Summary
Dit manuscript schetst een gedetailleerd videoprotocol voor het kweken van primaire lensepitheelcellen (LEC's), met als doel de reproduceerbaarheid te verbeteren en onderzoek naar cataract en posterieure capsule-opacificatie (PCO) te ondersteunen. Het biedt stapsgewijze instructies over lensdissectie, LEC-isolatie en validatie en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het veld.
Abstract
Lensepitheelcellen (LEC's) spelen meerdere belangrijke rollen bij het handhaven van de homeostase en de normale functie van de lens. LEC's bepalen de groei, ontwikkeling, grootte en transparantie van lenzen. Omgekeerd kunnen disfunctionele LEC's leiden tot cataractvorming en opacificatie van het achterste kapsel (PCO). Daarom is het opzetten van een robuust primair LEC-kweeksysteem belangrijk voor onderzoekers die zich bezighouden met lensontwikkeling, biochemie, cataracttherapieën en PCO-preventie. Het cultiveren van primaire LEC's heeft echter lange tijd uitdagingen opgeleverd vanwege hun beperkte beschikbaarheid, trage proliferatiesnelheid en delicate aard.
Deze studie pakt deze hindernissen aan door een uitgebreid protocol voor de primaire LEC-cultuur te presenteren. Het protocol omvat essentiële stappen zoals de formulering van een geoptimaliseerd kweekmedium, nauwkeurige isolatie van lenscapsules, trypsinisatietechnieken, subcultuurprocedures, oogstprotocollen en richtlijnen voor opslag en verzending. Gedurende het hele kweekproces werd de celmorfologie gecontroleerd met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Om de authenticiteit van de gekweekte LEC's te bevestigen, werden immunofluorescentietests uitgevoerd om de aanwezigheid en subcellulaire distributie van kritische lenseiwitten, namelijk αA- en γ-kristallijnen, te detecteren. Dit gedetailleerde protocol voorziet onderzoekers van een waardevolle bron voor het cultiveren en karakteriseren van primaire LEC's, waardoor vooruitgang wordt geboekt in ons begrip van lensbiologie en de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor lensgerelateerde aandoeningen.
Introduction
De lens van het oog speelt een cruciale rol bij het gezichtsvermogen door invallend licht op het netvlies te focussen. Het bestaat uit een transparante, avasculaire structuur die bestaat uit gespecialiseerde cellen, waaronder lensepitheelcellen (LEC's) belangrijke spelers zijn. LEC's bevinden zich aan de voorkant van de lens en zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de transparantie, het reguleren van de waterbalans en het deelnemen aan de groei en ontwikkeling van de lens 1,2. LEC's zijn een uniek type cellen dat zich aan de voorkant van de lens bevindt en een cruciale rol speelt bij het behouden van de helderheid en functie van de lens door gedurende het hele leven continu lensvezels te produceren.
Staar wordt gekenmerkt door de progressieve vertroebeling van de lens, wat resulteert in vervorming en verstrooiing van licht, wat leidt tot een verminderd gezichtsvermogen 3,4. De precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van cataract zijn complex en multifactorieel, waarbij verschillende cellulaire en moleculaire processen betrokken zijn, zoals UV-straling, oxidatieve schade en glycatie5,6. LEC's blijken aanzienlijk bij te dragen aan de ontwikkeling van staar, waardoor ze een essentieel aandachtspuntvan onderzoek zijn 1,2,7,8,9.
Bovendien is een van de meest urgente problemen in de oogheelkunde tegenwoordig de relatief hoge incidentie van opacificatie van het achterste kapsel (PCO), ook bekend als secundair cataract. PCO blijft de meest voorkomende complicatie na een staaroperatie en treft tot 20-40% van de volwassen patiënten en 100% van de kinderen binnen 5 jaarna de operatie. PCO wordt voornamelijk veroorzaakt door de resterende LEC's die in de capsulaire zak achterblijven na cataractextractie. Deze cellen ondergaan een veelzijdige pathofysiologische transformatie waarbij niet alleen de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) betrokken is, maar ook de differentiatie van LEC's naar lensvezels, wat resulteert in een celpopulatie die een mengsel is van LEC's, vezels en myofibroblasten 11,12,13. De getransformeerde cellen vermenigvuldigen zich en migreren over het achterste lenskapsel, wat leidt tot slechtziendheid. Inzicht in het gedrag en de controlemechanismen van LEC's in kweekmodellen kan waardevolle inzichten opleveren in de preventie en het beheer van PCO. Daarom is dit protocol voor het kweken van LEC's een essentieel hulpmiddel voor oogheelkundige onderzoekers die deze veel voorkomende postoperatieve complicatie willen bestuderen, begrijpen en uiteindelijk bestrijden.
Om de fijne kneepjes van LEC-biologie en haar rol in cataractvorming en PCO te ontrafelen, is het essentieel om robuuste en reproduceerbare in vitro primaire celkweeksystemen op te zetten. Primaire LEC-cultuur biedt onderzoekers een gecontroleerde omgeving om de functies, signalering en moleculaire kenmerken van LEC's te bestuderen. Bovendien maakt het het mogelijk om cellulaire processen en de effecten van verschillende experimentele omstandigheden te onderzoeken, wat waardevolle inzichten oplevert in de fysiologie en pathologie van lenzen.
Eerder onderzoek heeft ons begrip van LEC-kweektechnieken verrijkt: 14,15,16,17,18,19,20. Hoewel deze studies verschillende methodologieën hebben gebruikt en significante bevindingen hebben opgeleverd over LEC-gedrag en -kenmerken, ontbreekt een uitgebreid en toegankelijk video-opnameprotocol voor het kweken van LEC's in de huidige literatuur. Deze beperking kan het vermogen van beginnende onderzoekers om de technieken nauwkeurig te reproduceren belemmeren en kan leiden tot inconsistenties en variaties in experimentele resultaten. Door een video-opnameprotocol te bieden, wil dit onderzoeksartikel deze kloof overbruggen en een gestandaardiseerde bron bieden die de reproduceerbaarheid kan verbeteren en kennisoverdracht op het gebied van LEC-cultuur kan vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Procedurele goedkeuring werd verleend door de Animal Care and Use Committee van het Health Science Center van de University of North Texas (protocolnummer: IACUC-2022-0008). In deze onderzoeken werden jonge C57BL/6J-muizen gebruikt, meestal jonger dan 2 weken.
1. Voorbereiding van het kweekmedium en lensdissectie
- Bereid kweekmedium voor door 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 0,1 ml 50 mg/ml gentamicine toe te voegen aan 450 ml DMEM.
- C57BL/6J muizen jonger dan 2 weken op humane wijze euthanaseren.
OPMERKING: We hebben geëuthanaseerd met behulp van de CO2 -inhalatiemethode. Een optimaal debiet voor CO2 -euthanasiesystemen moet 30% tot 70% van het kamer- of kooivolume per minuut verplaatsen. - Verwijder de oogleden voorzichtig met een chirurgische schaar en oefen delicate druk uit met een gebogen pincet aan weerszijden van de oogkas, waardoor het oog naar buiten uitsteekt. Maak een zorgvuldige incisie in het hoornvlies met behulp van het staarmes en verwijder de lens voorzichtig met een gebogen pincet, zodat de lens of het kapsel niet beschadigd raakt.
NOTITIE: Wees voorzichtig bij het uitvoeren van deze stappen om de integriteit van het lenskapsel te behouden. Vanwege de delicate aard van de lens is het belangrijk om ontleedgereedschap met gebogen en stompe punten te gebruiken om het risico op lensbeschadiging te minimaliseren. - Gebruik een gebogen pincet met stompe punten om de lenzen over te brengen in een plastic weefselkweekschaal van 60 mm gevuld met 5 ml voorverwarmde en steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 10 μg/ml gentamicine.
- Spoel de lenzen voorzichtig af met DPBS-oplossing die 10 μg/ml gentamicine bevat om mogelijk vuil of verontreinigingen te verwijderen, de lenzen voor te bereiden op verdere verwerking en een steriele kweekomgeving te behouden.
- Om een voldoende aantal LEC's te verkrijgen, combineert u vier lenzen voor een kweekplaat met 24 putjes en zes lenzen voor een kweekplaat met 6 putjes.
2. Isolatie van LEC's
- Plaats de lens na het spoelen op een stuk filtreerpapier en laat deze drogen.
- Zodra de lens voldoende droog is, brengt u deze voorzichtig over op het deksel van een petrischaal ter voorbereiding op het verwijderen van het lenskapsel.
- Draai de lens naar boven en zorg ervoor dat het voorste segment naar boven wijst. Terwijl u het pincet gebruikt om het voorste kapsel vast te houden, gebruikt u de capsulorhexis-pincet in de dominante hand om een klein scheurtje in het kapsel te maken. Trek de twee gereedschappen voorzichtig in tegengestelde richtingen om de capsule te verwijderen en plaats deze in DPBS totdat alle lensdissecties zijn voltooid.
OPMERKING: Om discrepanties te voorkomen, moeten onderzoekers elk lensepitheelkapsel onmiddellijk ontleden en tijdelijk opslaan in DPBS. Pas na voltooiing van alle dissecties worden de capsules collectief overgebracht naar trypsine dat op 37 °C wordt gehouden, waardoor een gesynchroniseerde en uniforme blootstelling wordt gegarandeerd. - Breng het lenskapsel voorzichtig over op een plaat met 6 putjes. Voeg 1 ml 0,05% trypsine-oplossing toe aan elk putje om het enzymatische verteringsproces op gang te brengen.
- Roer de trypsine-oplossing voorzichtig om een gelijkmatige permeatie te garanderen. Plaats de plaat in een celkweekincubator en laat de capsule 8-10 minuten verteren bij 37 °C.
OPMERKING: Deze stap vergemakkelijkt de afbraak van het weefsel van het lenskapsel en de daaropvolgende afgifte van individuele epitheelcellen. - Hak na de incubatie het verteerde lenskapsel voorzichtig fijn met een ontleedschaar om eventuele resterende weefselklonten af te breken en de celscheiding te bevorderen.
OPMERKING: Grondigheid bij het verminken van weefsel wordt benadrukt om een efficiënte celafgifte uit de verteerde lenscapsules te garanderen. - Voeg 0,5 ml van het kweekmedium met 10% FBS toe om de trypsine te blussen. Breng de weefselmonsters over in een centrifugatiebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g .
- Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de celkorrel te verstoren. Gebruik 1 ml kweekmedium om de cellen te resuspenderen en de cellen te zaaien in een plaat met 24 putjes.
- Verander het kweekmedium elke 2-3 dagen.
3. LEC's subcultuur
- Zodra de cellen samenvloeiing hebben bereikt, verwijdert u het medium uit de kweekschaal. Ga verder met het wassen van de cellen 2x met 1 ml DPBS.
- Voeg 200 μL trypsine-EDTA-oplossing toe en plaats de cellen gedurende 5 minuten in de incubator.
- Haal na incubatie de cellen uit de incubator en inspecteer ze onder een microscoop om te bevestigen dat ze zijn losgekomen van de kweekschaal en zijn gaan drijven.
- Voeg 1 ml kweekmedium toe en pipetteer de cellen voorzichtig 3-5x om alle cellen los te maken.
- Breng de cellen over in centrifugebuisjes en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g .
- Verwijder voorzichtig het supernatans en suspendeer de cellen in het volledige groeimedium.
- Tel indien nodig het celaantal met behulp van een hemocytometer.
- Verdeel de celsuspensie in een verhouding van 1:2 of 1:3 voor subcultivatiedoeleinden.
- Wanneer de cultuur weer samenvloeit, herhaalt u de bovengenoemde procedures.
OPMERKING: LEC's gedijen goed in kweekomstandigheden met een hoge dichtheid. Vermijd overmatig verdunnen van de cellen, omdat dit hun groei kan belemmeren.
4. Opslag en verzending
OPMERKING: Het ideale mobiele nummer voor opslag is ~1 × 106.
- Was de cellen 3x grondig met 1 ml DPBS. Voeg na het wassen 1 ml trypsine-EDTA-oplossing toe en plaats de cellen gedurende 5 minuten in de couveuse.
- Voeg 2 ml compleet kweekmedium toe en breng de celsuspensie over in de centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g .
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in een vriesmedium bestaande uit 90% FBS en 10% DMSO, waarbij wordt gestreefd naar een celdichtheid van 1 × 106 cellen/ml. Breng de celsuspensie over naar de cryovial.
- Verplaats de cellen onmiddellijk gedurende 1 uur naar een omgeving van -20 °C, gevolgd door -80 °C gedurende een nacht, voordat ze permanent in vloeibare stikstof worden opgeslagen.
OPMERKING: Als er geen vloeibare stikstof beschikbaar is, kunnen de cellen na een eerste uur bij -20 °C bij -80 °C worden bewaard. - Als er een zending nodig is, verzend dan de cellen in de cryovial in een pakket met droogijs voor levering 's nachts.
- Zorg na ontvangst van de cellen voor een snel herstel en plaats de cellen in de subcultuur. Als onmiddellijke kweek niet haalbaar is, breng de cellen dan over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
NOTITIE: Als de cellen moeten worden verzonden, zorg er dan voor dat de monsters diep in het droogijs worden begraven om mogelijke schade door temperatuurschommelingen te voorkomen.
5. Validatie van LEC's
- Plaat LEC's in kweekschalen van 35 mm met afdekglaasjes en kweek ze ongeveer 48 uur.
- Was de cellen 2x met PBS en fixeer de cellen met koude methanol gedurende 10 min bij -20 °C.
- Was de vaste cellen gedurende 3 x 5 min met PBS en incubeer de vaste cellen met blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.
- Na blokkering de cellen een nacht bij 4 °C incuberen, waarbij de primaire antilichamen (αA-kristallijn, γ-kristallijn en PROX1-antilichamen) afzonderlijk worden verdund in een verhouding van 1:50 in de verdunningsbuffer.
- Was de cellen gedurende 3 x 5 minuten met PBS en incubeer de cellen met het secundaire antilichaam verdund 1:100 in verdunningsbuffer gedurende 1 uur.
- Was de cellen gedurende 3 x 5 minuten met PBS en kleur de cellen met 5 μg/ml Hoechst 33342 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de kernen te visualiseren.
- Was de cellen gedurende 2 x 5 minuten met PBS om overtollige kleuringsoplossing te verwijderen en maak fluorescerende beelden van de cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met behulp van het DAPI-kanaal voor kernen en het FITC-kanaal voor αA-, γ-kristallijnen en PROX1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals te zien is in figuur 2, hechtten primaire LEC's van C57BL/6J-muizen zich door het volgen van dit protocol binnen een periode van 4 uur aan de schaal. Er waren met name zichtbare overblijfselen van andere weefsels, zoals delen van het achterste kapsel en lensvezelcellen. Deze onbedoelde elementen hechtten zich echter niet aan de schaal en konden daarom worden verwijderd door het kweekmedium te veranderen. Vervolgens begonnen de LEC's tussen de derde en vijfde dag met hun proliferatiefase. Snelle groei, kenmerkend voor de logaritmische proliferatiefase, kon dan worden waargenomen tussen de zevende en tiende dag. In gevallen waarin de cellen niet overgaan tot de snelle groeifase, kan het raadzaam zijn om groeisupplementen, zoals EpiCGS-a, in het kweekmedium op te nemen. Verder zagen we dat cellen een snellere groeisnelheid vertonen in het medium dat 20% FBS bevat in vergelijking met 10% FBS. Een lagere FBS-concentratie bevordert doorgaans een langzamere groei, die de eigenschappen van het centrale epitheel van de lens weerspiegelt, terwijl een FBS-concentratie van 20% de kenmerken van de proliferatieve zone van de lens repliceert.
Volgens Reddy et al. en Andley et al., die de onsterfelijke menselijke lensepitheelcellijn B3 ontwikkelden, wordt verwacht dat LEC's verschillende lensspecifieke eiwitten tot expressie brengen, zoals αA- en γ-kristallijnen 2,21. Daarom hebben we in deze studie αA- en γ-kristallijnen gebruikt als cellulaire markers om de identiteit van de cellen als LEC's te valideren. LEC's binnen de eerste drie passages werden gekweekt op glazen dekglaasjes. De primaire antilichamen die specifiek zijn voor αA- en γ-kristallijnen werden gebruikt om de cellen 's nachts te incuberen. Zoals te zien is in figuur 3, vertoonden deze cellen een robuuste expressie van zowel αA- als γ-kristallijnen, wat definitief bewijs levert dat het van lenzen afgeleide epitheelcellen zijn. Bovendien gebruikten we PROX1 als een gevestigde marker voor vezelcellen om de primaire LEC's te labelen. De gegevens gaven aan dat deze LEC's een negatieve kleuring vertoonden voor PROX1, wat bevestigt dat deze cellen epitheelcellen zijn en nog geen differentiatie in vezelcellen hadden ondergaan.
Figuur 1: Stap-voor-stap workflow voor LEC-cultuur. De figuur toont de opeenvolgende stappen die betrokken zijn bij de kweek van primaire lensepitheelcellen. Stap 1 omvat het maken van een klein scheurtje in het voorste kapsel. Stap 2 omvat het voorzichtig verwijderen van het lenskapsel. In stap 3 wordt het lenskapsel voorzichtig overgebracht naar een plaat met 24 putjes en gedurende 10 minuten geïncubeerd met 0,05% trypsine-oplossing bij 37 °C. Na incubatie wordt het verteerde lenskapsel fijngehakt met behulp van een ontleedschaar om de celscheiding te bevorderen. Stap 4 omvat het blussen van de trypsine door 0,5 ml kweekmedium met 20% FBS toe te voegen aan de centrifugatiebuis en de weefselmonsters gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 1.000 × g . Stap 5 vereist het resuspenderen van de cellen in 1 ml kweekmedium en het zaaien ervan in een plaat met 24 putjes. Ten slotte omvat stap 6 het vervangen van de kweekmedia om de 2-3 dagen om de celgroei en het onderhoud tijdens het experiment te ondersteunen. Afkortingen: LEC's = lensepitheelcellen; FBS = foetaal runderserum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Groeipatroon van LEC's in de loop van de tijd. De morfologische veranderingen van primaire lensepitheelcellen op verschillende tijdstippen tijdens hun groei werden geregistreerd onder een fasecontrastmicroscoop. De beelden die op dag 1, 2, 3, 5, 7 en 10 zijn gemaakt, tonen de evoluerende celmorfologie en geven inzicht in de ontwikkeling en het gedrag van lensepitheelcellen in de loop van de tijd. Rode pijl die de locatie van actief prolifererende lensepitheelcellen aangeeft. Schaalbalken = 100 μm. Afkorting: LEC's = lensepitheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van LEC's. (A) Immunokleuring van αA-kristalline in LEC's van muizen. Primaire mLEC's werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en αA-kristalline-antilichaam (groen). (B) Immunokleuring van γ-kristallijn in LEC's van muizen. (C) Immunokleuring van PROX1 in LEC's van muizen. Primaire mLEC's werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en PROX1 antilichaam (groen). Schaalbalken = 50 μm. Afkorting: LEC's = lensepitheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, biedt een uitgebreide, stapsgewijze handleiding voor de succesvolle isolatie, cultuur en subcultuur van primaire LEC's, compleet met bijbehorende videodocumentatie. De gedetailleerde visuele gids naast de schriftelijke instructies verbetert de duidelijkheid en toegankelijkheid van het protocol en bevordert het gebruik en de reproduceerbaarheid ervan onder onderzoekers in het veld. Het uiteindelijke doel is om bij te dragen aan de groeiende hoeveelheid kennis over de rol van LEC's bij cataractvorming en PCO, een veel voorkomende complicatie na staaroperaties.
Bij het vergelijken van primaire LEC's met lensepitheelcellijnen, zoals HLE-B3 en SRA01/04, bieden ze elk unieke voordelen en uitdagingen in een onderzoekscontext. De HLE-B3-cellijn vertegenwoordigt, samen met de SRA01/04, een categorie cellijnen die, hoewel ze gemakkelijk te hanteren en duurzaam zijn, vaak genetische en fenotypische veranderingen vertonen als gevolg van hun continue replicatie en langdurige kweekomstandigheden. Dit kan leiden tot aanzienlijke verschillen met de functie van de oorspronkelijke LEC's, waardoor de authenticiteit van hun antwoorden afneemt. Omgekeerd weerspiegelen primaire LEC's, rechtstreeks geïsoleerd uit levend weefsel van patiënten of proefdieren, nauwkeuriger de natuurlijke cellulaire omgeving en inherente reacties van de lens in vivo. Ondanks de extra complexiteit van hun extractie en kweek, hebben ze vaak de voorkeur in onderzoeken die een hoge fysiologische relevantie vereisen, omdat ze nauwkeurigere en betrouwbaardere resultaten opleveren.
Bij het volgen van dit protocol moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke punten. In deze onderzoeken werden jonge C57BL/6J-muizen gebruikt, meestal jonger dan 2 weken. We zagen dat LEC's geoogst van deze jonge muizen een krachtigere groei vertoonden in vergelijking met LEC's van muizen van 2 maanden of ouder. Dit wijst op een negatieve correlatie tussen de leeftijd van de muizen en de celgroei.
Het ontleden van de lens van een muizenoog is een delicate taak, waarbij zorgvuldig gebruik van ontleedgereedschap nodig is om de integriteit van de lens en zijn capsule te behouden. De procedure beschreven in protocolsectie 1 zorgt ervoor dat de lens met succes wordt verwijderd met minimale schade. Hoewel het een uitdaging is om de gezondheid en integriteit van het lenskapsel te behouden, kan het belang ervan niet worden onderschat, aangezien eventuele schade mogelijk van invloed kan zijn op de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde LEC's. Het is opmerkelijk dat de meeste celdelingen meestal plaatsvinden in de kiemzone nabij het equatoriale gebied in de lens, een gebied dat niet gemakkelijk toegankelijk is voor kweek. Volgens Zetterberg et al., hoewel het centrale deel van het lensepitheel onder normale omstandigheden minimale mitotische activiteit vertoont, hebben experimenten met getritieerde thymidine (3H-Tdr) -etikettering deze centraal gepositioneerde lensepitheelcellen gemarkeerd als potentiële stamcellen17,22. Stamcellen vertonen verschillende kenmerken, zoals een onbeperkte proliferatiecapaciteit, ondanks een lage proliferatiesnelheid onder standaardomstandigheden. Als zodanig kan het centrale deel van het lensepitheel een betere weergave geven van de proliferatieve capaciteit van de LEC's dan de kiemzone.
De isolatie van LEC's, zoals beschreven in hoofdstuk 2 van het protocol, vormt een cruciale stap in deze experimentele procedure. Integrale acties, waaronder het verwijderen van het lenskapsel, enzymatische vertering en weefselfragmentatie, worden zorgvuldig uitgevoerd om individuele epitheelcellen van het kapsel te scheiden. Een van de kritische elementen binnen dit proces is de duur van de trypsinevertering. Het wordt aanbevolen om de verteringsperiode in te stellen tussen 8 en 10 minuten. Als deze periode wordt verkort tot minder dan 5 minuten, kan dit leiden tot onvolledige celscheiding. Omgekeerd kan oververlenging van dit tijdsbestek de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk in gevaar brengen. De strategische keuze om trypsine-EDTA te gebruiken als celdissociatiereagens, in combinatie met een DMEM-kweekmedium aangevuld met 20% FBS en 10 μg/ml gentamicine, optimaliseert de celafgifte en daaropvolgende proliferatie en beperkt tegelijkertijd potentiële besmettingsrisico's.
Antibiotica worden vaak gebruikt om bacteriële besmetting tijdens primaire LEC-culturen te voorkomen. De keuze van antibiotica moet echter zorgvuldig worden gemaakt. Vaak gebruikte antibiotica zoals penicilline en streptomycine, evenals antischimmelmiddelen, kunnen de levensvatbaarheid van LEC's beïnvloeden. Als alternatief wordt aanbevolen om een gentamicine-oplossing in een concentratie van 10 μg/ml te gebruiken voor een optimale LEC-groei.
Bovendien is het handhaven van een hoge celdichtheid een andere cruciale factor voor een succesvolle primaire LEC-kweek. In tegenstelling tot gevestigde cellijnen hebben primaire LEC's een hogere celdichtheid nodig voor een optimale groei. Dit is voornamelijk te wijten aan hun afhankelijkheid van effectieve intercellulaire communicatie, gefaciliteerd door direct contact of paracriene signalering, wat helpt hun differentiatiestatus en functie te behouden. Een hoge celdichtheid vermindert ook de nadelige effecten van "kweekschok", een aandoening die primaire cellen ervaren wanneer ze worden geïsoleerd en in een in vitro omgeving worden geplaatst die aanzienlijk verschilt van hun in vivo oorsprong. Door een meer in vivo-achtige omgeving na te bootsen, verhoogt een hoge celdichtheid de overlevingskansen. Bovendien helpt deze dichtheid bij het tot stand brengen van een concentratiegradiënt van groeifactoren en cytokines die de celgroei en -functie ondersteunt. Gezien het feit dat veel primaire cellen afhankelijk zijn van verankering en oppervlaktehechting nodig hebben voor proliferatie, biedt een hoge celdichtheid een voldoende aantal naburige cellen voor adhesie, waardoor een gezonde groei wordt bevorderd. Bijgevolg is de regulering van de celdichtheid een cruciale overweging bij het kweken van primaire cellen vanwege de aanzienlijke impact ervan op de communicatie, overleving en proliferatie van cellen. Kiezen voor kleinere kweekgerechten, zoals borden met 24 of 6 putjes, wordt aanbevolen om een ideale omgeving voor LEC's te creëren. Het volgen van dit protocol resulteert er doorgaans in dat LEC's ~10-14 dagen na de teelt een confluente toestand bereiken. We raden aan om LEC's te gebruiken bij een laag aantal passages, idealiter tussen P0 en P6, om het meest natuurlijke gedrag in experimenten te garanderen. Na 7-10 passages kunnen LEC's verminderde groei vertonen en reageren ze mogelijk niet op dezelfde manier op experimentele omstandigheden als cellen in lagere passages.
De serumconcentratie is direct gerelateerd aan de snelheid van celgroei. Lagere niveaus van FBS hebben meer kans om een langzamere groei te induceren, vergelijkbaar met de kenmerken van het centrale epitheel. Hogere FBS-niveaus bootsen daarentegen de omstandigheden van de proliferatieve zone na. Als de celgroei traag is, zoals kan gebeuren wanneer LEC's moeten worden geïsoleerd uit oudere of genetisch gemodificeerde dieren, kan het nuttig zijn om FBS te verhogen tot 20% of een groeisupplement zoals EpiCGS-a (5 ml, zie materiaaltabel) aan het kweekmedium toe te voegen. Deze serum- en supplementverrijking kan de celproliferatie bevorderen en de optimale groei van epitheelcellen bevorderen.
In het protocol voor opslag en verzending (protocolsectie 5) wordt ingegaan op de uitdagingen die gepaard gaan met de bewaring en het transport van levende cellen. De keuze van het vriesmedium is van cruciaal belang voor het overleven van LEC's tijdens opslag en transport. We hebben geëxperimenteerd met verschillende vriesmediums, waaronder 70% compleet kweekmedium + 20% FBS + 10% DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; en DMSO- en serumvrij vriesmedium. Bewijs uit onze experimenten suggereert dat een oplossing die bestaat uit 10% DMSO en 90% FBS superieure prestaties vertoont bij het behouden van de levensvatbaarheid van cellen. Door gebruik te maken van deze specifieke formulering hebben we met succes primaire LEC's in opslag gehouden bij -80 °C voor een duur van meer dan 10 jaar, wat de robuustheid van deze aanpak aantoont en het vermogen om celopwekking na opslag te vergemakkelijken.
αA-kristallijn en γ-kristallijn werden gebruikt als markers voor LEC's. PROX1 werd gebruikt als marker voor lensvezelcellen. Aanvullende markers zoals PAX6, FOXE3 en E-cadherine kunnen ook worden gebruikt om het LEC-fenotype te karakteriseren. Als onderzoekers geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van EMT, moet αSMA als marker worden gebruikt. Het is van essentieel belang om de incubatietijd en verdunningen aan te passen aan de specifieke vereisten van het experiment en de aanbevelingen voor de respectieve gebruikte antilichamen.
Hoewel deze studie een robuuste methodologie presenteert voor het kweken van primaire LEC's, is het belangrijk om de beperkingen ervan te erkennen. Hoewel de cellen die in eerste instantie worden geïsoleerd primaire LEC's zijn, zullen alle subculturing-, trypsinisatie- en reanimatieprocedures leiden tot veranderingen in hun status. Het protocol dat we hebben ontworpen, maakt voornamelijk gebruik van de muislens als bron van LEC's; LEC's kunnen echter ook worden gekweekt uit andere bronnen, waaronder monsters van staarpatiënten, oogbankogen of patiënten met verschillende oogaandoeningen, waaronder glaucoom en diabetische retinopathie17,24. LEC's die zijn geoogst van oudere personen of mensen met specifieke oogaandoeningen voldoen mogelijk niet zo effectief aan het protocol als cellen van jongere, gezondere tegenhangers. Voor het kweken van LEC's van oudere of genetisch gemodificeerde individuen of dieren kan het nodig zijn het kweekmedium te optimaliseren, mogelijk door FBS te verhogen tot 20% of door extra groeifactoren op te nemen. Bovendien toonden eerdere studies van Menko et al., uitgevoerd op epitheelcelculturen met primaire embryonale kuikenlens, spontane differentiatie aan die optrad na de tweede kweekdag25. Daarom moeten onderzoekers voorzichtig zijn en rekening houden met de verschillen in methodologieën, vooral als het bestuderen van differentiatie hun belangrijkste onderzoeksdoel is.
Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om primaire LEC's te kweken. Methoden ontwikkeld door Ibaraki et al., Sundelin et al. en Andjelic et al., omvatten bijvoorbeeld het kweken van primaire LEC's rechtstreeks op de petrischaal met behulp van het voorste deel van het lenskapsel dat is verzameld tijdens staaroperatie 16,17,19,20. Deze benadering handhaaft natuurlijke cel-tot-celcontacten en de extracellulaire matrix, wat een hoge fysiologische relevantie oplevert die cruciaal is voor aandoeningen zoals PCO. Als alternatief behoudt de lensexplantatiemethode, zoals geschetst door Zelenka et al. de inheemse weefselarchitectuur, waardoor studies mogelijk zijn die fysiologisch relevanter zijn, vooral gunstig voor het onderzoeken van de terminale differentiatie van LEC's, cellulaire interacties en lensontwikkelingsprocessen, waardoor een gedetailleerd begrip wordt verkregen van sequentiële cellulaire en moleculaire gebeurtenissen tijdens differentiatie26.
Daarentegen produceert de trypsinisatiemethode die in dit protocol wordt beschreven een uniforme eencellige suspensie, waardoor uniform zaaien en nauwkeurig tellen van cellen wordt vereenvoudigd, wat voordelig is voor bepaalde experimenten zoals cellevensvatbaarheids- en proliferatietests, medicijnscreening en analyse van celsignaleringsroutes. Het is echter van cruciaal belang om te erkennen dat, hoewel deze methode gecontroleerde en nauwkeurige studies mogelijk maakt vanwege de uniforme celpopulatie, het cellulaire gedrag kan veranderen en de fysiologische relevantie in gevaar kan brengen die wordt gezien in de explantatie- en direct-cultuurmethoden als gevolg van enzymatische verwerking. Voor onderzoekers die zich uitsluitend richten op het bestuderen van epitheelcellen, blijkt deze methode zeer toepasbaar en handig te zijn, en biedt het betrouwbare inzichten in de kenmerken en het gedrag van deze cellen. Voor degenen wier wetenschappelijk onderzoek zich uitstrekt tot cellulaire differentiatie, wordt het echter essentieel om alternatieve methoden te overwegen, zoals explantatietechnieken, of om de huidige aan te passen en te optimaliseren om deze aspecten te omvatten.
Over het algemeen is dit protocol ontworpen met zorgvuldige afweging van de specifieke behoeften en vereisten van LEC's. Elke stap, van dissectie tot validatie, is zorgvuldig ontworpen om de levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen te behouden. Als gevolg hiervan kan het een waardevolle gids zijn voor onderzoekers die LEC's en hun rol in oculaire fysiologie en pathologie bestuderen. Toekomstige studies kunnen dit protocol aanpassen en wijzigen om verschillende aspecten van LEC-biologie te onderzoeken, waardoor een platform wordt geboden voor verdere vooruitgang in het begrip van lensgerelateerde ziekten en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor cataract- en PCO-preventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NEI R21EY033941 (aan Hongli Wu); Ministerie van Defensie W81XWH2010896 (naar Hongli Wu); R15GM123463-02 (aan Kayla Green en Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
