Summary
Dette manuskriptet skisserer en detaljert videoprotokoll for dyrking av primære linseepitelceller (LEC), med sikte på å forbedre reproduserbarheten og hjelpe forskning i grå stær og posterior kapselopacifisering (PCO). Den tilbyr trinnvise instruksjoner om linsedisseksjon, LECs isolasjon og validering, og fungerer som en verdifull guide, spesielt for nykommere i feltet.
Abstract
Linseepitelceller (LEC) spiller flere viktige roller for å opprettholde homeostase og normal funksjon av linsen. LEC bestemmer linsevekst, utvikling, størrelse og gjennomsiktighet. Omvendt kan dysfunksjonelle LEC føre til kataraktdannelse og bakre kapselopacifisering (PCO). Derfor er etablering av et robust primært LEC-kultursystem viktig for forskere som er engasjert i linseutvikling, biokjemi, kataraktbehandling og PCO-forebygging. Dyrking av primære LEC-er har imidlertid lenge bydd på utfordringer på grunn av deres begrensede tilgjengelighet, langsomme spredningshastighet og delikate natur.
Denne studien adresserer disse hindringene ved å presentere en omfattende protokoll for primær LEC-kultur. Protokollen omfatter viktige trinn som formulering av et optimalisert kulturmedium, presis isolering av linsekapsler, trypsiniseringsteknikker, subkulturprosedyrer, høstprotokoller og retningslinjer for lagring og forsendelse. Gjennom hele dyrkningsprosessen ble cellemorfologi overvåket ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
For å bekrefte ektheten av de dyrkede LECene ble immunfluorescensanalyser utført for å oppdage tilstedeværelsen og subcellulær fordeling av kritiske linseproteiner, nemlig a- og γ-krystalliner. Denne detaljerte protokollen utstyrer forskere med en verdifull ressurs for å dyrke og karakterisere primære LECs, noe som muliggjør fremskritt i vår forståelse av linsebiologi og utvikling av terapeutiske strategier for linserelaterte lidelser.
Introduction
Linsen i øyet spiller en avgjørende rolle i synet ved å fokusere innkommende lys på netthinnen. Den består av en gjennomsiktig, avvaskulær struktur sammensatt av spesialiserte celler, blant hvilke linseepitelceller (LEC) er sentrale aktører. LEC er plassert på linsens fremre overflate og er ansvarlige for å opprettholde gjennomsiktigheten, regulere vannbalansen og delta i linsevekst og utvikling 1,2. LEC er en unik type celler som ligger i den fremre delen av linsen, og spiller en kritisk rolle for å opprettholde linsens klarhet og funksjon ved kontinuerlig å produsere linsefibre gjennom livet.
Katarakt er preget av den progressive oversvømmelsen av linsen, noe som resulterer i forvrengning og spredning av lys, noe som fører til kompromittert syn 3,4. De nøyaktige mekanismene som ligger til grunn for kataraktdannelse er komplekse og multifaktorielle, og involverer forskjellige cellulære og molekylære prosesser som UV-stråling, oksidativ skade og glykering 5,6. LEC har vist seg å bidra betydelig til utviklingen av grå stær, noe som gjør dem til et viktig fokus for forskning 1,2,7,8,9.
Videre er et av de mest presserende problemene i oftalmologi i dag den relativt høye forekomsten av posterior kapselopacifisering (PCO), også kjent som sekundær katarakt. PCO er fortsatt den vanligste komplikasjonen etter kataraktkirurgi, og påvirker opptil 20-40% av voksne pasienter og 100% av barn innen 5 år etter operasjonen10. PCO forårsakes hovedsakelig av gjenværende LEC som forblir i kapselposen etter kataraktekstraksjon. Disse cellene gjennomgår en mangesidig patofysiologisk transformasjon som involverer ikke bare epithelial-til-mesenkymal overgang (EMT), men også differensiering av LEC til linsefibre, noe som resulterer i en cellepopulasjon som er en blanding av LEC, fibre og myofibroblaster 11,12,13. De transformerte cellene prolifererer og migrerer over den bakre linsekapselen, noe som fører til synshemming. Å forstå atferden og kontrollmekanismene til LEC i kulturmodeller kan gi verdifull innsikt i forebygging og håndtering av PCO. Derfor presenterer denne protokollen for dyrking av LEC et viktig verktøy for oftalmiske forskere som tar sikte på å studere, forstå og til slutt bekjempe denne utbredte postoperative komplikasjonen.
For å avdekke vanskelighetene med LEC-biologi og dens rolle i kataraktdannelse og PCO, er det viktig å etablere robuste og reproduserbare in vitro primære cellekultursystemer. Primær LEC-kultur gir forskere et kontrollert miljø for å studere funksjoner, signalering og molekylære egenskaper av LECer. Videre tillater det undersøkelse av cellulære prosesser og effekten av forskjellige eksperimentelle forhold, noe som gir verdifull innsikt i linsefysiologi og patologi.
Tidligere forskning har beriket vår forståelse av LEC kultur teknikker 14,15,16,17,18,19,20. Selv om disse studiene har benyttet ulike metoder og gitt betydelige funn om LEC-oppførsel og egenskaper, er en omfattende og tilgjengelig videoopptaksprotokoll for dyrking av LEC fraværende i dagens litteratur. Denne begrensningen kan hindre nybegynneres evne til å reprodusere teknikkene nøyaktig og kan føre til inkonsekvenser og variasjoner i eksperimentelle resultater. Ved å tilby en videoopptaksprotokoll, har dette forskningspapiret som mål å bygge bro over dette gapet og gi en standardisert ressurs som kan forbedre reproduserbarheten og lette kunnskapsoverføringen innen LEC-kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Association for Research in Vision and Ophthalmology retningslinjer for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. Prosedyregodkjenning ble gitt av University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee (protokollnummer: IACUC-2022-0008). Unge C57BL/6J-mus, vanligvis under 2 ukers alder, ble brukt i disse studiene.
1. Kultur medium forberedelse og linse disseksjon
- Forbered dyrkningsmedium ved å tilsette 50 ml føtal bovint serum (FBS) og 0,1 ml 50 mg / ml gentamicin til 450 ml DMEM.
- Avlive C57BL/6J mus yngre enn 2 uker på en human måte.
MERK: Vi avlivet ved hjelp av CO2 inhalasjonsmetoden. En optimal strømningshastighet for CO2 eutanasisystemer bør fortrenge 30% til 70% av kammeret eller merdens volum / min. - Fjern øyelokkene forsiktig ved hjelp av kirurgisk saks og bruk delikat trykk med buet pinsett på motsatte sider av øyehulen, noe som får øyet til å stikke utover. Gjør et forsiktig snitt på hornhinnen ved hjelp av kataraktkniven og trekk forsiktig ut linsen ved hjelp av buet pinsett, slik at du ikke skader linsen eller kapselen.
MERK: Vær forsiktig når du utfører disse trinnene for å opprettholde linsekapselens integritet. På grunn av objektivets delikate natur er det viktig å bruke dissekeringsverktøy med buede og stumpe tips for å minimere risikoen for linseskader. - Bruk buet pinsett med butte spisser for å overføre linsene til en 60 mm plastisk vevskulturskål fylt med 5 ml forvarmet og steril Dulbeccos fosfatbufrede saltoppløsning (DPBS) som inneholder 10 μg / ml gentamicin.
- Skyll linsene forsiktig med DPBS-oppløsning som inneholder 10 μg / ml gentamicin for å fjerne potensielt rusk eller forurensninger, klargjøre linsene for videre behandling og opprettholde et sterilt kulturmiljø.
- For å oppnå et tilstrekkelig antall LEC-er, basseng fire linser for en 24-brønns kulturplate og seks linser for en 6-brønns kulturplate.
2. LECs isolasjon
- Etter å ha fullført skylleprosessen, legg linsen på et stykke filterpapir, slik at det tørker.
- Når linsen er tilstrekkelig tørr, overfør den forsiktig til dekselet på en petriskål som forberedelse til fjerning av linsekapselen.
- Roter linsen oppover, og sørg for at det fremre segmentet vender oppover. Mens du bruker pinsetten til å holde den fremre kapselen, bruk capsulorhexis tang i den dominerende hånden for å skape en liten rift i kapselen. Trekk forsiktig de to verktøyene i motsatt retning for å fjerne kapselen og sett den i DPBS til alle linsedisseksjonene er fullført.
MERK: For å unngå uoverensstemmelser, bør forskere straks dissekere hver linseepitelkapsel og midlertidig lagre dem i DPBS. Først etter at alle disseksjoner er fullført, overføres kapslene kollektivt til trypsin ved 37 °C, noe som sikrer synkronisert og jevn eksponering. - Overfør linsekapselen forsiktig til en 6-brønnsplate. Tilsett 1 ml 0,05% trypsinløsning til hver brønn for å starte den enzymatiske fordøyelsesprosessen.
- Rist forsiktig trypsinløsningen for å sikre jevn gjennomtrengning. Legg platen i en cellekulturinkubator og la kapselen fordøyes i 8-10 minutter ved 37 °C.
MERK: Dette trinnet letter nedbrytningen av linsekapselvevet og den påfølgende frigjøringen av individuelle epitelceller. - Etter inkubasjonen, hakk forsiktig den fordøyde linsekapselen ved hjelp av dissekere saks for å bryte ned eventuelle gjenværende vevsklumper og fremme celleseparasjon.
MERK: Grundighet i vevshakking vektlegges for å sikre effektiv cellefrigjøring fra de fordøyede linsekapslene. - Tilsett 0,5 ml av kulturmediet som inneholder 10% FBS for å slukke trypsinet. Overfør vevsprøvene til et sentrifugeringsrør og sentrifuge ved 1000 × g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten. Bruk 1 ml kulturmedium for å resuspendere cellene og frø cellene i en 24-brønnsplate.
- Endre kulturmediet hver 2-3 dag.
3. LECs subkultur
- Når cellene oppnår samløp, fjern mediet fra kulturskålen. Fortsett å vaske cellene 2x med 1 ml DPBS.
- Tilsett 200 μL trypsin-EDTA-løsning og plasser cellene i inkubatoren i 5 minutter.
- Etter inkubering, fjern cellene fra inkubatoren og inspiser dem under et mikroskop for å bekrefte at de har løsnet fra kulturskålen og begynt å flyte.
- Tilsett 1 ml kulturmedium og pipetter cellene forsiktig 3-5x for å løsne alle cellene.
- Overfør cellene til sentrifugerør og sentrifuge ved 1000 × g i 5 minutter.
- Fjern forsiktig supernatanten og resuspender cellene i hele vekstmediet.
- Hvis nødvendig, telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
- Del cellesuspensjonen i forholdet 1: 2 eller 1: 3 for subkultureringsformål.
- Når kulturen blir sammenflytende igjen, gjenta de nevnte prosedyrene.
MERK: LEC blomstrer i kulturforhold med høy tetthet. Unngå overdreven fortynning av cellene, da dette kan hindre veksten.
4. Lagring og forsendelse
MERK: Det ideelle cellenummeret for lagring er ~ 1 × 106.
- Vask cellene grundig 3x med 1 ml DPBS. Etter vask, tilsett 1 ml trypsin-EDTA-løsning og plasser cellene i inkubatoren i 5 minutter.
- Tilsett 2 ml komplett kulturmedium og overfør cellesuspensjonen til sentrifugerøret og sentrifugen ved 1000 × g i 5 minutter.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i et frysemedium bestående av 90 % FBS og 10 % DMSO, med sikte på en celletetthet på 1 × 106 celler/ml. Overfør cellesuspensjonen til kryovialen.
- Flytt umiddelbart cellene til et -20 °C miljø i 1 time, etterfulgt av -80 °C over natten, før permanent lagring i flytende nitrogen.
MERK: Hvis flytende nitrogen ikke er tilgjengelig, kan cellene lagres ved -80 °C etter en innledende time ved -20 °C. - Hvis en forsendelse er nødvendig, send cellene i cryovial i en pakke med tørris for levering over natten.
- Ved mottak av cellene, sørg for rask gjenoppretting og plasser cellene i subkulturen. Hvis umiddelbar kultur ikke er mulig, overfør cellene til flytende nitrogen for langvarig lagring.
MERK: Hvis cellene skal sendes, må du sørge for at prøvene er dypt begravet i tørrisen for å forhindre potensiell skade fra temperatursvingninger.
5. LECs validering
- Plate LEC i 35 mm kulturretter med dekkglass og dyrk dem i ca. 48 timer.
- Vask cellene 2x med PBS og fiks cellene med kald metanol i 10 min ved -20 °C.
- Vask de faste cellene i 3 x 5 min med PBS og inkuber de faste cellene med blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur for å forhindre uspesifikk binding.
- Etter blokkering, inkuber cellene over natten ved 4 °C med de primære antistoffene (αA-krystallinske, γ-krystallinske og PROX1-antistoffer) individuelt fortynnet i forholdet 1:50 i fortynningsbuffer.
- Vask cellene i 3 x 5 min med PBS og inkuber cellene med det sekundære antistoffet fortynnet 1:100 i fortynningsvæskebuffer i 1 time.
- Vask cellene i 3 x 5 min med PBS og farg cellene med 5 μg/ml Hoechst 33342 i PBS i 10 minutter ved romtemperatur for å visualisere kjernene.
- Vask cellene i 2 x 5 min med PBS for å fjerne overflødig fargeløsning og ta fluorescerende bilder av cellene ved hjelp av et fluorescensmikroskop ved hjelp av DAPI-kanalen for kjerner og FITC-kanal for a-, γ-krystalliner og PROX1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 2, ved å følge denne protokollen, festet primære LECer fra C57BL/6J-mus seg til oppvasken innen en periode på 4 timer. Spesielt var det synlige rester av andre vev som deler av bakre kapsel og linsefiberceller. Disse utilsiktede elementene festet seg imidlertid ikke til parabolen og kunne derfor fjernes ved å endre kulturmediet. Deretter, mellom den tredje og femte dagen, startet LEC-ene sin spredningsfase. Rask vekst, karakteristisk for den logaritmiske proliferasjonsfasen, kunne da observeres mellom den syvende og tiende dagen. I tilfeller der cellene ikke går videre til den raske vekstfasen, kan det være tilrådelig å innlemme veksttilskudd, som EpiCGS-a, i kulturmediet. Videre observerte vi at celler utviser en raskere vekstrate i mediet som inneholder 20% FBS sammenlignet med 10% FBS. En lavere FBS-konsentrasjon fremmer vanligvis langsommere vekst, som speiler egenskapene til linsens sentrale epitel, mens en 20% FBS-konsentrasjon replikerer egenskapene til linsens proliferative sone.
Ifølge Reddy et al. og Andley et al., som utviklet den udødeliggjorte humane linseepitelcellelinjen B3, forventes det at LEC skal uttrykke forskjellige linsespesifikke proteiner som a- og γ-krystalliner 2,21. Derfor brukte vi i denne studien a- og γ-krystalliner som cellulære markører for å validere identiteten til cellene som LECer. LECs innenfor de tre første passasjene ble dyrket på glassdeksel. De primære antistoffene som er spesifikke for αA- og γ-krystalliner ble brukt til å inkubere cellene over natten. Som vist i figur 3 viste disse cellene robust ekspresjon av både a- og γ-krystalliner, noe som gir definitive bevis på at de er linseavledede epitelceller. I tillegg brukte vi PROX1 som en veletablert markør for fiberceller for å merke de primære LECene. Dataene indikerte at disse LECene viste negativ farging for PROX1, og bekreftet at disse cellene er epitelceller og ikke hadde gjennomgått differensiering i fiberceller ennå.
Figur 1: Trinnvis arbeidsflyt for LEC-kultur. Figuren skildrer de sekvensielle trinnene som er involvert i kulturen av primære linseepitelceller. Trinn 1 innebærer å lage en liten rift i den fremre kapselen. Trinn 2 innebærer å fjerne linsekapselen forsiktig. I trinn 3 overføres linsekapselen forsiktig til en 24-brønns plate og inkuberes med 0,05 % trypsinoppløsning ved 37 °C i 10 minutter. Etter inkubasjon hakkes den fordøyde linsekapselen ved hjelp av dissekerende saks for å fremme celleseparasjon. Trinn 4 innebærer å slukke trypsinet ved å tilsette 0,5 ml kulturmedium inneholdende 20% FBS til sentrifugeringsrøret og sentrifugere vevsprøvene ved 1000 × g i 5 minutter. Trinn 5 krever resuspendering av cellene i 1 ml kulturmedium og såing av dem i en 24-brønnsplate. Til slutt innebærer trinn 6 å endre kulturmediet hver 2-3 dag for å støtte cellevekst og vedlikehold gjennom hele eksperimentet. Forkortelser: LECs = linseepitelceller; FBS = føtalt bovint serum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vekstmønster for LEC over tid. De morfologiske endringene av primære linseepitelceller på forskjellige tidspunkter under veksten ble registrert under et fasekontrastmikroskop. Bildene tatt på dag 1, 2, 3, 5, 7 og 10 skildrer den utviklende cellemorfologien, og gir innsikt i utviklingen og oppførselen til linseepitelceller over tid. Rød pil som indikerer plasseringen av aktivt prolifererende linseepitelceller. Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: LECs = linseepitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering av LEC. (A) Immunfarging av αA-krystallin i mus LECs. Primære mLECs ble farget med Hoechst 33342 (blå) og αA-krystallinsk antistoff (grønn). (B) Immunfarging av γ-krystallin i mus LECs. (C) Immunfarging av PROX1 i LEC fra mus. Primære mLECs ble farget med Hoechst 33342 (blå) og PROX1 antistoff (grønn). Skalastenger = 50 μm. Forkortelse: LECs = linseepitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres i denne artikkelen gir en omfattende, trinnvis veiledning til vellykket isolasjon, kultur og subkultur av primære LEC-er, komplett med tilhørende videodokumentasjon. Den detaljerte visuelle veiledningen sammen med de skriftlige instruksjonene forbedrer klarheten og tilgjengeligheten til protokollen, og fremmer bruken og reproduserbarheten blant forskere på feltet. Det endelige målet er å bidra til den voksende kunnskapskunnskapen rundt LECs rolle i kataraktdannelse og PCO, en utbredt komplikasjon etter kataraktkirurgi.
Ved sammenligning av primære LEC med linseepitelcellelinjer, som HLE-B3 og SRA01/04, presenterer hver unike fordeler og utfordringer i forskningssammenheng. HLE-B3-cellelinjen, sammen med SRA01/04, representerer en kategori av cellelinjer som, selv om de er enkle å håndtere og holdbare, ofte utviser genetiske og fenotypiske endringer på grunn av deres kontinuerlige replikasjon og langvarige kulturforhold. Dette kan føre til betydelige forskjeller fra funksjonen til de opprinnelige LEC-ene, og dermed redusere ektheten av svarene deres. Omvendt speiler primære LECer, direkte isolert fra levende vev fra pasienter eller forsøksdyr, mer nøyaktig det naturlige cellulære miljøet og iboende responser av linsen in vivo. Til tross for den ekstra kompleksiteten i utvinningen og kulturen, foretrekkes de ofte i studier som krever høy fysiologisk relevans, da de gir mer nøyaktige og pålitelige resultater.
Noen viktige punkter må vurderes mens du følger denne protokollen. Unge C57BL/6J-mus, vanligvis under 2 ukers alder, ble brukt i disse studiene. Vi observerte at LEC høstet fra disse unge musene viste mer kraftig vekst sammenlignet med LEC fra mus i alderen 2 måneder eller eldre. Dette indikerer en negativ korrelasjon mellom musenes alder og cellevekst.
Disseksjonen av linsen fra et museøye er en delikat oppgave, noe som krever forsiktig bruk av dissekeringsverktøy for å bevare integriteten til linsen og kapselen. Prosedyren som er beskrevet i protokollseksjon 1 sikrer at linsen trekkes ut med minimal skade. Selv om det er utfordrende å opprettholde helsen og integriteten til linsekapselen, kan dens betydning ikke undervurderes, da eventuelle skader potensielt kan påvirke kvaliteten og kvantiteten av LECs isolerte. Det er bemerkelsesverdig at flertallet av celledelinger vanligvis forekommer i spiringssonen nær ekvatorialområdet i linsen, et område som ikke er lett tilgjengelig for dyrking. Ifølge Zetterberg et al., selv om den sentrale delen av linseepitelet viser minimal mitotisk aktivitet under normale omstendigheter, har eksperimenter som benytter tritiert tymidin (3H-Tdr) merking markert disse sentralt plasserte linseepitelcellene som potensielle stamceller17,22. Stamceller utviser forskjellige egenskaper, for eksempel ubegrenset spredningskapasitet til tross for at de har lav spredningshastighet under standardforhold. Som sådan kan den sentrale delen av linseepitelet gi en bedre representasjon av LECs proliferative kapasitet enn den spirende sonen.
Isoleringen av LECer, som beskrevet i protokollseksjon 2, utgjør et sentralt trinn i denne eksperimentelle prosedyren. Integrerte handlinger, inkludert fjerning av linsekapselen, enzymatisk fordøyelse og vevsfragmentering, utføres nøye for å skille individuelle epitelceller fra kapselen. Et av de kritiske elementene i denne prosessen er varigheten av trypsinfordøyelsen. Det anbefales at fordøyelsesperioden settes mellom 8 og 10 min. Hvis denne perioden forkortes til mindre enn 5 minutter, kan det føre til ufullstendig celleseparasjon. Omvendt kan overutvidelse av denne tidsrammen betydelig kompromittere cellens levedyktighet. Det strategiske valget om å bruke trypsin-EDTA som et celledissosiasjonsreagens, i forbindelse med et DMEM-kulturmedium supplert med 20% FBS og 10 μg / ml gentamicin, optimaliserer cellefrigivelse og påfølgende spredning samtidig som potensielle forurensningsrisikoer reduseres.
Antibiotika brukes ofte til å forhindre bakteriell forurensning under primære LEC-kulturer. Imidlertid bør valget av antibiotika gjøres nøye. Vanlige antibiotika som penicillin og streptomycin, samt antifungale midler, har potensial til å påvirke levedyktigheten til LEC. Som et alternativ anbefales det å bruke en gentamicinløsning i en konsentrasjon på 10 μg / ml for optimal LEC-vekst.
Videre er opprettholdelse av en høy celletetthet en annen avgjørende faktor for vellykket primær LEC-kultur. I motsetning til etablerte cellelinjer trenger primære LEC en høyere celletetthet for optimal vekst. Dette skyldes hovedsakelig deres avhengighet av effektiv intercellulær kommunikasjon, tilrettelagt av direkte kontakt eller parakrin signalering, noe som bidrar til å opprettholde deres differensieringsstatus og funksjon. Høy celletetthet reduserer også de negative effektene av "kultursjokk", en tilstand som oppleves av primære celler når de isoleres og plasseres i et in vitro-miljø som er vesentlig forskjellig fra deres in vivo opprinnelse23. Ved å etterligne et mer in vivo-lignende miljø, øker en høy celletetthet overlevelsesraten. I tillegg bidrar denne tettheten til å etablere en konsentrasjonsgradient av vekstfaktorer og cytokiner som støtter cellevekst og funksjon. Gitt at mange primære celler er forankringsavhengige, og krever overflatefeste for spredning, tilbyr en høy celletetthet et tilstrekkelig antall naboceller for adhesjon, og fremmer dermed sunn vekst. Følgelig er reguleringen av celletetthet et avgjørende hensyn i dyrking av primære celler på grunn av dens betydelige innvirkning på cellekommunikasjon, overlevelse og spredning. Å velge mindre kulturretter, for eksempel 24-brønns eller 6-brønns plater, anbefales å skape et ideelt miljø for LEC-er. Å følge denne protokollen resulterer vanligvis i at LEC-er når en konfluent tilstand ~ 10-14 dager etter dyrking. Vi anbefaler å bruke LEC ved et lavt antall passasjer, ideelt mellom P0 og P6, for å sikre den mest naturlige oppførselen i eksperimenter. Utover 7-10 passasjer kan LEC vise redusert vekst og kan ikke reagere på eksperimentelle forhold på samme måte som celler i lavere passasjer.
Serumkonsentrasjonen er direkte relatert til hastigheten på cellevekst. Lavere nivåer av FBS er mer sannsynlig å indusere langsommere vekst, som ligner egenskapene til det sentrale epitelet. I motsetning til dette etterligner høyere FBS-nivåer forholdene i den proliferative sonen. Hvis celleveksten er langsom, som kan oppstå når LEC må isoleres fra eldre eller genetisk modifiserte dyr, kan det være fordelaktig å øke FBS til 20% eller legge til et veksttilskudd som EpiCGS-a (5 ml, se materialfortegnelse) til kulturmediet. Dette serumet og supplementanrikningen kan forbedre celleproliferasjon og fremme optimal vekst av epitelceller.
Lagrings- og forsendelsesprotokollen (protokoll avsnitt 5) vurderer utfordringene knyttet til bevaring og transport av levende celler. Valget av frysemedium er avgjørende for overlevelse av LEC under lagring og transport. Vi har eksperimentert med forskjellige frysemedier, inkludert 70% komplett kulturmedium + 20% FBS + 10% DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; og DMSO- og serumfritt frysemedium. Bevis fra våre eksperimenter tyder på at en løsning bestående av 10% DMSO og 90% FBS utviser overlegen ytelse for å bevare cellens levedyktighet. Ved hjelp av denne spesifikke formuleringen har vi vellykket opprettholdt primære LEC-er i lagring ved -80 ° C i varigheter over 10 år, noe som viser robustheten til denne tilnærmingen og dens evne til å lette cellegjenoppliving etter lagring.
a-krystallin og γ-krystallin ble brukt som markører for LEC. PROX1 ble brukt som markør for linsefiberceller. Ytterligere markører som PAX6, FOXE3 og E-cadherin kan også brukes til å karakterisere LEC-fenotypen. Hvis forskere er interessert i å utforske EMT, bør αSMA brukes som en markør. Det er viktig å justere inkubasjonstider og fortynninger i samsvar med de spesifikke kravene i forsøket og anbefalingene som er gitt for de respektive antistoffene som brukes.
Selv om denne studien presenterer en robust metodikk for dyrking av primære LECer, er det viktig å erkjenne begrensningene. Mens cellene isolert i utgangspunktet er primære LECs, vil eventuelle subkulturerings-, trypsiniserings- og reanimeringsprosedyrer føre til endringer i deres status. Protokollen vi har designet bruker primært muselinser som kilde til LECs; LEC kan imidlertid også dyrkes fra andre ressurser, inkludert kataraktpasientprøver, øyebankøyne eller pasienter med forskjellige okulære sykdommer, inkludert DrDeramus og diabetisk retinopati17,24. LEC høstet fra eldre individer eller de med spesifikke okulære forhold kan ikke overholde protokollen like effektivt som celler fra yngre, sunnere kolleger. Dyrking av LEC fra eldre eller genetisk modifiserte individer eller dyr kan kreve optimalisering av kulturmediet, potensielt ved å øke FBS til 20% eller innlemme flere vekstfaktorer. I tillegg viste tidligere studier av Menko et al., utført på primære embryonale kyllinglinseepitelcellekulturer, spontan differensiering som skjedde etter den andre dagen av kultur25. Derfor bør forskere utvise forsiktighet og vurdere forskjellene i metoder, spesielt hvis det å studere differensiering er deres viktigste forskningsmål.
Ulike metoder kan brukes til å dyrke primære LECer. For eksempel involverer metoder utviklet av Ibaraki et al., Sundelin et al. og Andjelic et al. dyrking av primære LECer direkte på petriskålen ved hjelp av den fremre delen av linsekapselen samlet under kataraktkirurgi 16,17,19,20. Denne tilnærmingen opprettholder naturlige celle-til-celle-kontakter og den ekstracellulære matrisen, og gir høy fysiologisk relevans som er avgjørende for forhold som PCO. Alternativt bevarer linseeksplanteringsmetoden, som skissert av Zelenka et al. innfødt vevsarkitektur, noe som muliggjør studier som er mer fysiologisk relevante, spesielt gunstige for å utforske terminaldifferensieringen av LECer, cellulære interaksjoner og linseutviklingsprosesser, og gir en detaljert forståelse av sekvensielle cellulære og molekylære hendelser under differensiering26.
I motsetning til dette gir trypsiniseringsmetoden beskrevet i denne protokollen en jevn enkeltcellesuspensjon, noe som forenkler jevn såing og presis celletelling, noe som er fordelaktig for visse eksperimenter som celle levedyktighet og proliferasjonsanalyser, medikamentscreening og cellesignalveianalyse. Det er imidlertid viktig å erkjenne at mens denne metoden letter kontrollerte og presise studier på grunn av sin ensartede cellepopulasjon, kan den endre cellulær oppførsel og kompromittere den fysiologiske relevansen sett i eksplanterings- og direktekulturmetodene på grunn av enzymatisk behandling. For forskere som utelukkende fokuserer på å studere epitelceller, viser denne metoden seg svært anvendelig og praktisk, og gir pålitelig innsikt i egenskapene og oppførselene til disse cellene. Men for de hvis vitenskapelige undersøkelser strekker seg til cellulær differensiering, blir det viktig å vurdere alternative metoder som eksplanteringsteknikker, eller tilpasse og optimalisere den nåværende for å omfatte disse aspektene.
Samlet sett er denne protokollen utformet med nøye vurdering av de spesifikke behovene og kravene til LEC-er. Hvert trinn, fra disseksjon til validering, er gjennomtenkt utformet for å opprettholde levedyktigheten og funksjonaliteten til cellene. Som et resultat kan det være en verdifull guide for forskere som studerer LEC og deres rolle i okulær fysiologi og patologi. Fremtidige studier kan tilpasse og modifisere denne protokollen for å utforske ulike aspekter av LEC-biologi, noe som gir en plattform for videre fremskritt i forståelsen av linserelaterte sykdommer og utvikling av nye terapeutiske strategier for katarakt og PCO-forebygging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NEI R21EY033941 (til Hongli Wu); Forsvarsdepartementets W81XWH2010896 (til Hongli Wu); R15GM123463-02 (til Kayla Green og Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
