
  4. चैनलों में घोल छोड़ते हुए, 0.1% डिटर्जेंट घोल के 100 μL के साथ शीर्ष चैनल को फ्लश करके उपकला परत को परमेबिलाइज करें। चिप की सतह से अतिरिक्त एस्पिरेट करें, और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  5. डी-पीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनल धोएं। डी-पीबीएस को नीचे के चैनल में छोड़ दें और शीर्ष चैनल से पूरी तरह से हटा दें।
  6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए शीर्ष चैनल में 10% गधा सीरम (या एक उपयुक्त अवरोधक एजेंट) जोड़ें। डी-पीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनल धोएं। डी-पीबीएस को नीचे के चैनल में छोड़ दें और शीर्ष चैनल से पूरी तरह से हटा दें।
  7. 5% गधे सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और चिप के शीर्ष चैनल में जोड़ें (पहले परीक्षण किए गए एंटीबॉडी और सांद्रता लैनिक एट अल .36 में उपलब्ध हैं)। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. डी-पीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनलों को 3x धोएं। डी-पीबीएस को नीचे के चैनल में छोड़ दें और शीर्ष चैनल से पूरी तरह से हटा दें।
  9. फ्लोरोसेंट-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी को डी-पीबीएस में 5% गधे सीरम में 1:200 पतला किया गया और या तो होचस्ट 33342 या डीएपीआई (परमाणु दाग)। चिप के शीर्ष चैनल में द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  10. डी-पीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनलों को 3x धोएं। अंतिम धोने के बाद डी-पीबीएस से भरे चैनल छोड़ दें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि अधिग्रहण के लिए डी-पीबीएस के साथ एक इमेजिंग डिश में चिप रखें।
    नोट: फिक्स्ड चिप्स, या तो दाग या बिना दाग के, पीबीएस में 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि इस अवधि के दौरान चैनल सूख न जाएं।

6. आरएनए का अलगाव, सीडीएनए की तैयारी, और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर

  1. चिप के निचले चैनल और शीर्ष चैनल को 200 μL D-PBS के साथ धीरे से धोएं। चैनलों से डी-पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग करके कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालें। केवल एपिथेलियम से आरएनए को अलग करने के लिए, केवल शीर्ष चैनल के माध्यम से इंजेक्ट करें।
  3. नैनो-वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। कुल आरएनए के 1 μg को रिवर्स-ट्रांसक्राइब करें। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर निष्पादित करें। इस मॉडल में पहले इस्तेमाल किए गए प्राइमर लानिक एट अल 36 में उपलब्ध हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एंटरोइड्स को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (चित्रा 1) पर बीज दिया गया था और ऊपर वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया था। बीज बोने से पहले सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल में एंटरोइड्स की वृद्धि और फिर डिवाइस को सीडिंग के बाद आंतों के उपकला कोशिका मोनोलेयर के बाद के विस्तार की निगरानी ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) के माध्यम से की गई थी। आंतों के उपकला कोशिका मोनोलेयर का गठन और बाद में एक परिपक्व 3 डी विलस जैसी संरचना में विकसित हुआ (चित्रा 2)। एंटरोइड-व्युत्पन्न नवजात आंतों के उपकला और एचआईएमईसी के साथ बीजित इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को नवजात आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल36 के रूप में जाना जाता है।

एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल को नवजात एनईसी के दौरान मौजूद माइक्रोबियल डिस्बिओसिस को पुन: उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था। इस मॉडल में गंभीर एनईसी वाले नवजात शिशु से नवजात आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल में एक डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम को जोड़ना शामिल है। इस डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम के अलावा, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ) सहित प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की एक सरणी की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई है; चित्रा 3), इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 बीटा (आईएल -1 ) 36, और आईएल -8 36 का पता लगाया गया था। प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स में यह वृद्धि मानव एनईसी36 के लिए देखी गई है।

Figure 1
चित्रा 1: एंटरोइड संस्कृति और माइक्रोफ्लुइडिक्स प्लेटफॉर्म का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। क्रिप्ट्स को नवजात आंत के शल्य चिकित्सा से निकाले गए टुकड़े से अलग किया जाता है, और उन्हें सेल कल्चर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल में बीज दिया जाता है और आंतों के एंटरोइड्स में उगाया जाता है। एंटरोइड्स को बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ लेपित माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस के शीर्ष चैनल में अलग और बीज दिया जाता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआईएमईसी) को तब निचले चैनल में जोड़ा जाता है। Biorender.com के साथ बनाई गई आकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नवजात आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल का उपयोग करके विकसित आंतों के उपकला कोशिकाओं की प्रगति। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की गई छवियों में दिन 0 पर नवजात एंटरोइड्स, दिन 3 पर चिप में एक उपकला कोशिका मोनोलेयर और दिन 7 पर दिखाई देने वाली विलस जैसी संरचनाएं दिखाई देती हैं। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. एनईसी-ऑन-ए-चिप आंतों के उपकला कोशिका टीएनएफ एमआरएनए अभिव्यक्ति। 24 घंटे या 72 घंटे के लिए एनईसी (एनईसी-ऑन-ए-चिप) के साथ एक शिशु से इनक्यूबेशन पर पर टीएनएफ एमआरएनए स्तरों की तुलना <एनईसी (एनईसी-ऑन-ए-चिप) के साथ की जाती है। ** मैन-व्हिटनी यू परीक्षण द्वारा पी < 0.005 बनाम नियंत्रण 72 घंटे। नियंत्रण के लिए एन = 9 24 घंटे; एनईसी-ऑन-ए-चिप 24 घंटे के लिए एन = 10; नियंत्रण के लिए एन = 6 72 घंटे; एनईसी-ऑन-ए-चिप 72 घंटे के लिए एन = 5। डेटा का मतलब SEM ± है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1. क्रिप्ट अलगाव और एंटरोइड विकास के लिए मीडिया संरचना। एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया की तैयारी का वर्णन करने वाले विस्तृत तरीकों के लिए वैन डुसेन एट अल.40 और मियोशी एट अल.41 देखें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2. एनईसी-ऑन-ए-चिप मॉडल के लिए मीडिया संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह एनईसी-ऑन-ए-चिप सिस्टम एक शक्तिशाली नया उपकरण है जिसका उपयोग एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। यह मंच एक जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है जो निरंतर ल्यूमिनल प्रवाह और खिंचाव के साथ सह-संस्कृति प्रणाली को शामिल करके पिछले मॉडल की तुलना में विवो आंतों के वातावरण में अधिक निकटता से मिलता जुलता है। ये स्थितियां परिपक्व उपकला उप-प्रकारों और तंग जंक्शनों से युक्त एक अत्यधिक ध्रुवीकृत उपकला द्वारा पंक्तिबद्ध 3 डी विलस जैसी वास्तुकला के विकास को बढ़ावा देती हैं (चित्रा 2)36)। इसके अतिरिक्त, एपिकल उपकला सतह प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं के संपर्क में आने के लिए आसानी से सुलभ है, जैसे रोगी-व्युत्पन्न माइक्रोबायोटा या उपन्यास चिकित्सीय। अंत में, इस मॉडल का उपयोग विभिन्न प्रकार के भड़काऊ और गैर-भड़काऊ आंतों के रोगों के साथ-साथ सामान्य आंतों के उपकला विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जो प्रासंगिक रोगी आबादी से प्राप्त एंटरोइड्स का उपयोग करके होता है। यह मॉडल एक एकल रोगी के नमूने से डेटा अधिग्रहण के अधिकतमकरण की अनुमति देता है, जो नवजात आंतों के नमूनों की सीमित उपलब्धता और आकार को देखते हुए आवश्यक है।

इस मॉडल का उपयोग करते हुए, शिशुओं में एनईसी के दौरान होने वाले आंतों के उपकला में कई शारीरिक परिवर्तन देखे गए। गंभीर एनईसी वाले रोगी से डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम के अलावा भड़काऊ साइटोकिन्स (चित्रा 3), आंत-ऑन-ए-चिप बाधा पारगम्यता में वृद्धि, बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु, प्रसार में कमी और परिपक्व उपकला उप-प्रकार36 का नुकसान हुआ। इस प्रकार, इस मॉडल का उपयोग करने वाले भविष्य के अध्ययन एनईसी के विकास और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों के अंतर्निहित तंत्र को निर्धारित करने पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं।

एनईसी-ऑन-ए-चिप जैसे जटिल मॉडल को लागू करने में अंतर्निहित सीमाएं हैं। इस प्रणाली को माइक्रोफ्लुइडिक्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करने के लिए विशेष उपकरण, अभिकर्मकों और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, मॉडल को विभिन्न मीडिया की सटीक तैयारी, चिप की उचित सीडिंग, और बाँझ तकनीक के रखरखाव के साथ विस्तार से ध्यान देने की आवश्यकता है, जो सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। जांचकर्ताओं को नवजात रोगियों से आंतों के नमूने या एंटरोइड तक भी पहुंच होनी चाहिए, जो आम तौर पर केवल बाल चिकित्सा सर्जनों के साथ चतुर्धातुक देखभाल केंद्रों में उपलब्ध होते हैं जब तक कि सहयोगियों के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जाता है। अंत में, एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी में अतिरिक्त महत्वपूर्ण घटकों को शामिल करना, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं या हाइपोक्सिया, इस मॉडल की कठिनाई को और बढ़ाता है, हालांकि शारीरिक प्रासंगिकता को बढ़ाता है।

सारांश में, एनईसी-ऑन-ए-चिप एनईसी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति है जो यांत्रिक अध्ययनों की गुणवत्ता में सुधार करेगा और एनईसी के लिए नवीन चिकित्सीय के परीक्षण की सुविधा प्रदान करेगा। इस शोध का अंतिम लक्ष्य लक्षित उपचारों को डिजाइन और परीक्षण करना है जो आंतों की सूजन और एनईसी वाले शिशुओं के लिए परिणामों में सुधार करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने इस पांडुलिपि से संबंधित हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से R01DK118568 (एमजी), R01DK124614 (एमजी), और R01HD105301 (एमजी), चैन जुकरबर्ग इनिशिएटिव ग्रांट 2022-316749 (एमजी), एक थ्रैशर रिसर्च फंड अर्ली करियर अवार्ड (एलसीएफ), एक यूएनसी चिल्ड्रन डेवलपमेंट अर्ली करियर इन्वेस्टिगेटर ग्रांट (एलसीएफ) द्वारा चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के दाताओं के उदार समर्थन के माध्यम से समर्थित किया गया था। और चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में बाल रोग विभाग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस मानव नवजात आंतों के एंटरोइड्स डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम जटिल रोगजनन आंतों के तंग जंक्शन आंत बाधा पारगम्यता उपकला कोशिका मृत्यु माइक्रोबियल डिस्बिओसिस अनियमित सूजन पशु मॉडल सेल लाइनें आंतों के ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो मॉडल माइक्रोफ्लुइडिक टेक्नोलॉजी एनईसी-ऑन-ए-चिप प्रीटरम नियोनेट मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं ड्रग डिस्कवरी परीक्षण
नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस का माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल जिसमें मानव नवजात आंतों के एंटरोइड्स और एक डिस्बायोटिक माइक्रोबायोम शामिल हैं
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter