Summary
Questo protocollo delinea un metodo per l'espianto della membrana della finestra rotonda dalle ossa temporali dei porcellini d'India, fornendo una risorsa preziosa per gli studi ex vivo .
Abstract
La somministrazione efficiente e minimamente invasiva dei farmaci all'orecchio interno è una sfida significativa. La membrana a finestra rotonda (RWM), essendo uno dei pochi punti di ingresso all'orecchio interno, è diventata un punto focale di indagine. Tuttavia, a causa della complessità dell'isolamento dell'RWM, la nostra comprensione della sua farmacocinetica rimane limitata. L'RWM comprende tre strati distinti: l'epitelio esterno, lo strato intermedio di tessuto connettivo e lo strato epiteliale interno, ciascuno dei quali possiede proprietà di rilascio uniche.
Gli attuali modelli per studiare il trasporto attraverso l'RWM utilizzano modelli animali in vivo o modelli RWM ex vivo che si basano su colture cellulari o frammenti di membrana. I porcellini d'India fungono da modello preclinico validato per lo studio della farmacocinetica dei farmaci all'interno dell'orecchio interno e sono un importante modello animale per lo sviluppo traslazionale di veicoli di somministrazione alla coclea. In questo studio, descriviamo un approccio per l'espianto di un RWM di cavia con osso cocleare circostante per esperimenti di somministrazione di farmaci da banco. Questo metodo consente di preservare l'architettura RWM nativa e può fornire una rappresentazione più realistica delle barriere al trasporto rispetto agli attuali modelli da banco.
Introduction
Sono emerse nuove classi di terapie per il trattamento dell'ipoacusia neurosensoriale. La traduzione di queste terapie nelle popolazioni cliniche è limitata da vie di trasporto sicure ed efficaci nell'orecchio interno. Gli attuali metodi di somministrazione in vivo negli studi sugli animali si basano sulla fenestrazione nell'orecchio interno o sulla diffusione attraverso la membrana a finestra rotonda (RWM), una barriera non ossea che separa lo spazio dell'orecchio medio dalla coclea1.
La fenestrazione chirurgica e la microiniezione nell'orecchio interno sono entrambe invasive e possono comportare rischi per la funzione residua dell'orecchio interno2. Pertanto, l'RWM è una via importante per la somministrazione locale di farmaci e le cavie sono il principale modello animale preclinico utilizzato per studiare la farmacocinetica dei farmaci locali attraverso l'RWM e nell'orecchio interno per lo sviluppo farmaceutico 3,4. Sebbene più sottile dell'RWM umano, il porcellino d'India RWM condivide un'identica struttura a tre strati. Ha un diametro di circa 1 mm, uno spessore di 15-25 μm ed è composto da due strati di cellule epiteliali che racchiudono uno strato di tessuto connettivo5. Lo strato epiteliale rivolto verso l'orecchio medio è densamente impacchettato e collegato tramite giunzioni strette, mentre lo strato rivolto verso l'orecchio interno e la scala timpanica ha un'architettura più sciolta e non ha aderenze intercellulari significative.
Gli attuali studi preclinici che indagano la permeabilità ai farmaci nella RWM cavia si basano su iniezioni in vivo nell'orecchio medio seguite dal campionamento del liquido perilinfatico all'interno dell'orecchio interno, il che non consente lo studio specifico del trasporto RWM 6,7. Frammenti di espianti RWM sono stati utilizzati in studi preclinici, ma a causa della loro fragilità e delle loro piccole dimensioni, non sono adatti per indagini microfluidiche sistematiche sul trasporto di farmaci e veicoli che richiedono una tenuta stagna attraverso l'RWM2. Altri gruppi hanno impiegato modelli in vitro con cellule epiteliali umane in coltura per approssimare l'RWM 8,9,10. Tuttavia, la maggior parte di questi costrutti si concentra esclusivamente sullo strato epiteliale esterno e non cattura la complessità dell'architettura del tessuto nativo. Per una comprensione più dettagliata dei meccanismi di trasporto attraverso l'RWM, sono necessari studi mirati ex vivo.
In questo studio, dimostriamo l'espianto di un RWM di cavia con supporto osseo circostante per preservare l'integrità della membrana e illustriamo il loro utilizzo in un paradigma sperimentale progettato per lo studio specifico del trasporto RWM di veicoli per la somministrazione di farmaci.
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Protocol
Tutte le procedure per la cura e l'uso degli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (GP18M226). Nel presente studio sono stati utilizzati porcellini d'india albini Hartley (sia maschi che femmine, del peso di 500-700 g).
1. Impostazione e preparazione della procedura
- Sterilizzare tutti gli strumenti con ossido di etilene prima di iniziare l'esperimento.
- Sopprimere gli animali seguendo il protocollo istituzionalmente approvato.
NOTA: Nel presente studio, è stata impiegata una camera non precaricata per rilasciare il 100% di anidride carbonica (CO2 ) da una bombola commerciale. Un limitatore in linea è stato utilizzato per regolare il flusso di gas, mantenendolo nell'intervallo compreso tra il 30% e il 70% del volume al minuto della camera in conformità con le linee guida AVMA 202011. - Posizionare l'animale nella camera ed erogare anidride carbonica per 5 minuti. Il flusso di CO2 viene mantenuto per 1 minuto dopo l'arresto respiratorio.
- Eseguire la decapitazione dopo l'arresto respiratorio per garantire l'eutanasia.
2. Approccio chirurgico ed espianto
- Estrarre l'osso temporale dal cranio del porcellino d'India nel modo consueto12. Rimuovere i tessuti molli in eccesso con un rongeur. Identificare il meato acustico esterno, la bolla temporale e il canale facciale13 (Figura 1).
- Forare gli aspetti ventrali della bolla temporale con una punta diamantata da 6 mm (vedi Tabella dei materiali), esponendo circonferenzialmente lo spazio dell'orecchio medio e il condotto uditivo esterno.
- Utilizzando i rongeur, rimuovere delicatamente il condotto uditivo esterno e l'anello timpanico, separando contemporaneamente l'articolazione incudomalleolare. Identificare l'incudine, l'articolazione incudostapediale, la coclea, il canale semicircolare orizzontale e il canale facciale13 (Figura 2A).
- Separare l'articolazione incudostapediale e rimuovere l'incudine usando una pinza. Identifica la nicchia ossea della finestra rotonda.
- Utilizzare una punta diamantata da 6 mm per perforare la lamina ossea che collega la coclea con la parete mediale della cavità timpanica verso il canale tensore del timpano. Decomprimere con cura il canale osseo del tensore del timpano e rimuovere il muscolo tensore del timpano utilizzando un ago da 28 G.
NOTA: La parete mediale della fossa tensoriale del timpano si collega direttamente con l'osso cocleare intorno al RWM e si presta attenzione a non causare fratture che possono estendersi alla finestra rotonda. - Perforare la lamina ossea che collega la coclea alla parete inferiore della cavità timpanica fino a quando non rimane 1 mm di sporgenza ossea adiacente alla coclea (Figura 2B).
- Utilizzando una punta diamantata da 2 mm (vedi Tabella dei materiali), eseguire una cocleostomia in corrispondenza del giro basale della coclea, lasciando circa 2 mm di osso alla finestra rotonda. Continuare la cocleostomia inferiormente su un piano parallelo alla membrana della finestra rotonda per separare la base dall'apice della coclea.
- Estendere il taglio della cocleostomia attraverso la base del cranio, che è molto più densa, ottenendo una visione in sezione trasversale del giro basale della coclea.
NOTA: Puntando il trapano verso il meato del condotto uditivo interno si ottiene una traiettoria che massimizza la rimozione dell'osso evitando di avvicinarsi troppo alla finestra rotonda. - Esaminare il campione dal lato della base del cranio e, se non è già stato fatto, identificare il condotto uditivo interno e perforare l'apertura cocleare. Rimuovere il nervo cocleare con un ago da 28 G.
- Esaminare il campione dal lato intracocleare. Identificare e rimuovere la lamina spirale ossea nel giro basale e il modiolo rimanente con una pinza o un ago da 28 G.
- Irrigare copiosamente la cavità unificata dei vestiboli scala-scala per rimuovere i detriti. La finestra rotonda deve essere chiaramente visibile dalla cochectomia senza detriti sovrastanti (Figura 2C).
- Quindi, esamina il campione dal lato dell'orecchio medio. Forare il canale semicircolare laterale e il canale facciale fino al livello della finestra ovale. Rimuovere delicatamente le staffe usando una pinza, esponendo la nicchia ovale della finestra. Da notare che c'è un ponte osseo tra la crura delle staffe noto come crista stapedis.
- Utilizzando un trapano diamantato da 1 mm (vedi Tabella dei materiali), aprire ulteriormente il vestibolo estendendo la finestra ovale lungo la faccia della finestra rotonda, avendo cura di mantenere 1-2 mm di osso cocleare adiacente alla nicchia rotonda della finestra (Figura 2D).
- Completa i tagli dell'osso temporale collegando i tagli della finestra ovale con i tagli della coclectomia su ciascun lato della finestra rotonda.
NOTA: A causa della fragilità dell'osso cocleare, preservare la fossa tensoriale del timpano nel campione ed evitare tagli attraverso di essa aiuterà a prevenire le fratture dell'osso cocleare che si estendono all'RWM e ne compromettono l'integrità. - Effettuare gli attacchi finali all'osso denso della base cranica adiacente al condotto uditivo interno e radere delicatamente per ottenere un campione RWM asportato (Figura 3A).
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Representative Results
Come dimostrato nella Figura 3A, questo metodo consente l'espianto della membrana a finestra rotonda intatta del porcellino d'India con un anello circostante di osso rigido. L'RWM deve essere completamente collegato all'anulus osseo circonferenzialmente. Non devono essere apprezzate fratture dell'osso cocleare. Rispetto agli esemplari umani a finestra rotonda, il porcellino d'India RWM non ha una pseudomembrana sovrastante. Inoltre, a differenza degli esseri umani, c'è un ponte osseo tra la crura delle staffe dei porcellini d'India, che richiede la frattura e la rimozione prima dell'estrazione della sovrastruttura della staffa. L'analisi istologica (Figura 3B) dell'RWM rappresentativo mostra una chiara struttura epiteliale a tre strati con una nicchia di finestra rotonda adiacente e intatta.
Dal punto di vista tecnico, ci sono due passaggi critici. In primo luogo, quando si esegue la cochectomia nel passaggio 2.7, è importante utilizzare l'equatore della punta del trapano, piuttosto che la punta, per eseguire il taglio, poiché il nervosismo sulla punta della fresa può portare a fratture traumatiche nell'osso cocleare che possono estendersi alla membrana della finestra rotonda. In secondo luogo, è importante perforare completamente il canale uditivo interno, in quanto ciò consente la completa rimozione del nervo cocleare e una più facile dissezione della lamina spirale ossea, ottenendo una cavità unificata sul lato intracocleare per il campionamento sperimentale (Figura 2C).
Dopo che l'RWM è stato estratto con successo, il nostro gruppo ha utilizzato una camera di Ussing modificata per valutare le proprietà farmacocinetiche della membrana. La camera di Ussing modificata è stata validata da altri gruppi in membrane timpaniche e a finestra rotonda, nonché in tessuto retinico per valutare le proprietà di trasporto delle membrane epiteliali14,15. Questo dispositivo stampato in 3D è stato costruito utilizzando Poly-Jet Vero ed è costituito da due pezzi di base triangolari, ciascuno con una camera fluida da 400 μL (Figura 3). Il bordo osseo dell'RWM è fissato alla base utilizzando resina epossidica in 2 parti (Gorilla, vedere la tabella dei materiali), seguita da sigillante siliconico (vedere la tabella dei materiali) per garantire una tenuta stagna (figura 4). Viene prestata meticolosa attenzione per evitare che qualsiasi resina epossidica o sigillante entri in contatto con la membrana. Con l'RWM inserito a sandwich, le due basi vengono poi incollate insieme con resina epossidica. Durante gli esperimenti di trasporto, il carico (rivolto verso l'orecchio medio) viene riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente il veicolo di rilascio (o qualsiasi molecola di interesse) e la camera di campionamento (rivolta verso scala timpanica) viene riempita solo con PBS. A intervalli di tempo regolari, il fluido proveniente dalla camera di campionamento viene completamente aspirato e sostituito con PBS fresco.
Durante ogni esperimento vengono adottate misure di controllo della qualità per garantire che vi sia sia una tenuta stagna intorno al campione all'interno dell'apparecchiatura, sia una membrana completamente intatta senza microperforazioni. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi con una soluzione di nanoparticelle marroni con nucleo di ferro. La verifica quantitativa di una tenuta stagna viene eseguita aspirando l'intero volume della camera di campionamento durante ogni intervallo di campionamento; La fuoriuscita di fluido dalla camera di campionamento comporterebbe un volume di aspirazione inferiore a quello completo. Al termine di ogni esperimento, anche il volume del fluido nella camera di carico dovrebbe rimanere lo stesso. Inoltre, poiché il nostro fluido target è di colore marrone, è anche facilmente visibile in caso di perdita.
Per garantire l'assenza di perdite all'interno della membrana, sono stati adottati diversi approcci. In primo luogo, i campioni RWM utilizzati in questo studio vengono tutti estratti immediatamente e le immagini di microscopia ottica, confocale ed elettronica confermano le strutture cellulari e di membrana intatte senza microperforazioni (Figura 3A, B). In secondo luogo, le microperforazioni sono state deliberatamente create in un sottoinsieme di campioni RWM per confrontare l'effetto sulla consegna di nanoparticelle. L'ispezione visiva dell'aspirato della camera di campionamento e di carico serve come ulteriore conferma dell'integrità del campione e dell'attacco a tenuta stagna. Nell'RWM con perforazioni, c'è un rapido equilibrio della camera di carico e campionamento, che può essere osservato attraverso un distinto cambiamento di colore (Figura 1 supplementare). Inoltre, è stato riscontrato che il trasporto negli RWM microperforati era superiore alla varianza massima osservata nelle membrane intatte (Figura 2 supplementare). Insieme, questi fungono da meccanismi di controllo della qualità per l'integrità del sigillo a tenuta stagna che circonda il campione, così come l'RWM.
Figura 1: Immagine preoperatoria dell'osso temporale del porcellino d'India. La bolla timpanica, il canale uditivo esterno e il canale facciale (*) sono mostrati in questa immagine preoperatoria dell'osso temporale del porcellino d'India. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini intraoperatorie. Immagini intraoperatorie che dimostrano la relazione tra la membrana della finestra rotonda e l'incudine (*), la coclea (**), la staffa (†) e il canale uditivo interno decompresso (‡). Le aree ombreggiate indicano le parti del campione che verranno rimosse. (A) Cavità dell'orecchio medio del porcellino d'India dopo la rimozione della membrana timpanica e del nervo facciale (passaggio 2.3). (B) Cavità dell'orecchio medio dopo la decompressione del tensore del canale timpanico (fase 2.6). (C) Vista basale di RWM dopo cocleostomia e rimozione del contenuto dell'orecchio interno (passaggio 2.11). (D) Vista dell'RWM dopo la rimozione della staffa e l'identificazione del vestibolo (fase 2.13). Barra della scala = A,B (1 cm); C,D (5 mm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Campione finale RWM e istologia. (A) Esemplare grossolano RWM di porcellino d'India con anulus osseo. Barra della scala = 1 cm. (B) L'istologia della membrana a finestra rotonda del porcellino d'India espiantato mostra una struttura intatta a tre strati. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dispositivo microfluidico per esperimenti di trasporto transmembrana. (A) Schema del dispositivo microfluidico utilizzato per esperimenti di trasporto transmembrana. (B,C) Dispositivo microfluidico stampato per gli esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Caricamento e campionamento del contenuto della camera in un esperimento di consegna di nanoparticelle con nucleo di ferro di 5 ore. (A) La camera di carico dell'RWM intatto mostra una graduale diminuzione dell'intensità del colore al diminuire della concentrazione di nanoparticelle. (B) La camera di campionamento di RWM intatto mostra una colorazione stabile nel tempo, coerente con bassi livelli di rilascio di nanoparticelle. (C) La camera di carico dell'RWM perforato mostra una rapida diminuzione dell'intensità del colore quando il contenuto si equilibra con la camera di campionamento. (D) La camera di campionamento dell'RWM perforato mostra un graduale aumento del colore nel tempo, coerente con alti livelli di rilascio di nanoparticelle. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura 2 supplementare: Risultati rappresentativi del trasporto per la consegna di nanoparticelle. Risultati rappresentativi del trasporto per la consegna di nanoparticelle (nucleo di Fe3O4 con rivestimento in polietilenglicole, raggio medio di 77 nm) attraverso RWM di cavia, sia intatti che con perforazioni (media ± SD, n ≥ 3 esperimenti RWM). Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Nella somministrazione locale di farmaci all'orecchio, l'RWM è la principale via di passaggio per le terapie per raggiungere l'orecchio interno. È necessario un modello da banco accurato e affidabile per comprendere meglio i meccanismi di trasporto e la permeabilità attraverso i nuovi veicoli di somministrazione e per lo sviluppo di farmaci. In questo studio, dimostriamo che l'espianto di RWM da cavia è una procedura fattibile e affidabile per consentire indagini sistematiche sulle interazioni farmaco-membrana. Lundman et al. e Kelso et al. hanno precedentemente descritto l'utilizzo di un modello di permeabilità RWM simile 2,16; tuttavia, le fasi specifiche dell'estrazione chirurgica non sono state dettagliate fino ad ora e la fragilità dell'osso cocleare e l'anatomia complessa hanno rappresentato una sfida per il prelievo coerente e in blocco di RWM intatti.
Il porcellino d'India RWM si trova all'estremità della scala timpana della coclea ed è circondato da un sottile strato di osso cocleare. La frattura di questa struttura ossea durante il processo di espianto può risultare in un campione inutilizzabile, poiché l'RWM tende a strapparsi se l'osso cocleare circostante non rimane intatto. Il nostro gruppo ha notato che le fratture si sono verificate più spesso durante la perforazione vicino alla giunzione tra l'osso della base cranica altamente denso e la coclea fragile, poiché la transizione nella densità ossea ha aumentato la probabilità di propagazione della frattura attraverso la finestra rotonda. Per questo motivo, si suggerisce che mantenere l'osso più denso della fossa tensoriale del timpano, che è attaccato alla coclea in prossimità del RW, aumenterà la resa del raccolto di esemplari, in particolare negli animali più anziani. La rottura dell'osso può verificarsi anche durante la rimozione del contenuto cocleare; È necessario prestare attenzione a rimuovere delicatamente la lamina spirale ossea con una manipolazione minima dell'osso cocleare circostante.
Un dettaglio importante da considerare con questo modello è la vitalità dell'RWM dopo l'espianto. Gruppi precedenti hanno suggerito che l'RWM dei mammiferi rimane vitale per 24-48 ore dopo l'estrazione17. Il presente studio ha rispecchiato questi risultati; studi di trasporto coerenti e analisi istologiche che dimostrano strutture cellulari intatte (Figura 2A) hanno entrambi supportato la vitalità del RWM cavia al momento degli esperimenti. Per mantenere la salute generale del campione estratto, l'RWM viene estratto e incorporato entro 3 ore dall'eutanasia.
Nello studio della farmacocinetica dei farmaci attraverso l'RWM in vivo, rimane una notevole difficoltà tecnica nell'effettuare misurazioni della distribuzione perilinfatica e della concentrazione1. I cambiamenti nei metodi di somministrazione intratimpanica e nella quantità applicata hanno portato a risultati terapeutici diversi. Queste difficoltà sono aggravate dalla complessa fluidodinamica all'interno del labirinto, nonché dall'uscita irregolare del materiale iniettato attraverso la tromba di Eustachio. Il metodo di espianto descritto consente lo studio isolato dell'RWM e dei fattori che influenzano la sua permeabilità come modello ex vivo . Inoltre, l'espianto consente anche l'interrogazione diretta e la visualizzazione di vari metodi attualmente impiegati per aumentare la permeabilità RWM, come le microbolle ad ultrasuoni18 e la modulazione giunzionale indotta chimicamente19. Anche gli studi futuri su specifici meccanismi di endocitosi implicati nella somministrazione di farmaci trarrebbero beneficio da questo modello da banco.
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Disclosures
Gli autori non hanno rivelazioni da fare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIDCD n. 1K08DC020780 e 5T32DC000027-33 e dal Rubenstein Hearing Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
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