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Medicine

Mikrofluidisches Modell der nekrotisierenden Enterokolitis unter Einbeziehung menschlicher neonataler Darmenteroide und eines dysbiotischen Mikrobioms

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC), das für mechanistische Studien zur Krankheitspathogenese verwendet werden kann. Es verfügt über einen mikrofluidischen Chip, der mit Darmenteroiden besät ist, die aus dem menschlichen Neugeborenendarm, Endothelzellen und dem Darmmikrobiom eines Neugeborenen mit schwerem NEC stammen.

Abstract

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine schwere und potenziell tödliche Darmerkrankung, die aufgrund ihrer komplexen Pathogenese, die noch nicht vollständig verstanden ist, bisher nur schwer zu untersuchen war. Die Pathophysiologie des NEC umfasst die Störung der intestinalen Tight Junctions, eine erhöhte Durchlässigkeit der Darmbarriere, den Tod von Epithelzellen, mikrobielle Dysbiose und dysregulierte Entzündungen. Zu den traditionellen Werkzeugen zur Untersuchung von NEC gehören Tiermodelle, Zelllinien und Darmorganoide von Menschen oder Mäusen. Während Studien mit diesen Modellsystemen das Verständnis der Pathophysiologie von Krankheiten verbessert haben, ist ihre Fähigkeit, die Komplexität der menschlichen NEC zu rekapitulieren, begrenzt. Ein verbessertes In-vitro-Modell von NEC mit Hilfe von Mikrofluidik-Technologie namens NEC-on-a-Chip wurde nun entwickelt. Das NEC-on-a-Chip-Modell besteht aus einem mikrofluidischen Gerät, das mit intestinalen Enteroiden eines Frühgeborenen ausgesät ist, die mit menschlichen Endothelzellen und dem Mikrobiom eines Säuglings mit schwerem NEC kokultiviert wurden. Dieses Modell ist ein wertvolles Werkzeug für mechanistische Studien zur Pathophysiologie von NEC und eine neue Ressource für die Wirkstoffforschung bei neonatalen Darmerkrankungen. In diesem Manuskript wird eine detaillierte Beschreibung des NEC-on-a-Chip-Modells bereitgestellt.

Introduction

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) betrifft Frühgeborene mit einer Inzidenz von bis zu 10 % bei Geborenen mit einem Gewicht von < 1500 g1. Die Pathophysiologie des NEC ist komplex und umfasst eine Schädigung des Darmepithels, eine Störung der intestinalen Tight Junctions, eine erhöhte Durchlässigkeit der Darmbarriere, eine Immundysregulation und den Tod von Epithelzellen 2,3. Unser Verständnis der Mechanismen, die an der Pathogenese von NEC beteiligt sind, ist nach wie vor unvollständig, und trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es immer noch keine wirksamen zielgerichteten Therapien.

Ein wesentliches Hindernis für den Fortschritt der NEC-Forschung ist die begrenzte Verfügbarkeit und geringe Größe von primärem Darmgewebe, das aus menschlichen Säuglingen isoliert wird. Darmgewebe, das Säuglingen mit NEC entnommen wird, ist oft nekrotisch und stark geschädigt, was die Erforschung von Mechanismen, die dem Ausbruch der Krankheit vorausgehen, erschwert. Zum Beispiel wird der Dünndarm von Säuglingen mit NEC mit Immunzellen überschwemmt, und es wird auch eine reduzierte Anzahl von Darmstammzellen, eine verminderte Epithelzellproliferation und eine erhöhte Apoptose von Epithelzellen beobachtet 4,5,6,7. Dies führt zu Schwierigkeiten bei der Kultivierung von Darmepithelzellen aus diesen Proben und bei der Isolierung von RNA und Proteinen, die in dieser lebensfeindlichen Entzündungsumgebung abgebaut werden können. Da der Krankheitsprozess bei Säuglingen mit chirurgischem NEC bereits fortgeschritten ist, sind mechanistische Studien zu Faktoren, die eine Krankheit auslösen, nicht durchführbar. Diese Einschränkungen haben dazu geführt, dass man sich bei mechanistischen Studien von NEC auf Tiermodelle verlässt.

Tiermodelle von NEC wurden für Mäuse, Ratten, Ferkel, Kaninchen und Paviane etabliert 5,8,9,11. Eine Stärke von Tiermodellen besteht darin, dass NEC-ähnliche Darmerkrankungen durch Faktoren induziert werden, die mit dem Ausbruch von NEC beim Menschen verbunden sind, einschließlich eines dysbiotischen Mikrobioms, wiederholter Episoden von Hypoxie und des Fehlens von Muttermilchnahrung 5,8,10,11. Darüber hinaus sind die Entzündungsreaktion und die pathologischen Veränderungen, die während der experimentellen NEC beobachtet wurden, parallel zur menschlichen Erkrankung 5,9,12. Während diese Modelle viele der Merkmale des menschlichen NEC nachahmen, gibt es inhärente Unterschiede zwischen der Pathophysiologie des NEC bei Tieren und Menschen. Zum Beispiel wird das murine Modell des NEC bei voll ausgetragenen Mäusen induziert, und obwohl ihre Darmentwicklung unvollständig ist, ist die Pathophysiologie des NEC in diesem klinischen Kontext von Natur aus anders. Die intestinale Genexpression von Mäusen bei der Geburt ähnelt der eines prälebensfähigen menschlichen Fötus und nähert sich nicht der eines Frühgeborenen in der 22. bis 24. Schwangerschaftswoche bis zum 14. Tag an (P14)13. Dies verwirrt das murine NEC-Modell, da bei Mäusen nach P10 im Allgemeinen keine Darmschäden induziert werden können. Darüber hinaus fehlt den Inzuchtstämmen von Mäusen die immunologische14 und mikrobiologische Diversität menschlicher Neugeborener15, was als weiterer Störfaktor dient. Daher verbessert die verstärkte Einbeziehung von humanen Primärproben in die NEC-Forschung die klinische Relevanz von Studien in diesem Bereich.

Studien zu den Mechanismen von NEC in vitro wurden traditionell monotypische Zelllinien verwendet, die von adulten Darmkrebszellen stammen, wie z. B. kolorektale Adenokarzinomzellen (Caco2) und humane Kolonadenokarzinomzellen (HT-29)16. Diese Modelle sind praktisch, aber aufgrund ihres Wachstums aus adulten Krebszellen, ihrer nicht-polarisierten Architektur und phänotypischer Veränderungen im Zusammenhang mit wiederholten Passagen in der Kultur in ihrer physiologischen Relevanz begrenzt. Intestinale Enteroide verbessern diese Modelle, da sie aus den Krypten des Darmgewebes gezüchtet, in alle intestinalen Epithel-Subtypen differenziert werden können und eine dreidimensionale (3D) zottenartige Struktur bilden17,18,19,20. In jüngster Zeit wurden intestinale Enteroide mit mikrofluidischer Technologie kombiniert, um ein Dünndarm-on-a-Chip-Modell zu entwickeln und ein physiologisch relevanteres In-vitro-Modellsystem bereitzustellen21.

Die ersten Organ-on-a-Chip-Mikrofluidik-Geräte wurden in den frühen 2000er Jahren eingeführt22,23,24. Das erste Organ-on-a-Chip-Modell war das menschliche atmende Lung-on-a-Chip25. Es folgten zahlreiche Einzelorganmodelle wie Darm 21, Leber 26, Niere 27, Knochenmark 28, Blut-Hirn-Schranke 29 und Herz30. Diese Organ-on-a-Chip-Modelle wurden zur Untersuchung akuter, chronischer und seltener Krankheiten verwendet, einschließlich des akuten Strahlensyndroms31, der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung32 und neurodegenerativer Erkrankungen33. Die polarisierte Natur der Zellen auf diesen Chips und das Vorhandensein von zwei zellulären Kompartimenten, die durch eine poröse Membran getrennt sind, ermöglichen die Modellierung komplexer physiologischer Prozesse wie Perfusion, chemische Konzentrationsgradienten und Immunzellchemotaxis34,35. Diese mikrofluidischen Systeme bieten somit ein neues Werkzeug zur Untersuchung der Pathophysiologie und der Mechanismen menschlicher Krankheiten.

Das Dünndarm-on-a-Chip-Modell wurde 2018 von Kasendra et al. beschrieben, die pädiatrische Dünndarmbiopsieproben (im Alter von 10 bis 14 Jahren) verwendeten, die in Enteroide differenziert und auf einem mikrofluidischen Gerät kultiviert wurden21. Vaskuläre Endothelzellen, kontinuierlicher Medienfluss und Dehnung/Entspannung wurden ebenfalls in dieses Modell integriert. Sie beobachteten die Differenzierung des intestinalen epithelialen Subtyps, die Bildung von 3D-zotten-ähnlichen Achsen, die Schleimproduktion und die Genexpressionsmuster des Dünndarms21. Dieses mikrofluidische Modell wurde mit der Entwicklung des NEC-on-a-Chip-Systems, das neonatale Darmenteroide, Endothelzellen und das Mikrobiom eines Neugeborenen mit NEC36 umfasst, auf neonatale Erkrankungen angewendet. NEC-on-a-Chip rekapituliert viele der kritischen Merkmale des menschlichen NEC, einschließlich der Expression entzündlicher Gene, des Verlusts spezialisierter Epithelzellen und der verminderten Darmbarrierefunktion36. Daher hat dieses Modell zahlreiche Anwendungen in der Untersuchung von NEC, einschließlich mechanistischer Studien und Wirkstoffforschung. In diesem Manuskript wird ein detailliertes Protokoll für die Durchführung des NEC-on-a-Chip-Modells bereitgestellt.

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Protocol

Enteroide wurden aus Dünndarmproben von Frühgeborenen (geboren in der 22. bis 36. Schwangerschaftswoche) gewonnen, die zum Zeitpunkt der Operation wegen NEC oder anderer Darmerkrankungen mit nicht-entzündlicher Ätiologie gewonnen wurden. Die gesamte Probenentnahme und -verarbeitung erfolgte nach Einverständnis und Genehmigung durch die Institutional Review Boards der Washington University in St. Louis (IRB-Protokollnummern 201706182 und 201804040) und der University of North Carolina in Chapel Hill (IRB-Protokollnummer 21-3134).

1. Isolierung und Plattierung von Krypten aus humanem neonatalem Dünndarm zur Etablierung von Enteroiden

  1. Medienaufbereitung
    1. Bereiten Sie alle erforderlichen Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Stellen Sie sicher, dass für die Vorbereitung aller Medien eine aseptische Technik verwendet wird. Filter Sterilisieren Sie Medien mit einem 0,2-μm-Filter und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
  2. Waschen und Zerkleinern von Darmgewebe
    1. Legen Sie das Zellkulturmatrix-Hydrogel zum Auftauen auf Eis. Entnehmen Sie menschliches Darmgewebe aus dem Operationssaal. Geben Sie die Probe sofort in 5 ml eiskaltes Gewebewaschmedium, um endogene Proteasen zu inaktivieren.
    2. Spülen Sie den Darminhalt mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) von Dulbecco mit einer 10-ml-Spritze mit einer getrimmten P1000-Pipettenspitze. Geben Sie das Darmgewebe in eine 35-mm-Schale mit 5 ml eiskaltem D-PBS.
    3. Schneiden Sie das Darmgewebe der Länge nach durch, um das Lumen freizulegen, und schneiden Sie es mit einer feinen Schere in kleine Stücke. Spülen Sie das Darmgewebe durch leichtes Rühren in D-PBS in der Gewebekulturschale.
    4. Gewebefragmente in eine saubere 35-mm-Schale geben. Schneidepapier mit einer feinen Schere zerkleinern. Die optimale Größe beträgt 0,5 cm2 pro Stück. Das Darmgewebe sollte durch eine abgeschnittene 1-ml-Pipettenspitze geleitet werden.
  3. Dissoziation von Darmgewebe
    1. Geben Sie 1 ml vorgewärmte Kollagenase I in das Gewebe. Mischen Sie Gewebe mit Kollagenase, indem Sie 10-15 Mal pipettieren, und überführen Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    2. Befestigen Sie das Röhrchen waagerecht auf einem Shaker, der auf 50 U/min eingestellt ist. 20 min bei Raumtemperatur schütteln.
    3. Nehmen Sie nach der Inkubation die Röhrchen aus dem Schüttler und resuspendieren Sie die Lösung durch 10-15-maliges Pipettieren. Optional: Entfernen Sie ein kleines Aliquot, um das Vorhandensein einzelner Krypten mittels Phasenkontrastmikroskopie zu überprüfen.
  4. Isolierung von Darmkrypten
    1. Filterkrypten durch ein 70-μm-Sieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen auf Eis. Waschen Sie das Sieb mit 9 ml eiskaltem Tissue-Waschmedium. Das Filtrat wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt.
    2. Bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Es verbleiben ca. 200 μl Medien im Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml des eiskalten Tissue-Waschmediums.
    3. Bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Gewebewaschmedium und geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    4. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Krypten zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig mit einer Pipette ab. Lege das Röhrchen auf Eis.
  5. Plattieren von Darmkrypten
    1. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Zellkulturmatrix-Hydrogel (20 μl/Well einer 48-Well-Gewebekulturplatte) mit einer vorgekühlten Pipettenspitze, um eine homogene Suspension von Krypten herzustellen, während das Röhrchen auf Eis bleibt. Vermeiden Sie es, beim Pipettieren Blasen zu bilden. Bewahren Sie das Röhrchen bis zur Verwendung auf Eis auf.
      HINWEIS: Das Zellkultur-Matrix-Hydrogel polymerisiert bei Temperaturen über 8 °C. Krypten, die aus einem 0,5 cm bis 1 cm langen Stück Darmgewebe isoliert wurden, werden in der Regel in 10 Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturplatte plattiert.
    2. Die Hydrogel-Suspension aus der Krypten-/Zellkulturmatrix wird in eine vorgewärmte 48-Well-Gewebekulturplatte gegeben. Erwärmen Sie die Platte, um die Erstarrung der Matrix zu unterstützen. Platzieren Sie die Aufhängung in der Mitte des Brunnens. Vermeiden Sie Blasen beim Plattieren.
    3. Die Platten werden 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Matrix zu polymerisieren. Es ist wichtig, dass das Zellkulturmatrix-Hydrogel vor der Zugabe von Medien vollständig polymerisiert.
    4. Nachdem die Matrix polymerisiert ist, geben Sie 300 μl vorgewärmte, 50 % L-WRN-konditionierte Medien in jede Vertiefung. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.
    5. Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage. Ersetzen Sie sie durch warme, 50 % L-WRN-konditionierte Medien. Passage alle 7 bis 10 Tage. Passageenteroide, wenn sie zu 50%-90% konfluieren und Knospenbildung aufweisen.
      HINWEIS: Das Medium muss möglicherweise häufiger gewechselt werden, wenn es gelb wird. Die Häufigkeit der Passage hängt von der Dichte des Enteroids und der Wachstumsrate der Zellen eines bestimmten Patienten ab. Enteroide müssen durchgelassen werden, wenn ihre Zentren dunkel erscheinen.
  6. Passage der Enteroide
    1. Saugen Sie vorsichtig Medien aus den Brunnen ab. Vertiefungen vorsichtig mit 500 μl warmem D-PBS waschen. Achten Sie darauf, die Matrix nicht zu stören.
    2. Geben Sie 250 μl Kaltzellen-Rückgewinnungslösung in jede Vertiefung. Kratzen Sie mit einer frischen Pipettenspitze am Boden jeder Vertiefung, um das Hydrogel der Zellkulturmatrix zu zerstören. Platte 30 Minuten auf Eis inkubieren.
    3. Dissoziieren Sie die Enteroide durch kräftiges Pipettieren (~25-50 Mal mit der P200-Pipette) und fügen Sie 500 μl Gewebewaschmittel hinzu.
    4. Ententeroidsuspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und zusätzlich 5 ml kaltes Gewebewaschmedium hinzufügen. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Lösung zu bilden.
    5. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Enteroide zu pelletieren. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und saugen Sie den Überstand so vollständig wie möglich ab. Es verbleiben ca. 30-60 μl im Röhrchen.
      HINWEIS: Wenn es Schwierigkeiten gibt, die Enteroide beim Pipettieren aufzubrechen, kann 0,25% Trypsin-EDTA oder enzymatisches Dissoziationsreagenz verwendet werden, um diesen Prozess zu erleichtern.
    6. Resuspendieren Sie Enteroide im Restvolumen des Waschmediums mit einer P200-Pipette. Vermeiden Sie Blasenbildung beim Pipettieren.
    7. Geben Sie 20 μl Zellkulturmatrix-Hydrogel pro neuer Vertiefung einer 48-Well-Platte zur enteroiden Suspension. Teilen Sie die Enteroide je nach Dichte 1:3, 1:4 oder 1:5.
    8. Geben Sie die Suspension auf eine vorgewärmte 48-Well-Platte. Die Platte wird 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Matrix zu verfestigen.
    9. Nach der Polymerisation werden 300 μl vorgewärmte 50 % L-WRN-konditionierte Medien in jede Vertiefung gegeben. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.

2. Neonatales Darm-on-a-Chip-Modell

HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zum Umgang mit den Mikrofluidik-Chips und zur Verwendung dieses Geräts finden Sie im Duodenum-Darm-Chip-Kulturprotokoll37 des Herstellers.

  1. Medienaufbereitung
    1. Bereiten Sie alle erforderlichen Medien wie in Tabelle 2 beschrieben vor. Stellen Sie sicher, dass eine aseptische Technik verwendet wird. Filter Sterilisieren Sie Medien mit einem 0,2-μm-Filter und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
  2. Tag (-3): Auftauen und Expandieren menschlicher intestinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HIMECs)
    1. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit HIMECs und eine Platte gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf.
    2. Einen 25-cm-Kolben 2 Minuten lang mit einer Beschichtungslösung auf Gelatinebasis bestreichen. Überschüssige Lösung entfernen. HIMECs (ca. 0,5-1 x 10 6 Zellen), die in6 ml HIMEC-Medien resuspendiert sind, in den Kolben geben. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.
    3. Wechseln Sie die HIMEC-Medien alle 48 Stunden. Fügen Sie dem Endothelkanal (unterer Kanal) des Chips innerhalb von 48-72 Stunden, nachdem sie zu 100 % konfluent sind, HIMECs hinzu.
  3. Tag (-1): Aktivierung und Beschichtung der Chips vor der Zugabe der Enteroide
    1. Rekonstituieren Sie das Chipaktivierungsreagenz 1 (CR-1)-Pulver, um CR-1-Lösung herzustellen. Stellen Sie sicher, dass das CR-1-Pulver und die Chipaktivierungsreagenz 2 (CR-2)-Lösung für diesen Schritt Raumtemperatur haben.
      HINWEIS: Bewahren Sie das CR-1-Pulver und die CR-1-Lösung, die in den folgenden Schritten hergestellt wird, jederzeit lichtgeschützt auf. Für diese Schritte sollte das Licht in der Haube ausgeschaltet sein.
      1. Legen Sie den Chip und den Chipträger in die Chip-Wiege und legen Sie sie dann in eine Gewebekulturschale in der Zellkulturhaube. Siehe das Protokoll des Herstellers für die richtige Technik für die Chipplatzierung in dem Träger37.
      2. Geben Sie 1 ml CR-2-Lösung in die Durchstechflasche mit CR-1-Pulver und geben Sie die Lösung dann direkt aus der Durchstechflasche mit CR-1-Pulver in ein 15-ml-Röhrchen, das zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie eingewickelt ist. Mischen Sie die Lösung nicht mit der Pipette. Ziel ist es, Blasenbildung zu vermeiden.
      3. Geben Sie weitere 1 ml CR-2-Lösung in die Durchstechflasche CR-1 und geben Sie sie in das 15-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 4 Spülungen und insgesamt 4 ml CR-2, die durch die Durchstechflasche mit CR-1 gespült werden. Setzen Sie die Kappe auf die Durchstechflasche und drehen Sie sie für die letzte Spülung um, um alle Pulverreste zu entfernen.
      4. Geben Sie weitere 6 ml CR-2 in das 15-ml-Röhrchen, das CR-1 enthält, um ein Endvolumen von 10 ml (0,5 mg/ml) zu erhalten. Mischen Sie diese Lösung mit einer Pipette, ohne Blasen einzuführen. Stellen Sie sicher, dass CR-1 vollständig aufgelöst ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Hinzufügen von CR-1-Lösung zum Chip
      HINWEIS: Es ist wichtig, beim Hinzufügen dieser Lösungen das Einbringen von Blasen in die Kanäle zu vermeiden. Die CR-1-Lösung sollte für diesen Schritt lichtgeschützt bleiben.
      1. Geben Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze 20 μl CR-1-Lösung in den unteren Kanaleinlass, bis die Lösung beginnt, den unteren Kanalauslass zu verlassen. Geben Sie 50 μl CR-1-Lösung durch den oberen Kanaleinlass, bis die Lösung beginnt, den oberen Kanalauslass zu verlassen. Überschüssige CR-1-Lösung wird durch sanftes Absaugen von der Oberfläche des Chips entfernt.
        HINWEIS: Lösungen sollten immer dem unteren Kanal vor dem oberen Kanal hinzugefügt werden. Wenn Blasen festgestellt werden, werden beide Kanäle mit CR-1-Lösung gespült und 2.3.2.1 wiederholt.
      2. Wenn der Deckel der Gewebekulturschale mit den Chips angebracht ist, entfernen Sie ihn für diesen Schritt. Chips für 15 Minuten unter UV-Licht legen. Entfernen Sie CR-1 aus dem oberen und unteren Kanal.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2.1 bis 2.3.2.2 für insgesamt zwei UV-Aktivierungsschritte. Nach diesem Schritt sind die Chips nicht mehr lichtempfindlich.
      4. Entfernen Sie CR-1 aus dem oberen und unteren Kanal. Waschen Sie beide Kanäle mit 100 μl CR-2-Lösung. Entfernen Sie die CR-2-Lösung aus dem oberen und unteren Kanal.
      5. Waschen Sie beide Kanäle mit 100 μl sterilem D-PBS. Wiederholen Sie die Wäschen 2x. Geben Sie 100 μl D-PBS in beide Kanäle. Entfernen Sie den Überschuss von der Oberfläche der Chips, aber lassen Sie die Kanäle voll.
    3. Ummanteln Sie die Kanäle mit der extrazellulären Matrix.
      1. Nähren Sie Fibronektin, Kollagen IV und Zellkulturmatrix-Hydrogel unmittelbar vor diesem Schritt auf Eis und lassen Sie diese Lösungen für den Rest dieses Abschnitts auf Eis.
      2. Bereiten Sie die folgenden extrazellulären Matrixlösungen (ECM) für den oberen und unteren Kanal des Chips vor:
        Top Channel: 100 μl 200 μg/ml Typ-IV-Kollagen und 100 μg/ml Zellkulturmatrix-Hydrogel in D-PBS pro Chip.
        Unterer Kanal: 100 μl 200 μg/ml Kollagen Typ IV und 30 μg/ml Fibronektin in D-PBS pro Chip.
      3. Entfernen Sie D-PBS vollständig von den oberen und unteren Kanälen. Geben Sie 50 μl ECM in den unteren Kanaleinlass, bis ein Tropfen am Auslass erscheint. Wiederholen Sie den Vorgang für den oberen Kanal. Stellen Sie sicher, dass Sie für jeden Kanal die entsprechenden ECM-Lösungen verwenden, und fügen Sie die Lösung zuerst dem unteren Kanal hinzu.
      4. Geben Sie D-PBS in das Chip-Cradle-Reservoir und setzen Sie den Deckel auf der Gewebekulturplatte wieder auf. Die Chips über Nacht in einen befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 geben.
  4. Tag (0): Aussaat von Chips mit HIMECs und Enteroiden
    1. Vakuumäquilibrierung von Medien
      1. Geben Sie das erforderliche Volumen an HIMEC-Medien und Chip-Expansionsmedien in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen, um das Experiment abzuschließen. Medien auf 37 °C im Wasserbad für mindestens 1 h ausgleichen.
      2. Schließen Sie das Vakuumfiltrationsgerät an 50-ml-Röhrchen mit erwärmten Medien an. Die Röhrchen sollten mit dem vorgewärmten Medium am Boden des konischen 50-ml-Röhrchens ausgerichtet werden. Vakuum bei -70 kPa oder höher für 10 s.
      3. Drehen Sie die Röhrchen um, so dass sich das Medium durch den Filter bewegt. 5 Minuten weiter saugen. Nach Beendigung der Vakuumfiltration entfernen Sie das Vakuumfiltrationsgerät und legen Sie die 50-ml-Röhrchen mit den Medien in den 37 °C-Inkubator.
    2. Waschen der Chips
      1. Waschen Sie den Endothelkanal, indem Sie ihn mit 100 μl vorgewärmtem HIMEC-Medium spülen.
        Waschen Sie den Epithelkanal durch Spülen mit 100 μl vorgewärmtem Chipexpansionsmedium. Entfernen Sie alle Medien, die sich auf der Oberfläche der Chips ausbreiten.
      2. Waschvorgang wiederholen. Das Medium sollte nach diesen Spülungen in den Kanälen sowie in den Ein- und Auslassöffnungen verbleiben. Setzen Sie den Deckel der Kulturschale mit den Chips wieder auf und legen Sie ihn wieder in den Inkubator, bis er gebrauchsfertig ist.
    3. Ernte von HIMECs
      1. Saugen Sie das Medium aus dem25-cm-2-Kolben mit HIMECs an. Waschen Sie die Monoschicht vorsichtig mit D-PBS. 2 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA in den Kolben geben und vorsichtig über die Monoschicht spülen.
      2. Der Kolben wird bei 37 °C für 2-5 Minuten inkubiert. Neutralisieren Sie Trypsin mit 10 ml HIMEC-Medien. Resuspendieren Sie die Zellen in Medien und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
      3. Bei Zellen 150 x g 5 Min. bei 4 °C schleudern. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl HIMEC-Medien.
      4. Entnehmen Sie 10 μl der Zellen und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Die gewünschte Konzentration von HIMECs beträgt 6 x 10 6 bis 8 x 106 Zellen/ml.
    4. Aussaat von HIMECs auf dem Chip
      1. Entferne den Chip aus dem Inkubator und bringe ihn in die Haube. Saugen Sie alle Medien an, die möglicherweise auf der Oberfläche des Chips ausgetreten sind.
      2. Spülen Sie den Epithelkanal (oberer Kanal) des Chips mit 100 μl vorgewärmtem Chipexpansionsmedium. Spülen Sie den Endothelkanal (Boden) des Chips mit 100 μl vorgewärmtem HIMEC-Medium.
      3. Resuspendieren Sie die HIMECs vorsichtig, um eine homogene Verteilung zu erhalten. Entfernen Sie das Medium vollständig aus dem Endothelkanal (unterer Kanal). 10 μl HIMECs (~36.000 Zellen/Chip) in den Endothelkanal (unterer Kanal) geben.
        HINWEIS: Wenn es schwierig ist, den HIMEC-Kanal ohne Blasenbildung zu füllen, wenn Sie 10 μl HIMECs verwenden, erhöhen Sie das Volumen der hinzugefügten Zellen. Es sollte die gleiche Anzahl von Zellen pro Chip sein.
      4. Geben Sie zusätzliche organoide Wachstumsmedien in den Epithelkanal (oben), wenn dieser nicht voll ist. Prüfen Sie die Aussaatdichte der HIMECs. Wenn sie nicht gleichmäßig verteilt sind und nicht 80 % bis 90 % der Spanfläche bedecken, spülen Sie den Kanal und wiederholen Sie die Aussaat.
      5. Invertieren Sie den Chip in die Chip-Cradle in der Zellkulturschale. Geben Sie D-PBS in den Behälter in der Chip-Halterung. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Zellkulturschale und legen Sie sie in den Inkubator.
      6. Lassen Sie den Chip 2-3 Stunden lang bei 37 °C invertiert, damit sich HIMECs an die Chipmembran anheften können. Nach Beendigung der Inkubation bringen Sie den Chip/die Chip-Wiege wieder in eine aufrechte Position.
      7. Waschen Sie den Endothelkanal (unterer Kanal) vorsichtig mit 100 μl warmem HIMEC-Medium. Lassen Sie Medien im Kanal. Waschen Sie den Epithelkanal (oberer Kanal) vorsichtig mit 100 μl organoidem Wachstumsmedium. Lassen Sie Medien im Kanal.
      8. Geben Sie die Chips in den 37 °C warmen Inkubator zurück, während Sie die nächsten Schritte ausführen.
    5. Ernte von Enteroiden und Aussaat auf dem Chip
      HINWEIS: Die Chips sind mit Enteroiden besiedelt, die 10-14 Tage zuvor geteilt wurden, zu 50 % bis 75 % konfluent sind und sich an den Passagen 7 und 20 befinden. In Abbildung 2 sehen Sie das Auftreten von Enteroiden an Tag 0. Die Zeit, die benötigt wird, bis die Enteroide für die Aussaat bereit sind, hängt von der Wachstumsrate der Zellen eines bestimmten Patienten ab.
      1. Saugen Sie vorsichtig Medien aus den Brunnen ab. Vertiefungen mit Zellkulturmatrix-Hydrogel vorsichtig mit 500 μl warmem D-PBS waschen. Achten Sie darauf, das Hydrogel der Zellkulturmatrix nicht zu stören.
      2. Geben Sie 250 μl Kaltzellen-Rückgewinnungslösung in jede Vertiefung. Kratzen Sie den Boden jeder Vertiefung mit einer frischen Pipettenspitze auf, um das Hydrogel der Zellkulturmatrix zu unterbrechen. Geben Sie den Inhalt der Vertiefungen in ein kaltes 15-ml-Röhrchen auf Eis.
      3. Das Röhrchen 45 Minuten lang auf Eis inkubieren und das Röhrchen alle 3-5 Minuten umdrehen. Bereiten Sie in diesem Schritt enteroide Dissoziationsmedien vor. Geben Sie dieses Medium in das 37 °C warme Wasserbad, wenn noch 10 Minuten im Inkubationsschritt verbleiben.
      4. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Enteroide zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
      5. Geben Sie 2 ml enteroides Dissoziationsmedium pro geernteter Platte in das Pellet und legen Sie es für 60 bis 120 s in ein 37 °C warmes Wasserbad. Das Röhrchen während der Inkubation vorsichtig schwenken. Inkubieren Sie lange genug, um fragmentierte Enteroide zu erhalten, jedoch ohne Dissoziation in eine Einzelzellsuspension.
      6. Nach der Inkubation 10 ml kaltes Gewebewaschmedium in jedes 15-ml-Röhrchen geben. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Enteroide zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand vollständig ab.
      7. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Chipexpansionsmedium. Dissoziation von Enteroiden durch kräftiges Pipettieren (~25-50 mal mit P200-Pipette).
      8. Kombinieren Sie die Zellen in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Lösung zu bilden. Ziel ist es, den Chip mit fragmentierten Enteroiden in kleinen Clustern von 10-30 Zellen zu besiedeln.
      9. Entnehmen Sie 10 μl der Zellsuspension für die Zählung. Die restliche Zellsuspension auf Eis legen. Passen Sie das Volumen der Chipexpansionsmedien an, um eine Konzentration von 6 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
        HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Enteroide zu zentrifugieren und in einem kleineren Medienvolumen zu resuspendieren, um die erforderliche Dichte zu erreichen.
      10. Bringen Sie die mikrofluidischen Chips in die Haube und saugen Sie das Medium aus dem Epithelkanal (oberer Kanal) des Chips an. Beladen Sie den oberen Kanal des Chips mit 30 μl resuspendierten Zellen (~180.000 Zellen/Chip). Stellen Sie sicher, dass der Epithelkanal des Chips vollständig und gleichmäßig abgedeckt ist, um eine Monoschicht zu bilden. Ist dies nicht der Fall, spülen Sie die Enteroide durch den Chip und säen Sie sie neu.
        HINWEIS: Wenn es Schwierigkeiten gibt, eine gleichmäßige Suspension zu erreichen, während mehrere Chips geladen werden, können die Enteroide in einzelnen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in 40-μl-Aliquots getrennt werden. Dadurch wird die Variabilität der enteroiden Anzahl und der Fragmentgröße während des Ladens minimiert.
      11. Legen Sie die Chips zurück in die Chip-Wiege in der Zellkulturschale (falls sie entfernt wurden). Geben Sie D-PBS in den Behälter in der Chip-Halterung. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Zellkulturschale und legen Sie die Chips über Nacht auf 37 °C und 5 % CO2 .
  5. Tag (1): Vorbereiten der Schoten und Einleiten des Durchflusses in die Chips
    1. Bringen Sie die Chips in die Haube der Gewebekultur. Spülen Sie den Epithelkanal zweimal vorsichtig mit 100 μl Chipexpansionsmedium. Spülen Sie den Endothelkanal zweimal vorsichtig mit 100 μl HIMEC-Medium. Entfernen Sie überschüssiges Medium von der Chipoberfläche.
    2. Prime-Pods und regulieren gemäß dem Protokoll des Herstellers37. Geben Sie 2 ml geeignetes Medium in die Einlassbehälter. Geben Sie 300 μl des entsprechenden Mediums in die Auslassbehälter. Die Durchflussrate beträgt 30 μl/h. Die Dehnung wird noch nicht eingeleitet.
  6. Tag (2): Überwachung der Monolayer-Entwicklung und des Medienwechsels
    1. Halten Sie das Kulturmodul an und bringen Sie die Schoten in die Haube.
    2. Untersuchen Sie Chips und Hülsen auf Blasen. Untersuchen Sie die epitheliale Monoschicht mit einem Phasenkontrastmikroskop. Erfassen Sie Bilder an konsistenten Stellen auf dem Chip, um den Fortschritt zu überwachen. Stellen Sie sich die Chips vor, während sie in den Pods verbleiben.
    3. Entfernen Sie das Medium aus den oberen Einlassbehältern des Kanals und ersetzen Sie es durch 2 ml Chipdifferenzierungsmedium. Geben Sie 1 ml HIMEC-Medium in das Einlassreservoir des unteren Kanals. Lassen Sie genügend Medien in den Einlassbehältern, um sicherzustellen, dass der Boden des Behälters mit einer dünnen Medienschicht bedeckt bleibt.
    4. Legen Sie die Pods zurück in das Kulturmodul und starten Sie den Fluss mit 30 μl/h neu.
  7. Tag (3): Überwachen der Monolayer-Entwicklung, Initiieren der Dehnung und Hinzufügen von Medien
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1.1. und 2.6.1.2. Geben Sie 1 ml Chipdifferenzierungsmedium in das Einlassreservoir des oberen Kanals und 1 ml HIMEC-Medien in das Einlassreservoir des unteren Kanals.
      HINWEIS: Entfernen Sie Medien aus den Auslassbehältern beider Kanäle, sobald sie eine Kapazität von 50-75 % erreicht haben.
    2. Legen Sie die Pods zurück in das Kulturmodul. Starten Sie den Fluss mit 30 μl/h und beginnen Sie mit einer Dehnung von 2 % und einer Frequenz von 0,2 Hz.
  8. Tag (4): Überwachung der Monolayer-Entwicklung, Erhöhung der Dehnung und Hinzufügen von Medien
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1.1. und 2.6.1.2. Geben Sie 1 ml Chipdifferenzierungsmedium in das Einlassreservoir des oberen Kanals und 1 ml HIMEC-Medien in das Einlassreservoir des unteren Kanals.
      HINWEIS: Entfernen Sie Medien aus den Auslassbehältern beider Kanäle, sobald sie eine Kapazität von 50-75 % erreicht haben.
    2. Legen Sie die Pods zurück in das Kulturmodul. Starten Sie den Durchfluss mit 30 μl/h und erhöhen Sie die Dehnung auf 10 % Dehnung und eine Frequenz von 0,2 Hz.
  9. Tag (5) bis Tag (7): Überwachung der Monolayer-Entwicklung und Hinzufügen von Medien
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1.1. und 2.6.1.2. Geben Sie 1 ml Chipdifferenzierungsmedium in das Einlassreservoir des oberen Kanals und 1 ml HIMEC-Medien in das Einlassreservoir des unteren Kanals.
    2. Legen Sie die Pods wieder in das Kulturmodul zurück, starten Sie den Fluss und dehnen Sie ihn neu. Sobald die zottenartigen Achsen visualisiert sind, fahren Sie mit dem NEC-on-a-Chip-Modell fort.

3. NEC-on-a-Chip-Modell

  1. Darmbakterienkultur
    HINWEIS: Dieser Schritt erfordert einen vortitrierten gefrorenen Vorrat an Darmbakterien von einem Patienten mit NEC, der vor Beginn dieses Protokolls vorbereitet wird. Für diese Experimente wurde eine zuvor beschriebene polymikrobielle enterische Bakterienaufschlämmung eines Patienten mit schwerem chirurgischem NEC verwendet38.
    1. Stellen Sie einen 50%igen Glycerinvorrat an Darmbakterien her und lagern Sie ihn bis zur weiteren Verwendung in einem Gefrierschrank bei -80 °C.
    2. Ein Aliquot der Darmbakterien wird aufgetaut und 10 μl in 3 ml Luria-Bertani (LB)-Medien inokuliert. Bei 37 °C unter Schütteln bei 150 U/min über Nacht inkubieren.
    3. Waschen Sie die Kanäle am selben Tag vorsichtig mit 100 μl vorgewärmtem antibiotikafreiem Chip-Differenzierungsmedium (oberer Kanal) oder 100 μl vorgewärmtem antibiotikafreiem HIMEC-Medium (unterer Kanal). Saugen Sie das Medium vollständig an und wiederholen Sie die Spülung für insgesamt 3 Wäschen.
    4. Nach dem Ansaugen der dritten Wäsche das Medium in den Kanälen austauschen und an Ort und Stelle lassen.
    5. Spülen Sie die Einlassbehälter des oberen und unteren Kanals mit sterilem D-PBS und füllen Sie sie dann mit 3 ml des entsprechenden antibiotikafreien Mediums. Pods ansaugen und wie in 2.5.2 regulieren.
    6. Legen Sie den Chip wieder in das Kulturmodul zurück und leiten Sie die Dehnung und den Fluss erneut ein.
    7. Nehmen Sie am nächsten Morgen 1 ml der Bakterienkultur über Nacht und inokulieren Sie sie in 25 ml frisches LB-Medium.
    8. Legen Sie diese neue Kultur wieder in den 37 °C-Schüttler, bis der OD600 0,6 ± 0,02 erreicht, gemessen mit einer 1-cm-Küvette. Verdünnen Sie die Bakterienkultur auf 7 x 108 koloniebildende Einheiten/ml in antibiotikafreien Chip-Expansionsmedien.
    9. Bewahren Sie ein Aliquot dieser Kultur auf, um die Konzentration des Inokulums39 zu bestätigen. Es kann notwendig sein, die Konzentration der Bakterien je nach Reaktion des Epithels anzupassen.
    10. Entfernen Sie das Medium aus dem Epithelkanal (oberer Kanal). Geben Sie 30 μl der Bakterienkultur, die in antibiotikafreien Chipexpansionsmedien verdünnt ist, in den oberen Kanal des Chips. Seien Sie sehr vorsichtig, um eine Kreuzkontamination des HIMEC-Kanals (Endothelkanal) mit Bakterien zu vermeiden. Entfernen Sie alle überschüssigen Medien von der Oberfläche des Chips.
    11. Lassen Sie die Chips 30 Minuten lang unter statischen Bedingungen verbleiben, um die bakterielle Anhaftung an der apikalen Seite des Neugeborenenepithels zu erleichtern. Spülen Sie nach der Inkubation den oberen Kanal mit 100 μl antibiotikafreiem Expansionsmedium, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen. Führen Sie die Späne in das Kulturmodul zurück und leiten Sie die Dehnung und das Fließen erneut ein.
    12. Entfernen Sie alle 24 Stunden die Pods aus dem Kulturmodul und spülen Sie langsam 100 μl antibiotikafreies Chip-Expansionsmedium durch den Epithelkanal. Dies hilft, eine bakterielle Überwucherung zu verhindern.

4. Test der Darmpermeabilität

HINWEIS: Dies kann bei jedem Schritt während des Protokolls durchgeführt werden. Wenn der intestinale Permeabilitätstest bei der Aussaat von Chips eingeleitet wird, kann er zur seriellen Beurteilung der Monolayer-Konfluenz verwendet werden. Wenn dieser Assay durch die Zugabe von Darmbakterien eingeleitet wird, kann er verwendet werden, um den Einfluss von Darmbakterien auf die Integrität der Darmepithel-Monolayer zu bestimmen.

  1. Entfernen Sie das Medium aus dem Einlassreservoir für den Epithelkanal (oben). Geeignetes Medium, das Permeabilitätsfarbstoff (50 μg/ml) enthält, in das Einlassreservoir geben. Verwenden Sie antibiotikafreie Chip-Differenzierungsmedien für das NEC-on-a-Chip-Modell.
  2. Sammeln Sie die Abwässer aus den Epithel- und Endothelkanälen alle 24 Stunden. Quantifizieren Sie die Konzentration des Permeabilitätsfarbstoffs mit einem Mikroplatten-Reader gemäß Lanik et al.36.

5. Immunhistochemie

  1. Waschen Sie den unteren und oberen Kanal des Chips vorsichtig mit 200 μl D-PBS. D-PBS vollständig aus den Kanälen absaugen.
  2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie beide Kanäle mit 4% Paraformaldehyd spülen und die Lösung in den Kanälen belassen. Überschuss von der Chipoberfläche absaugen. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 μl D-PBS. Lassen Sie D-PBS im unteren Kanal und entfernen Sie es vollständig aus dem oberen Kanal.
  4. Permeabilisieren Sie die Epithelschicht, indem Sie den oberen Kanal mit 100 μl 0,1%iger Detergenzienlösung spülen, wobei die Lösung in den Kanälen verbleibt. Überschuss von der Chipoberfläche absaugen und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 μl D-PBS. Lassen Sie D-PBS im unteren Kanal und entfernen Sie es vollständig aus dem oberen Kanal.
  6. 10 % Eselsserum (oder ein geeignetes Blockierungsmittel) für 1 h bei Raumtemperatur in den oberen Kanal geben. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 μl D-PBS. Lassen Sie D-PBS im unteren Kanal und entfernen Sie es vollständig aus dem oberen Kanal.
  7. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5%igem Eselsserum und fügen Sie sie dem oberen Kanal des Chips hinzu (zuvor getestete Antikörper und Konzentrationen sind in Lanik et al.36 verfügbar). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  8. Waschen Sie beide Kanäle 3x mit 200 μL D-PBS. Lassen Sie D-PBS im unteren Kanal und entfernen Sie es vollständig aus dem oberen Kanal.
  9. Verdünnte fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper, verdünnt um 1:200 in 5%igem Eselsserum in D-PBS und entweder Hoechst 33342 oder DAPI (Kernfärbungen). Fügen Sie sekundäre Antikörper zum oberen Kanal des Chips hinzu. 1 h lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Waschen Sie beide Kanäle 3x mit 200 μL D-PBS. Lassen Sie die Kanäle nach der letzten Wäsche mit D-PBS gefüllt. Platzieren Sie den Chip in einer Bildgebungsschale mit D-PBS für die Bildaufnahme mit konfokaler Mikroskopie.
    HINWEIS: Fixierte Chips, entweder gefärbt oder ungefärbt, können bei 4 °C bis zu 1 Woche in PBS gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle in dieser Zeit nicht austrocknen.

6. Isolierung von RNA, Präparation von cDNA und quantitative Real-Time-PCR

  1. Waschen Sie den unteren und oberen Kanal des Chips vorsichtig mit 200 μl D-PBS. D-PBS vollständig aus den Kanälen absaugen.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Zellen mit einem RNA-Extraktionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um RNA nur aus dem Epithel zu isolieren, infundieren Sie sie nur durch den oberen Kanal.
  3. Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration mit einem Nano-Volumen-Spektralphotometer. Transkribieren Sie 1 μg Gesamt-RNA. Führen Sie eine quantitative Echtzeit-PCR durch. Primer, die zuvor in diesem Modell verwendet wurden, sind in Lanik et al. 36 verfügbar.

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Representative Results

Enteroide wurden auf das mikrofluidische Gerät (Abbildung 1) gesät und wie oben beschrieben kultiviert. Das Wachstum der Enteroide im Zellkultur-Matrix-Hydrogel vor der Aussaat und die anschließende Expansion der Darmepithelzellmonoschicht nach der Aussaat des Gerätes wurde mittels Hellfeldmikroskopie überwacht (Abbildung 2). Es bildete sich eine konfluente intestinale Epithelzellmonoschicht, die sich anschließend zu einer reifen 3D-Zotten-ähnlichen Struktur entwickelte (Abbildung 2). Dieses mikrofluidische Gerät, das mit einem enteroidabgeleiteten neonatalen Darmepithel und HIMECs ausgestattet ist, ist als neonatales Darm-on-a-Chip-Modell36 bekannt.

Das NEC-on-a-Chip-Modell wurde entwickelt, um die mikrobielle Dysbiose während der neonatalen NEC zu rekapitulieren. Dieses Modell beinhaltet die Hinzufügung eines dysbiotischen Mikrobioms von einem Neugeborenen mit schwerem NEC zum neonatalen Darm-on-a-Chip-Modell. Mit der Hinzufügung dieses dysbiotischen Mikrobioms wurde die Expression einer Reihe von entzündungsfördernden Zytokinen, einschließlich des Tumornekrosefaktors alpha (TNFα; Abbildung 3), Interleukin (IL)-1 beta (IL-1β)36 und IL-8 wurde nachgewiesen 36. Dieser Anstieg der proinflammatorischen Zytokine spiegelt das wider, was für humanes NEC36 beobachtet wurde.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der enteroiden Kultur und der Mikrofluidik-Plattform. Krypten werden aus einem chirurgisch resezierten Stück Neugeborenendarm isoliert und in Zellkulturmatrix-Hydrogel gesät und zu Darmenteroiden gezüchtet. Enteroide werden dissoziiert und im oberen Kanal des Mikrofluidikgeräts ausgesät, das mit extrazellulärer Matrix (ECM) beschichtet ist. Dem unteren Kanal werden dann Endothelzellen (HIMECs) hinzugefügt. Figur erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Progression von Darmepithelzellen, die mit dem neonatalen Darm-on-a-Chip-Modell gezüchtet wurden. Bilder, die mit der Hellfeldmikroskopie aufgenommen wurden, zeigen neonatale Enteroide an Tag 0, eine Epithelzell-Monoschicht im Chip an Tag 3 und sichtbare zottenartige Strukturen an Tag 7. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. NEC-on-a-Chip TNFα-mRNA-Expression von Darmepithelzellen. Vergleich der TNFα-mRNA-Spiegel bei Inkubation mit Medien allein (Kontrolle) oder einem dysbiotischen Mikrobiom eines Säuglings mit NEC (NEC-on-a-Chip) für 24 h oder 72 h. **** p < 0,0001 vs. Kontrolle 24 h; ** p < 0,005 vs. Kontrolle 72 h durch Mann-Whitney U-Test. n=9 für Kontrolle 24 h; n=10 für NEC-on-a-Chip 24 h; n=6 für Kontrolle 72 h; n=5 für NEC-on-a-Chip 72 h. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1. Medienzusammensetzung für die Kryptenisolierung und das Wachstum von Enteroiden. Siehe Van Dussen et al.40 und Miyoshi et al.41 für detaillierte Methoden, die die Herstellung von L-WRN-konditionierten Medien beschreiben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. Medienkomposition für das NEC-on-a-Chip-Modell. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Dieses NEC-on-a-Chip-System ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, mit dem die Pathophysiologie von NEC modelliert werden kann. Diese Plattform bietet eine komplexe Mikroumgebung, die dem In-vivo-Darmmilieu ähnlicher ist als frühere Modelle, indem sie ein Co-Kultursystem mit kontinuierlichem luminalem Fluss und Dehnung enthält. Diese Bedingungen begünstigen die Entwicklung einer zottenartigen 3D-Architektur, die von einem stark polarisierten Epithel ausgekleidet ist, das aus reifen epithelialen Subtypen und Tight Junctions besteht (Abbildung 2)36. Darüber hinaus ist die apikale Epitheloberfläche leicht zugänglich, um experimentellen Stimuli ausgesetzt zu werden, wie z. B. von Patienten stammender Mikrobiota oder neuartigen Therapeutika. Schließlich könnte dieses Modell auch verwendet werden, um eine Vielzahl von entzündlichen und nicht-entzündlichen Darmerkrankungen sowie Mechanismen der normalen Darmepithelentwicklung zu untersuchen, indem Enteroide verwendet werden, die aus den relevanten Patientenpopulationen stammen. Dieses Modell ermöglicht die Maximierung der Datenerfassung aus einer einzigen Patientenprobe, was angesichts der begrenzten Verfügbarkeit und Größe von Darmproben bei Neugeborenen unerlässlich ist.

Mit diesem Modell wurden viele der physiologischen Veränderungen im Darmepithel beobachtet, die während der NEC bei Säuglingen auftreten. Die Zugabe des dysbiotischen Mikrobioms eines Patienten mit schwerem NEC führte zu einer Hochregulierung inflammatorischer Zytokine (Abbildung 3), einer erhöhten Durchlässigkeit der Darm-on-a-Chip-Barriere, einem erhöhten Zelltod, einer verminderten Proliferation und dem Verlust reifer epithelialer Subtypen36. Zukünftige Studien, die dieses Modell verwenden, können sich daher darauf konzentrieren, die Mechanismen zu bestimmen, die der Entwicklung von NEC zugrunde liegen, und mögliche therapeutische Interventionen.

Bei der Implementierung eines komplexen Modells wie NEC-on-a-Chip gibt es inhärente Einschränkungen. Dieses System erfordert spezielle Geräte, Reagenzien und Schulungen, um die Mikrofluidik-Plattform nutzen zu können. Darüber hinaus erfordert das Modell viel Liebe zum Detail, wobei die genaue Vorbereitung der verschiedenen Medien, die ordnungsgemäße Aussaat des Chips und die Aufrechterhaltung der sterilen Technik entscheidend für den Erfolg sind. Die Prüfärzte müssen auch Zugang zu Darmproben oder Enteroiden von Neugeborenen haben, die in der Regel nur in quartären Versorgungszentren mit Kinderchirurgen erhältlich sind, es sei denn, sie werden durch Mitarbeiter erhalten. Schließlich erhöht die Einbeziehung weiterer wichtiger Komponenten in die Pathophysiologie von NEC, wie z.B. Immunzellen oder Hypoxie, die Schwierigkeit dieses Modells weiter, obwohl die physiologische Relevanz erhöht wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NEC-on-a-Chip ein wichtiger Fortschritt auf dem Gebiet der NEC-Forschung ist, der die Qualität mechanistischer Studien verbessern und die Erprobung neuartiger Therapeutika für NEC erleichtern wird. Das ultimative Ziel dieser Forschung ist es, zielgerichtete Therapien zu entwickeln und zu testen, die die Ergebnisse für Säuglinge mit Darmentzündungen und NEC verbessern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Manuskript bestehen.

Acknowledgments

Dieses Manuskript wurde unterstützt von R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) und R01HD105301 (MG) der National Institutes of Health, dem Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), einem Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), einem UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) durch die großzügige Unterstützung von Spendern der University of North Carolina in Chapel Hill, und der Abteilung für Pädiatrie an der University of North Carolina in Chapel Hill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

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References

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Mikrofluidisches Modell nekrotisierende Enterokolitis humane neonatale Darmenteroide dysbiotisches Mikrobiom komplexe Pathogenese intestinale Tight Junctions Durchlässigkeit der Darmbarriere Epithelzelltod mikrobielle Dysbiose dysregulierte Entzündung Tiermodelle Zelllinien Darmorganoide In-vitro-Modell Mikrofluidik-Technologie NEC-on-a-Chip Frühgeborenes menschliche Endothelzellen Arzneimittelforschungstests
Mikrofluidisches Modell der nekrotisierenden Enterokolitis unter Einbeziehung menschlicher neonataler Darmenteroide und eines dysbiotischen Mikrobioms
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Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

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