Summary
В этом протоколе описывается метод эксплантации мембраны круглого окна из височных костей морских свинок, что является ценным ресурсом для исследований ex vivo .
Abstract
Эффективная и минимально инвазивная доставка лекарств во внутреннее ухо представляет собой серьезную проблему. Мембрана круглого окна (RWM), являющаяся одной из немногих точек входа во внутреннее ухо, стала жизненно важным объектом исследований. Однако из-за сложностей выделения RWM наше понимание его фармакокинетики остается ограниченным. RWM состоит из трех отдельных слоев: наружного эпителия, среднего слоя соединительной ткани и внутреннего эпителиального слоя, каждый из которых потенциально обладает уникальными свойствами доставки.
Современные модели для исследования переноса через RWM используют модели животных in vivo или модели ex vivo RWM, которые полагаются на клеточные культуры или фрагменты мембран. Морские свинки служат валидированной доклинической моделью для исследования фармакокинетики лекарств во внутреннем ухе и являются важной животной моделью для трансляционной разработки средств доставки в улитку. В этом исследовании мы описываем подход к эксплантации RWM морской свинки с окружающей кохлеарной костью для экспериментов по настольной доставке лекарств. Этот метод позволяет сохранить исходную архитектуру RWM и может обеспечить более реалистичное представление транспортных барьеров по сравнению с текущими настольными моделями.
Introduction
Появились новые классы терапевтических средств для лечения нейросенсорной тугоухости. Трансляция этих терапевтических препаратов в клинические популяции ограничена безопасными и эффективными путями транспортировки во внутреннее ухо. Современные методы доставки in vivo в исследованиях на животных основаны либо на фенестрации во внутреннем ухе, либо на диффузии через мембрану круглого окна (RWM), бескостный барьер, который отделяет пространство среднего уха от улитки1.
Хирургическая фенестрация и микроинъекция во внутреннее ухо являются инвазивными и могут представлять опасность для остаточной функции внутреннего уха2. Таким образом, RWM является важным маршрутом для местной доставки лекарств, а морские свинки являются основной доклинической моделью на животных, используемой для изучения фармакокинетики местных лекарств в RWM и во внутреннем ухе для фармацевтических разработок 3,4. Несмотря на то, что морская свинка тоньше RWM, она имеет идентичную трехслойную структуру. Он имеет диаметр около 1 мм, толщину 15-25 мкм и состоит из двух слоев эпителиальных клеток, скрепляющих слой соединительной ткани5. Эпителиальный слой, обращенный к среднему уху, плотно упакован и соединен плотными соединениями, в то время как слой, обращенный к внутреннему уху и scala tympani, имеет более рыхлую архитектуру и не имеет значительных межклеточных спаек.
Современные доклинические исследования, изучающие лекарственную проницаемость RWM морских свинок, основаны на инъекциях в среднее ухо in vivo с последующим забором проб перилимфатической жидкости во внутреннем ухе, что не позволяет провести специфическое исследование транспорта RWM 6,7. Фрагменты эксплантов RWM использовались в доклинических исследованиях, но из-за своей хрупкости и небольшого размера они не подходят для систематических микрофлюидных исследований транспортировки лекарств и транспортных средств, требующих водонепроницаемого уплотнения через RWM2. Другие группы использовали модели in vitro с культивируемыми эпителиальными клетками человека, чтобы приблизиться к RWM 8,9,10. Тем не менее, большинство этих конструкций сосредоточены исключительно на внешнем эпителиальном слое и не отражают сложность архитектуры нативной ткани. Для более детального понимания механизмов транспортировки в RWM необходимы целевые исследования ex vivo.
В данном исследовании мы демонстрируем эксплантацию RWM морской свинки с окружающей костной опорой для сохранения целостности мембраны и иллюстрируем их использование в экспериментальной парадигме, предназначенной для специфического изучения RWM-транспорта транспортных средств доставки лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (GP18M226). В настоящем исследовании использовались морские свинки-альбиносы Хартли (как самцы, так и самки, массой 500-700 г).
1. Настройка и подготовка процедуры
- Перед началом эксперимента простерилизуйте все инструменты окисью этилена.
- Усыпляйте животных в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании для высвобождения 100% углекислого газа (CO2) из коммерческого баллона использовалась камера без предварительного заряда. Для регулирования потока газа использовался встроенный рестриктор, поддерживающий его в диапазоне от 30% до 70% объема камеры в минуту в соответствии с Руководящими принципами AVMA11 2020 года. - Поместите животное в камеру и дозируйте углекислый газ в течение 5 мин. ПотокСО2 поддерживается в течение 1 мин после остановки дыхания.
- Выполните обезглавливание после остановки дыхания, чтобы обеспечить эвтаназию.
2. Хирургический доступ и эксплантация
- Извлеките височную кость из черепа морской свинки обычным способом12. Удалите лишние мягкие ткани с помощью ронжера. Определите наружный слуховой проход, височную буллу и лицевой канал13 (рисунок 1).
- Просверлите вентральные аспекты височной буллы алмазным сверлом диаметром 6 мм (см. таблицу материалов), обнажив пространство среднего уха и наружный слуховой проход по окружности.
- С помощью ронжеров аккуратно удаляют наружный слуховой проход и барабанное кольцо, одновременно разделяя инкудомаллеолярный сустав. Определите наковальню, инкудостапедиальный сустав, улитку, горизонтальный полукружный канал и лицевой канал13 (рисунок 2А).
- Отделите инкудослентидальный сустав и удалите нарез с помощью щипцов. Определите костную нишу круглого окна.
- С помощью алмазной коронки диаметром 6 мм просверлите костную пластинку, соединяющую улитку с медиальной стенкой барабанной полости по направлению к тензорному барабанному каналу. Осторожно декомпрессируйте костный канал тензорной барабанной перепонки и удалите тензорную барабанную мышцу с помощью иглы 28 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медиальная стенка тензорной ямки барабанной перепонки соединяется непосредственно с кохлеарной костью вокруг RWM, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы не вызвать переломов, которые могут распространиться на круглое окно. - Просверлите костную пластинку, соединяющую улитку с нижней стенкой барабанной полости, пока не останется 1 мм костного выступа, примыкающего к улитке (рисунок 2B).
- С помощью алмазной коронки диаметром 2 мм (см. Таблицу материалов) сделайте кохлеостомию на базальном повороте улитки, оставив примерно 2 мм кости до круглого окна. Продолжайте кохлеостомию снизу в плоскости, параллельной круглой оконной мембране, чтобы отделить основание от верхушки улитки.
- Удлинить кохлеостомический разрез через основание черепа, которое намного плотнее, в результате чего получается поперечный срез базального поворота улитки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направление сверла к проходу внутреннего слухового прохода приводит к траектории, которая максимизирует удаление костной ткани, избегая при этом слишком близкого прохождения к круглому окну. - Осмотрите образец со стороны основания черепа и, если это еще не сделано, определите внутренний слуховой проход и просверлите отверстие улитки. Удалите улитковый нерв иглой 28 G.
- Осмотрите образец с внутрикохлеарной стороны. Определите и удалите костную спиральную пластинку в базальном витке и оставшийся модиол щипцами или иглой 28 G.
- Обильно орошают единую полостную полосу преддверия, чтобы удалить мусор. Круглое окно должно быть хорошо видно из места кохэктомии без каких-либо вышележащих обломков (рис. 2C).
- Далее осмотрите образец со стороны среднего уха. Просверлите боковой полукружный канал и лицевой канал до уровня овального окна. Аккуратно удалите стремечко с помощью щипцов, обнажив овальную оконную нишу. Следует отметить, что между корами стремечков есть костяной мостик, известный как crista stapedis.
- С помощью алмазного сверла диаметром 1 мм (см. Таблицу материалов) откройте тамбур дальше, удлинив овальное окно вдоль лицевой стороны круглого окна, стараясь сохранить 1-2 мм кохлеарной кости, примыкающей к круглой оконной нише (рис. 2D).
- Завершите разрезы височной кости, соединив овальные разрезы окна с разрезами кохлектомии по обе стороны круглого окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за хрупкости кохлеарной кости сохранение тензорной ямки барабанной перепонки в образце и избегание разрезов через нее поможет предотвратить переломы кохлеарной кости, которые распространяются на RWM и нарушают ее целостность. - Сделайте последние прикрепления к плотной кости основания черепа, прилегающей к внутреннему слуховому проходу, и аккуратно сбрите, чтобы получить иссеченный образец RWM (Рисунок 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 3А, этот метод позволяет эксплантировать неповрежденную круглую оконную мембрану морской свинки с окружающим кольцом из жесткой кости. RWM должен быть полностью соединен с костным кольцом по окружности. Переломы кохлеарной кости не должны быть оценены по достоинству. По сравнению с человеческими экземплярами с круглым окном, морская свинка RWM не имеет вышележащей псевдомембраны. Кроме того, в отличие от людей, между корой стремени морской свинки есть костный мостик, который требует разрушения и удаления перед извлечением надстройки стремечка. Гистологический анализ (рис. 3В) репрезентативного RWM показывает четкую трехслойную структуру эпителия с прилегающей, неповрежденной круглой оконной нишей.
С точки зрения техники, есть два важных этапа. Во-первых, при выполнении кохэктомии на шаге 2.7 важно использовать экватор сверла, а не наконечник, чтобы сделать надрез, так как дрожание на кончике заусенца может привести к травматическим переломам в кохлеарной кости, которые могут распространиться на круглую оконную мембрану. Во-вторых, важно полностью высверлить внутренний слуховой проход, так как это позволяет полностью удалить улитковый нерв и облегчить рассечение костной спиральной пластинки, в результате чего на внутрикохлеарной стороне образуется единая полость для экспериментального отбора проб (рис. 2В).
После того, как RWM был успешно извлечен, наша группа использовала модифицированную камеру Юссинга для оценки фармакокинетических свойств мембраны. Модифицированная камера Уссинга была валидирована другими группами в барабанной перепонке и мембране круглого окна, а также в ткани сетчатки для оценки транспортных свойств эпителиальных мембран 14,15. Это устройство, напечатанное на 3D-принтере, было сконструировано с использованием Poly-Jet Vero и состоит из двух треугольных базовых частей, каждая из которых имеет жидкостную камеру объемом 400 мкл (рис. 3). Костный ободок RWM крепится к основанию с помощью 2-компонентной эпоксидной смолы (Gorilla, см. Таблицу материалов), а затем силиконового герметика (см. Таблицу материалов) для обеспечения водонепроницаемости (Рисунок 4). Тщательно следят за тем, чтобы эпоксидная смола или герметик не попадали на мембрану. После того, как RWM зажат на месте, две основы склеиваются между собой эпоксидной смолой. Во время экспериментов по транспортировке загрузка (обращенная к среднему уху) заполняется фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим средство доставки (или любую интересующую молекулу), а пробоотборная камера (scala tympani) заполняется только PBS. Через равные промежутки времени жидкость из пробоотборной камеры полностью отсасывается и заменяется свежим PBS.
Во время каждого эксперимента принимаются меры контроля качества, чтобы гарантировать, что внутри прибора есть как водонепроницаемое уплотнение вокруг образца, так и полностью неповрежденная мембрана без микроперфорации. Репрезентативные результаты с коричневым раствором наночастиц с железным сердечником показаны ниже. Количественная проверка водонепроницаемости уплотнения осуществляется путем аспирации полного объема пробоотборной камеры в течение каждого интервала отбора проб; Утечка жидкости из пробоотборной камеры приведет к уменьшению объема аспирации. По завершении каждого эксперимента объем жидкости в загрузочной камере также должен оставаться неизменным. Кроме того, поскольку наша целевая жидкость имеет коричневый цвет, она также хорошо видна в случае утечки.
Чтобы гарантировать отсутствие утечек внутри мембраны, было использовано несколько подходов. Во-первых, все образцы RWM, использованные в этом исследовании, немедленно извлекаются, а изображения световой, конфокальной и электронной микроскопии подтверждают неповрежденные клеточные и мембранные структуры без микроперфорации (рис. 3A, B). Во-вторых, микроперфорация была намеренно создана в подмножестве образцов RWM, чтобы сравнить влияние на доставку наночастиц. Визуальный осмотр аспирата пробоотборной и загрузочной камеры служит дополнительным подтверждением целостности образца и водонепроницаемости его крепления. В RWM с перфорацией происходит быстрое уравновешивание камеры загрузки и отбора проб, что можно наблюдать по отчетливому изменению цвета (дополнительный рисунок 1). Кроме того, было обнаружено, что транспорт в микроперфорированных RWM был выше, чем максимальная дисперсия, наблюдаемая в интактных мембранах (дополнительный рисунок 2). Вместе они служат механизмами контроля качества для обеспечения целостности водонепроницаемого уплотнения, окружающего образец, а также RWM.
Рисунок 1: Предоперационное изображение височной кости морской свинки. Барабанная булла, наружный слуховой проход и лицевой канал (*) показаны на этом предоперационном изображении височной кости морской свинки. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интраоперационные изображения. Интраоперационные изображения, демонстрирующие взаимосвязь между мембраной круглого окна и наростником (*), улиткой (**), стремечком (†) и декомпрессией внутреннего слухового прохода (‡). Затененными областями обозначены части образца, которые будут удалены. (А) Полость среднего уха морской свинки после удаления барабанной перепонки и лицевого нерва (шаг 2.3). (Б) Полость среднего уха после декомпрессии тензорного барабанного прохода (этап 2.6). (C) Базальная проекция RWM после кохлеостомии и удаления содержимого внутреннего уха (шаг 2.11). (D) Вид RWM после удаления стремени и идентификации преддверия (шаг 2.13). Масштабная линейка = A,B (1 см); C,D (5 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Окончательный образец RWM и гистология. (A) Грубый образец RWM морской свинки с костным кольцом. Масштабная линейка = 1 см. (B) Гистология эксплантированной круглой оконной мембраны морской свинки демонстрирует неповрежденную трехслойную структуру. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Микрофлюидное устройство для экспериментов по трансмембранному переносу. (A) Схема микрофлюидного устройства, используемого для экспериментов по трансмембранному переносу. (В,В) Напечатанное микрофлюидное устройство для экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Загрузка и отбор проб содержимого камеры в течение 5-часового эксперимента по доставке наночастиц с железным сердечником. (А) В загрузочной камере неповрежденного RWM наблюдается постепенное снижение интенсивности цвета по мере уменьшения концентрации наночастиц. (B) Камера отбора проб неповрежденного RWM демонстрирует стабильную окраску с течением времени, что согласуется с низким уровнем доставки наночастиц. (C) Загрузочная камера перфорированного RWM демонстрирует быстрое снижение интенсивности цвета по мере того, как содержимое уравновешивается с камерой отбора проб. (D) Камера отбора проб перфорированного RWM демонстрирует постепенное увеличение цвета с течением времени, что согласуется с высокими уровнями доставки наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Репрезентативные результаты переноса для доставки наночастиц. Репрезентативные результаты транспортировки наночастиц (сердечник Fe3O4 с полиэтиленгликолевым покрытием, средний радиус 77 нм) через RWM морской свинки, как неповрежденные, так и с перфорацией (среднее ± SD, n ≥ 3 экспериментов RWM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При локальной доставке лекарств в ухо RWM является основным путем прохождения терапевтических препаратов во внутреннее ухо. Для лучшего понимания механизмов транспортировки и проницаемости новых средств доставки и разработки лекарств необходима точная и надежная настольная модель. В этом исследовании мы демонстрируем, что эксплантация RWM морской свинки является осуществимой и надежной процедурой, позволяющей проводить систематические исследования лекарственных и мембранных взаимодействий. Lundman et al. и Kelso et al., ранее описанные с использованием аналогичной модели проницаемости RWM 2,16; однако конкретные этапы хирургического извлечения до сих пор не были подробно описаны, а хрупкость кохлеарной кости и сложная анатомия создали проблему для последовательного сбора неповрежденных RWM.
Морская свинка RWM расположена на конце scala tympani улитки и окружена тонким слоем улитковой кости. Разрушение этой костной структуры в процессе эксплантации может привести к тому, что образец станет непригодным для использования, так как RWM имеет тенденцию отрываться, если окружающая кохлеарная кость не остается неповрежденной. Наша группа отметила, что переломы чаще всего происходили при сверлении вблизи соединения между высокоплотной костью основания черепа и хрупкой улиткой, так как переход плотности кости увеличивал вероятность распространения перелома через круглое окно. По этой причине предполагается, что сохранение более плотной кости тензорной ямпа барабанной перепонки, которая прикреплена к улитке в непосредственной близости от RW, увеличит урожайность образцов, особенно у пожилых животных. Нарушение работы кости также может произойти во время удаления кохлеарного содержимого; Необходимо осторожно удалить костную спиральную пластинку с минимальными манипуляциями с окружающей кохлеарной кохлеарной костью.
Важной деталью, которую следует учитывать при работе с этой моделью, является жизнеспособность RWM после эксплантации. Предыдущие группы предположили, что RWM млекопитающих остается жизнеспособным в течение 24-48 ч после экстракции17. Эти выводы отражены в настоящем исследовании; Последовательные исследования транспорта и гистологические анализы, демонстрирующие интактные клеточные структуры (рис. 2А), подтвердили жизнеспособность RWM морской свинки на момент экспериментов. Для поддержания общего здоровья извлеченного образца RWM извлекают и внедряют в течение 3 часов после эвтаназии.
При изучении фармакокинетики лекарственных средств в RWM in vivo сохраняются значительные технические трудности при измерении перилимфатического распределения и концентрации1. Изменения в методах внутритимпанической доставки и количестве вводимой жидкости привели к различным терапевтическим результатам. Эти трудности усугубляются сложной гидродинамикой внутри лабиринта, а также нерегулярным выходом закачиваемого материала через евстахиеву трубу. Описанный способ эксплантации позволяет провести изолированное исследование RWM и факторов, влияющих на его проницаемость, в качестве модели ex vivo . Кроме того, эксплантат также позволяет проводить прямой опрос и визуализацию различных методов, используемых в настоящее время для повышения проницаемости RWM, таких как ультразвуковые микропузырьки18 и химически индуцированная модуляция19. Будущие исследования специфических механизмов эндоцитоза, участвующих в доставке лекарств, также выиграют от этой лабораторной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет никаких разглашений.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами NIDCD No 1K08DC020780 и 5T32DC000027-33, а также Фондом исследований слуха им. Рубинштейна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
