Summary
该协议概述了一种从豚鼠颞骨中移植圆窗膜的方法，为 离体 研究提供了宝贵的资源。
Abstract
高效和微创的药物输送到内耳是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）是内耳为数不多的入口点之一，已成为研究的重要焦点。然而，由于分离RWM的复杂性，我们对其药代动力学的理解仍然有限。RWM 由三个不同的层组成：外上皮层、中间结缔组织层和内上皮层，每个层都可能具有独特的递送特性。
目前用于研究跨 RWM 转运的模型利用依赖于细胞培养物或膜片段的体内动物模型或离体 RWM 模型。豚鼠是研究内耳内药物药代动力学的经过验证的临床前模型，也是耳蜗递送载体转化开发的重要动物模型。在这项研究中，我们描述了一种移植具有周围耳蜗骨的豚鼠 RWM 用于台式药物递送实验的方法。这种方法允许保留原生 RWM 架构，并且可以提供比当前台式模型更真实的运输障碍表示。
Introduction
已经出现了用于治疗感音神经性听力损失的新型疗法。这些疗法在临床人群的转化受到安全有效的内耳运输途径的限制。目前在动物研究中 的体内 递送方法依赖于开窗进入内耳或通过圆窗膜 （RWM） 扩散，圆窗膜是一种将中耳间隙与耳蜗分开的非骨屏障1。
手术开窗和显微注射到内耳都是侵入性的，可能会对残余内耳功能构成风险2.因此，RWM 是局部药物递送的重要途径，豚鼠是主要的临床前动物模型，用于研究 RWM 和内耳的局部药物药代动力学，用于药物开发 3,4。虽然比人类RWM更薄，但豚鼠RWM具有相同的三层结构。它的直径约为 1 mm，厚度为 15-25 μm，由夹在结缔组织层5 中的两个上皮细胞层组成。面向中耳的上皮层密集堆积，并通过紧密的连接连接，而面向内耳和鳞状鼓膜的层结构较松，没有明显的细胞间粘连。
目前调查豚鼠 RWM 药物渗透性的临床前研究依赖于体内中耳注射，然后对内耳内的外淋巴液进行采样，这不允许对 RWM 转运进行特异性研究 6,7。RWM 外植体的片段已用于临床前研究，但由于其脆弱性和小尺寸，它们不适合对需要跨 RWM2 的防水密封的药物和载体运输进行系统的微流体研究。其他研究小组使用培养的人上皮细胞的体外模型来近似RWM 8,9,10。然而，这些结构中的大多数只关注外上皮层，并没有捕捉到天然组织结构的复杂性。为了更详细地了解RWM的转运机制，需要有针对性的离体研究。
在这项研究中，我们展示了豚鼠 RWM 的移植与周围的骨支撑以保持膜完整性，并说明了它们在专为特定研究药物递送载体的 RWM 运输而设计的实验范式中的使用。
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Protocol
所有动物程序均由机构动物护理和使用委员会 （GP18M226） 批准。本研究使用了哈特利白化豚鼠（雄性和雌性，体重 500-700 克）。
1. 程序设置和准备
- 在开始实验之前，用环氧乙烷对所有仪器进行灭菌。
- 按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
注意：在目前的研究中，采用非预充电室从商用气瓶中释放 100% 二氧化碳 （CO2）。根据 2020 年 AVMA指南 11，使用在线限流器调节气体流量，将其保持在每分钟腔室体积的 30% 至 70% 范围内。 - 将动物置于腔室中并分配二氧化碳5分钟，呼吸停止后保持CO2 流动1分钟。
- 呼吸骤停后进行斩首，以确保安乐死。
2. 手术入路和移植
- 以通常的方式从豚鼠头骨中提取颞骨12.用 rongeur 去除多余的软组织。识别外耳道、颞大疱和面管13 （图 1）。
- 用 6 mm 的金刚石钻头钻掉颞大疱的腹侧（见 材料表），圆周暴露中耳间隙和外耳道。
- 使用rongeurs，轻轻去除外耳道和鼓室环，同时分离incudomalleolar关节。识别砧骨、耳蜗关节、耳蜗、水平半规管和面管13 （图 2A）。
- 分离镊子关节并用镊子取出砧骨。识别圆窗的骨质壁龛。
- 使用 6 mm 金刚石钻头钻掉连接耳蜗和鼓室内侧壁朝向鼓膜张管的骨层。小心地减压鼓膜张肌的骨通道，并使用 28 G 针去除鼓膜张肌。
注意：鼓膜张肌窝的内侧壁直接与RWM周围的耳蜗骨相连，注意不要引起可能延伸到圆窗的骨折。 - 钻掉连接耳蜗和鼓室下壁的骨层，直到剩下 1 毫米的骨架与耳蜗相邻（图 2B）。
- 使用 2 毫米的金刚石钻头（见 材料表），在耳蜗基底处进行人工耳蜗造口术，将大约 2 毫米的骨头留给圆窗。在与圆窗膜平行的平面上继续下方的耳蜗造口术，以将耳蜗的底部与耳蜗的顶点分开。
- 将耳蜗造口切口延伸到颅底，颅底密度要大得多，从而获得耳蜗基底转弯的横截面视图。
注意：将钻头对准内耳道的鼻道会产生一个轨迹，最大限度地去除骨头，同时避免过近圆窗。 - 从颅底侧检查标本，如果尚未完成，则识别内耳道并钻入耳蜗孔。用 28 G 针取出耳蜗神经。
- 从耳蜗侧检查标本。用镊子或 28 G 针识别并去除基底转弯处的骨螺旋层和剩余的 modiolus。
- 大量冲洗统一的鳞状鼓膜-鳞状前庭腔以清除碎屑。圆窗应从结肠切除术中清晰可见，没有任何覆盖碎屑（图2C）。
- 接下来，从中耳侧检查标本。将外侧半规管和面管钻至椭圆形窗口的水平。用镊子轻轻取下镫骨，露出椭圆形窗龛。值得注意的是，镫骨的嵴之间有一座骨桥，称为镫骨。
- 使用 1 毫米的金刚石钻头（见 材料表），通过沿圆窗的表面延伸椭圆形窗口来进一步打开前庭，注意保持 1-2 毫米的耳蜗骨与圆窗壁龛相邻（图 2D）。
- 通过将椭圆形窗口切口与圆窗两侧的耳蜗切除切口连接起来完成颞骨切口。
注意：由于耳蜗骨的脆弱性，将鼓膜张肌窝保留在标本中并避免切开它将有助于防止延伸到 RWM 并损害其完整性的耳蜗骨折。 - 将最后的附着物连接到靠近内耳道的颅底致密骨上，然后轻轻剃掉以产生切除的 RWM 标本（图 3A）。
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Representative Results
如 图3A所示，该方法允许移植完整的豚鼠圆窗膜，并带有周围的刚性骨环。RWM 应在圆周上与骨环完全连接。不应意识到耳蜗骨折。与人类圆窗标本相比，豚鼠RWM没有覆盖的假膜。此外，与人类不同的是，豚鼠镫骨的骨桥之间有一座骨桥，需要在提取镫骨上部结构之前将其压裂和移除。代表性RWM的组织学分析（图3B）显示清晰的三层上皮结构，具有相邻的、完整的圆窗壁龛。
从技术角度来看，有两个关键步骤。首先，在步骤 2.7 中进行耳环切除术时，重要的是使用钻头的赤道而不是尖端进行切割，因为毛刺尖端的抖动会导致耳蜗骨的创伤性骨折，并可能延伸到圆窗膜。其次，重要的是完全钻出内耳道，因为这样可以完全切除耳蜗神经并更容易解剖骨螺旋层，从而在耳蜗内侧形成一个统一的腔，用于实验取样 （图2C）。
成功提取RWM后，我们小组利用改良的Ussing室来评估膜的药代动力学特性。改良的 Ussing 室已在鼓膜和圆窗膜以及视网膜组织中得到其他小组的验证，以评估上皮膜的转运特性14,15。该 3D 打印设备使用 Poly-Jet Vero 构建，由两个三角形底座组成，每个底座都有一个 400 μL 的流体室（图 3）。RWM 的骨缘使用 2 部分环氧树脂（大猩猩，见材料表）固定在底座上，然后用硅密封胶（见材料表）确保防水密封（图 4）。一丝不苟地避免任何环氧树脂或密封剂接触膜。将RWM夹在适当的位置后，然后用环氧树脂将两个底座粘合在一起。在转运实验期间，加载（面向中耳）填充含有递送载体（或任何感兴趣的分子）的磷酸盐缓冲盐水 （PBS），采样室（鳞状鼓膜）仅填充 PBS。每隔一段时间，采样室中的流体就会被完全吸出，并被新鲜的PBS取代。
在每次实验期间都采取质量控制措施，以确保设备内的样品周围既有水密密封，又有完全完整的膜，没有微孔。棕色铁芯纳米颗粒溶液的代表性结果如下所示。水密密封的定量验证是通过在每个取样间隔内吸入取样室的全部容积来完成的;从采样室泄漏的液体将导致吸入量小于全部吸气量。在每次实验结束时，装载室中的流体体积也应保持不变。此外，由于我们的目标流体是棕色的，因此在发生泄漏时也很容易看到。
为了确保膜内没有泄漏，采取了几种方法。首先，立即提取本研究中使用的RWM标本，光，共聚焦和电子显微镜图像确认完整的细胞和膜结构，没有微穿孔（图3A，B）。其次，在RWM样品的子集中故意创建了微穿孔，以比较对纳米颗粒递送的影响。对取样室和上样室抽吸物进行目视检查可进一步确认试样完整性和防水附着。在带孔的RWM中，加载室和采样室的快速平衡，这可以通过明显的颜色变化来观察（补充图1）。此外，还发现微穿孔RWM中的传输高于在完整膜中观察到的最大方差（补充图2）。它们共同用作试样周围水密密封完整性的质量控制机制，以及 RWM。
图1：豚鼠颞骨术前图像。 鼓室大疱、外耳道和面管 （*） 显示在这张豚鼠颞骨的术前图像中。比例尺 = 1 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：术中图像。 术中图像显示圆窗膜与砧骨 （*）、耳蜗 （**）、镫骨 （†） 和减压的内耳道 （‡） 之间的关系。阴影区域表示将要移除的标本部分。（A）切除鼓膜和面神经后的豚鼠中耳腔（步骤2.3）。（B）鼓膜张管减压后的中耳腔（步骤2.6）。（C） 耳蜗造口术和切除内耳内容物后 RWM 的基础视图（步骤 2.11）。（D） 去除镫骨和识别前庭后的 RWM 视图（步骤 2.13）。比例尺 = A，B （1 cm）; C，D （5 毫米）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：最终的 RWM 标本和组织学。 （A） 具有骨环的豚鼠 RWM 大体标本。比例尺 = 1 cm。 （B） 移植的豚鼠圆窗膜的组织学显示完整的三层结构。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：用于跨膜转运实验的微流控装置。 （A）用于跨膜转运实验的微流控装置图。（乙、丙）用于实验的印刷微流控装置。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1：5 小时铁芯纳米颗粒递送实验中的加载和采样室内容物。 （A）随着纳米颗粒浓度的降低，完整RWM的加载室显示出颜色强度的逐渐降低。（B） 完整 RWM 的采样室随着时间的推移显示出稳定的着色，与低水平的纳米颗粒输送一致。（C） 当内容物与采样室平衡时，穿孔 RWM 的装载室显示出颜色强度的快速降低。（D）穿孔RWM的采样室显示颜色随时间逐渐增加，与高水平的纳米颗粒输送一致。 请点击此处下载此文件。
补充图2：纳米颗粒递送的代表性传输结果。 纳米颗粒（Fe3O4 芯，聚乙二醇涂层，平均半径为 77 nm）在豚鼠 RWM 上递送的代表性传输结果，包括完整和穿孔（平均 ± SD，n ≥ 3 个 RWM 实验）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在局部药物递送至耳部时，RWM 是治疗药物到达内耳的主要途径。需要一个准确可靠的台式模型来更好地了解新型递送载体和药物开发的运输机制和渗透性。在这项研究中，我们证明了豚鼠 RWM 移植是一种可行且可靠的程序，可以对药物-膜相互作用进行系统研究。Lundman 等人和 Kelso 等人先前使用类似的 RWM 渗透率模型 2,16 进行了描述;然而，到目前为止，手术取出的具体步骤尚未详细说明，耳蜗骨的脆弱性和复杂的解剖结构对完整 RWM 的一致、整体收获构成了挑战。
豚鼠RWM位于耳蜗鳞状鼓膜的末端，周围有一层薄薄的耳蜗骨。在移植过程中，这种骨结构的断裂可能导致标本无法使用，因为如果周围的耳蜗骨不能保持完整，RWM 往往会撕裂。我们小组指出，骨折最常发生在高密度颅底骨和脆性耳蜗之间的交界处附近钻孔时，因为骨密度的转变增加了骨折通过圆窗扩展的可能性。出于这个原因，建议保持附着在耳蜗附近的耳蜗的鼓膜窝张肌的致密骨，将增加标本收获的产量，特别是在老年动物中。在去除耳蜗内容物的过程中，也可能发生骨骼破坏;必须注意轻轻去除骨螺旋层，同时尽量减少对周围耳蜗的操纵。
该模型要考虑的一个重要细节是移植后 RWM 的可行性。先前的小组表明，哺乳动物 RWM 在提取后 24-48 小时内仍可存活17。本研究反映了这些发现;一致的转运研究和组织学分析表明完整的细胞结构（图2A）都支持豚鼠RWM在实验时的生存能力。为了保持提取标本的整体健康，在安乐死后 3 小时内提取并嵌入 RWM。
在 体内RWM的药物药代动力学研究中，测量外淋巴分布和浓度仍然存在相当大的技术困难1。鼓室内给药方法和应用量的变化导致了不同的治疗结果。迷宫内复杂的流体动力学以及注入材料通过咽鼓管的不规则出口加剧了这些困难。所描述的移植方法允许对RWM和影响其作为 离体 模型的渗透性的因素进行孤立研究。此外，外植体还允许直接询问和可视化目前用于增加RWM渗透性的各种方法，例如超声微泡18 和化学诱导的连接调制19。未来对药物递送中涉及的特定内吞机制的研究也将受益于这种台式模型。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIDCD拨款编号1K08DC020780和5T32DC000027-33以及鲁宾斯坦听力研究基金的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
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