Summary
Este manuscrito describe un protocolo de video detallado para el cultivo de células epiteliales del cristalino primario (LEC), con el objetivo de mejorar la reproducibilidad y ayudar a la investigación en cataratas y opacificación de la cápsula posterior (PCO). Ofrece instrucciones paso a paso sobre la disección de lentes, el aislamiento de LEC y la validación, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al campo.
Abstract
Las células epiteliales del cristalino (LEC, por sus siglas en inglés) desempeñan múltiples funciones importantes en el mantenimiento de la homeostasis y la función normal del cristalino. Los LEC determinan el crecimiento, el desarrollo, el tamaño y la transparencia de las lentes. Por el contrario, las LEC disfuncionales pueden conducir a la formación de cataratas y a la opacificación de la cápsula posterior (OCP). En consecuencia, el establecimiento de un sistema robusto de cultivo primario de LEC es importante para los investigadores que se dedican al desarrollo de lentes, la bioquímica, la terapéutica de cataratas y la prevención del SOP. Sin embargo, el cultivo de LEC primarios ha presentado desafíos durante mucho tiempo debido a su disponibilidad limitada, su lenta tasa de proliferación y su naturaleza delicada.
Este estudio aborda estos obstáculos mediante la presentación de un protocolo integral para el cultivo primario de LEC. El protocolo abarca pasos esenciales como la formulación de un medio de cultivo optimizado, el aislamiento preciso de las cápsulas de cristalino, las técnicas de tripsinización, los procedimientos de subcultivo, los protocolos de cosecha y las directrices para el almacenamiento y el envío. A lo largo del proceso de cultivo, se monitorizó la morfología celular mediante microscopía de contraste de fase.
Para confirmar la autenticidad de las LEC cultivadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para detectar la presencia y distribución subcelular de proteínas críticas del cristalino, a saber, αA- y γ-cristalinas. Este protocolo detallado equipa a los investigadores con un recurso valioso para cultivar y caracterizar las LEC primarias, lo que permite avances en nuestra comprensión de la biología del cristalino y el desarrollo de estrategias terapéuticas para los trastornos relacionados con el cristalino.
Introduction
El cristalino del ojo desempeña un papel crucial en la visión al enfocar la luz entrante en la retina. Consiste en una estructura transparente y avascular compuesta por células especializadas, entre las cuales las células epiteliales del cristalino (LEC) son actores clave. Las LEC se localizan en la superficie anterior del cristalino y son responsables de mantener su transparencia, regular el equilibrio hídrico y participar en el crecimiento y desarrollo del cristalino 1,2. Las LEC son un tipo único de células ubicadas en la parte anterior del cristalino, que desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la claridad y la función del cristalino mediante la producción continua de fibras del cristalino a lo largo de la vida.
Las cataratas se caracterizan por la opacidad progresiva del cristalino, lo que resulta en la distorsión y dispersión de la luz, lo que lleva a una visión comprometida 3,4. Los mecanismos precisos que subyacen a la formación de cataratas son complejos y multifactoriales, e involucran diversos procesos celulares y moleculares como la radiación UV, el daño oxidativo y la glicación 5,6. Se ha encontrado que las LEC contribuyen significativamente al desarrollo de cataratas, lo que las convierte en un foco vital de investigación 1,2,7,8,9.
Además, uno de los problemas más apremiantes en oftalmología hoy en día es la incidencia relativamente alta de opacificación de la cápsula posterior (OCP), también conocida como catarata secundaria. El SOP sigue siendo la complicación más frecuente después de la cirugía de cataratas, afectando hasta al 20-40% de los pacientes adultos y al 100% de los niños dentro de los 5 años posteriores a la cirugía10. El SOP es causado principalmente por los LEC residuales que permanecen en la bolsa capsular después de la extracción de cataratas. Estas células experimentan una transformación fisiopatológica multifacética que involucra no solo la transición epitelial a mesenquimal (EMT), sino también la diferenciación de las LEC a las fibras del cristalino, lo que da como resultado una población celular que es una mezcla de LEC, fibras y miofibroblastos 11,12,13. Las células transformadas proliferan y migran a través de la cápsula posterior del cristalino, lo que provoca discapacidad visual. Comprender el comportamiento y los mecanismos de control de los LEC en los modelos de cultivo puede proporcionar información valiosa sobre la prevención y el tratamiento del PCO. Por lo tanto, este protocolo de cultivo de LEC presenta una herramienta vital para los investigadores oftalmológicos que buscan estudiar, comprender y, en última instancia, combatir esta complicación postoperatoria prevalente.
Para desentrañar las complejidades de la biología de la LEC y su papel en la formación de cataratas y PCO, es esencial establecer sistemas de cultivo celular primario in vitro robustos y reproducibles. El cultivo primario de LEC proporciona a los investigadores un entorno controlado para estudiar las funciones, la señalización y las características moleculares de las LEC. Además, permite la investigación de los procesos celulares y los efectos de diferentes condiciones experimentales, proporcionando información valiosa sobre la fisiología y la patología del cristalino.
Investigaciones previas han enriquecido nuestra comprensión de las técnicas de cultivo LEC 14,15,16,17,18,19,20. Aunque estos estudios han empleado diversas metodologías y han arrojado hallazgos significativos sobre el comportamiento y las características de los LEC, en la literatura actual no existe un protocolo de grabación de video completo y accesible para el cultivo de LEC. Esta limitación puede dificultar la capacidad de los investigadores novatos para reproducir con precisión las técnicas y puede dar lugar a inconsistencias y variaciones en los resultados experimentales. Al proporcionar un protocolo de grabación de video, este trabajo de investigación tiene como objetivo cerrar esta brecha y proporcionar un recurso estandarizado que pueda mejorar la reproducibilidad y facilitar la transferencia de conocimiento en el campo de la cultura LEC.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. La aprobación del procedimiento fue otorgada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). En estos estudios se utilizaron ratones jóvenes C57BL/6J, por lo general menores de 2 semanas de edad.
1. Preparación del medio de cultivo y disección del cristalino
- Prepare el medio de cultivo añadiendo 50 mL de suero fetal bovino (FBS) y 0,1 mL de 50 mg/mL de gentamicina a 450 mL de DMEM.
- Sacrificar humanamente a ratones C57BL/6J menores de 2 semanas.
NOTA: Practicamos la eutanasia utilizando el método de inhalación de CO2 . Un caudal óptimo para los sistemas de eutanasia con CO2 debe desplazar entre el 30% y el 70% del volumen de la cámara o jaula por minuto. - Retire suavemente los párpados con unas tijeras quirúrgicas y aplique una presión delicada con pinzas curvas en lados opuestos de la cuenca del ojo, haciendo que el ojo sobresalga hacia afuera. Haga una incisión cuidadosa en la córnea con el bisturí de cataratas y extraiga con cuidado la lente con unas pinzas curvas, asegurándose de que no dañe la lente ni su cápsula.
NOTA: Tenga cuidado al realizar estos pasos para mantener la integridad de la cápsula de la lente. Debido a la naturaleza delicada de la lente, es importante utilizar herramientas de disección con puntas curvas y romas para minimizar el riesgo de dañar la lente. - Utilice pinzas curvas con puntas romas para transferir las lentes a una placa de cultivo de tejidos de plástico de 60 mm llena de 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) precalentada y estéril de Dulbecco que contiene 10 μg/ml de gentamicina.
- Enjuague suavemente las lentes con una solución DPBS que contenga 10 μg/ml de gentamicina para eliminar cualquier posible residuo o contaminante, preparar las lentes para su posterior procesamiento y mantener un entorno de cultivo estéril.
- Para obtener un número adecuado de LEC, agrupe cuatro lentes para una placa de cultivo de 24 pocillos y seis lentes para una placa de cultivo de 6 pocillos.
2. Aislamiento de LECs
- Después de completar el proceso de enjuague, coloque la lente sobre un trozo de papel de filtro, dejando que se seque.
- Una vez que la lente esté adecuadamente seca, transfiérala con cuidado a la cubierta de una placa de Petri en preparación para la extracción de la cápsula de la lente.
- Gire la lente hacia arriba, asegurándose de que el segmento anterior esté hacia arriba. Mientras usa las pinzas para sostener la cápsula anterior, emplee las pinzas de capsulorrexis en la mano dominante para crear un pequeño desgarro en la cápsula. Tire suavemente de las dos herramientas en direcciones opuestas para extraer la cápsula y colóquela en DPBS hasta que se completen todas las disecciones de la lente.
NOTA: Para evitar discrepancias, los investigadores deben diseccionar rápidamente cada cápsula epitelial del cristalino y almacenarlas temporalmente en DPBS. Solo después de completar todas las disecciones las cápsulas se transfieren colectivamente a tripsina mantenidas a 37 °C, lo que garantiza una exposición sincronizada y uniforme. - Transfiera con cuidado la cápsula de la lente a una placa de 6 pocillos. Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,05% a cada pocillo para iniciar el proceso de digestión enzimática.
- Agite suavemente la solución de tripsina para asegurar una permeabilidad uniforme. Colocar la placa en una incubadora de cultivos celulares y dejar digerir la cápsula durante 8-10 min a 37 °C.
NOTA: Este paso facilita la descomposición del tejido de la cápsula del cristalino y la posterior liberación de células epiteliales individuales. - Después de la incubación, pique cuidadosamente la cápsula del cristalino digerida con unas tijeras de disección para descomponer los grumos de tejido restantes y promover la separación celular.
NOTA: Se enfatiza la minuciosidad en la picadura de los tejidos para garantizar una liberación celular eficiente de las cápsulas del cristalino digeridas. - Añadir 0,5 ml del medio de cultivo que contenga un 10% de FBS para apagar la tripsina. Transfiera las muestras de tejido a un tubo de centrifugación y centrifugue a 1.000 × g durante 5 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo de la celda. Use 1 ml de medio de cultivo para resuspender las células y sembrarlas en una placa de 24 pocillos.
- Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días.
3. Subcultura de las LECs
- Una vez que las células logren la confluencia, retire el medio de la placa de cultivo. Proceda a lavar las células 2 veces con 1 mL de DPBS.
- Añadir 200 μL de solución de tripsina-EDTA y colocar las células en la incubadora durante 5 min.
- Después de la incubación, retire las células de la incubadora e inspecciónelas bajo un microscopio para confirmar que se han desprendido de la placa de cultivo y han comenzado a flotar.
- Agregue 1 ml de medio de cultivo y pipetee suavemente las células 3-5 veces para separar todas las células.
- Transfiera las células a los tubos de la centrífuga y centrifugue a 1.000 × g durante 5 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento completo.
- Si es necesario, cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Subdivida la suspensión celular en una proporción de 1:2 o 1:3 para fines de subcultivo.
- Cuando el cultivo vuelva a ser confluente, repita los procedimientos antes mencionados.
NOTA: Los LEC florecen en condiciones de cultivo de alta densidad. Evite diluir excesivamente las células, ya que esto puede dificultar su crecimiento.
4. Almacenamiento y envío
NOTA: El número de celda ideal para el almacenamiento es ~ 1 × 106.
- Lave bien las células 3 veces con 1 ml de DPBS. Después del lavado, agregue 1 ml de solución de tripsina-EDTA y coloque las células en la incubadora durante 5 minutos.
- Añadir 2 mL de medio de cultivo completo y transferir la suspensión celular al tubo de centrífuga y centrifugar a 1.000 × g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células en un medio de congelación compuesto por 90% de FBS y 10% de DMSO, con el objetivo de obtener una densidad celular de 1 × 106 células/mL. Transfiera la suspensión celular a la criovial.
- Mueva inmediatamente las celdas a un ambiente de -20 °C durante 1 h, seguido de -80 °C durante la noche, antes del almacenamiento permanente en nitrógeno líquido.
NOTA: Si no se dispone de nitrógeno líquido, las celdas pueden almacenarse a -80 °C después de una hora inicial a -20 °C. - Si se requiere un envío, envíe las células en el criovial en un paquete con hielo seco para su entrega al día siguiente.
- Una vez recibidas las células, asegure una rápida recuperación y coloque las células en el subcultivo. Si el cultivo inmediato no es factible, transfiera las células a nitrógeno líquido para un almacenamiento prolongado.
NOTA: Si las celdas van a ser enviadas, asegúrese de que las muestras estén profundamente enterradas en el hielo seco para evitar posibles daños por fluctuaciones de temperatura.
5. Validación de LECs
- Coloque los LEC en placas de cultivo de 35 mm con cubreobjetos y cultívelos durante aproximadamente 48 h.
- Lavar las celdas 2 veces con PBS y fijar las celdas con metanol frío durante 10 min a -20 °C.
- Lavar las celdas fijas durante 3 x 5 min con PBS e incubar las celdas fijas con tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica.
- Después del bloqueo, incubar las células durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios (αA-cristalina, γ-cristalina y anticuerpos PROX1) diluidos individualmente en una proporción de 1:50 en tampón diluyente.
- Lavar las células durante 3 x 5 min con PBS e incubar las células con el anticuerpo secundario diluido 1:100 en tampón diluyente durante 1 h.
- Lavar las células durante 3 x 5 min con PBS y teñir las células con 5 μg/mL Hoechst 33342 en PBS durante 10 min a temperatura ambiente para visualizar los núcleos.
- Lave las células durante 2 x 5 minutos con PBS para eliminar el exceso de solución de tinción y capture imágenes fluorescentes de las células utilizando un microscopio de fluorescencia utilizando el canal DAPI para los núcleos y el canal FITC para αA-, γ-cristalinas y PROX1.
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Representative Results
Como se muestra en la Figura 2, siguiendo este protocolo, los LEC primarios de ratones C57BL/6J se adhirieron a las placas en un período de 4 h. En particular, había restos visibles de otros tejidos, como secciones de la cápsula posterior y células de fibra del cristalino. Sin embargo, estos elementos no deseados no se adherían a la placa y, por lo tanto, podían eliminarse cambiando el medio de cultivo. Posteriormente, entre el tercer y quinto día, los LECs iniciaron su fase de proliferación. Un rápido crecimiento, característico de la fase de proliferación logarítmica, pudo observarse entre el séptimo y el décimo día. En los casos en que las células no progresan a la fase de crecimiento rápido, puede ser aconsejable incorporar suplementos de crecimiento, como EpiCGS-a, en el medio de cultivo. Además, observamos que las células exhiben una tasa de crecimiento más rápida en el medio que contiene un 20% de FBS en comparación con un 10% de FBS. Una concentración de FBS más baja generalmente fomenta un crecimiento más lento, reflejando los rasgos del epitelio central de la lente, mientras que una concentración de FBS del 20% replica los atributos de la zona proliferativa de la lente.
De acuerdo con Reddy et al. y Andley et al., quienes desarrollaron la línea celular epitelial del cristalino humano inmortalizada B3, se espera que las LEC expresen varias proteínas específicas del cristalino, como αA- y γ-cristalinas 2,21. Por lo tanto, en este estudio, empleamos αA- y γ-cristalinos como marcadores celulares para validar la identidad de las células como LEC. Los LEC dentro de los tres pasajes iniciales se cultivaron en cubreobjetos de vidrio. Los anticuerpos primarios específicos de αA- y γ-cristalinas se utilizaron para incubar las células durante la noche. Como se muestra en la Figura 3, estas células exhibieron una expresión robusta de αA- y γ-cristalinas, lo que proporciona evidencia definitiva de que son células epiteliales derivadas del cristalino. Además, utilizamos PROX1 como un marcador bien establecido para que las células de fibra marquen las LEC primarias. Los datos indicaron que estas LECs mostraron tinción negativa para PROX1, lo que confirma que estas células son células epiteliales y aún no se habían diferenciado en células de fibra.
Figura 1: Flujo de trabajo paso a paso para la cultura LEC. La figura muestra los pasos secuenciales involucrados en el cultivo de células epiteliales primarias del cristalino. El paso 1 consiste en crear un pequeño desgarro en la cápsula anterior. El paso 2 consiste en retirar suavemente la cápsula de la lente. En el paso 3, la cápsula del cristalino se transfiere cuidadosamente a una placa de 24 pocillos y se incuba con una solución de tripsina al 0,05% a 37 °C durante 10 min. Después de la incubación, la cápsula del cristalino digerida se pica con tijeras de disección para promover la separación celular. El paso 4 consiste en apagar la tripsina añadiendo 0,5 ml de medio de cultivo que contiene un 20% de FBS al tubo de centrifugación y centrifugando las muestras de tejido a 1.000 × g durante 5 min. El paso 5 requiere resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo y sembrarlas en una placa de 24 pocillos. Finalmente, el paso 6 consiste en cambiar el medio de cultivo cada 2-3 días para apoyar el crecimiento y el mantenimiento celular durante todo el experimento. Abreviaturas: LECs = células epiteliales del cristalino; FBS = suero fetal bovino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Patrón de crecimiento de los LEC a lo largo del tiempo. Los cambios morfológicos de las células epiteliales primarias del cristalino en varios momentos de su crecimiento se registraron bajo un microscopio de contraste de fase. Las imágenes capturadas en los días 1, 2, 3, 5, 7 y 10 representan la evolución de la morfología celular, proporcionando información sobre el desarrollo y el comportamiento de las células epiteliales del cristalino a lo largo del tiempo. Flecha roja que indica la ubicación de las células epiteliales del cristalino que proliferan activamente. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: LECs = células epiteliales del cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación de LECs. (A) Inmunotinción de αA-cristalina en LECs de ratón. Las mLEC primarias se tiñeron con Hoechst 33342 (azul) y anticuerpo αA-cristalina (verde). (B) Inmunotinción de γ-cristalina en LEC de ratón. (C) Inmunotinción de PROX1 en LECs de ratón. Las mLEC primarias se tiñeron con Hoechst 33342 (azul) y el anticuerpo PROX1 (verde). Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: LECs = células epiteliales del cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado en este documento proporciona una guía completa, paso a paso, para el aislamiento, la cultura y la subcultura exitosos de los LEC primarios, con documentación en video que lo acompaña. La guía visual detallada junto con las instrucciones escritas mejora la claridad y accesibilidad del protocolo, promoviendo su uso y reproducibilidad entre los investigadores en el campo. El objetivo final es contribuir a la expansión del cuerpo de conocimientos en torno al papel de las LEC en la formación de cataratas y el SOP, una complicación prevalente después de la cirugía de cataratas.
Al comparar las LEC primarias con las líneas celulares epiteliales del cristalino, como HLE-B3 y SRA01/04, cada una presenta ventajas y desafíos únicos en un contexto de investigación. La línea celular HLE-B3, junto con la SRA01/04, representan una categoría de líneas celulares que, si bien son fáciles de manejar y duraderas, a menudo presentan cambios genéticos y fenotípicos debido a su replicación continua y condiciones de cultivo prolongadas. Esto puede dar lugar a diferencias significativas con respecto a la función de los LEC originales, reduciendo así la autenticidad de sus respuestas. Por el contrario, las LEC primarias, aisladas directamente del tejido vivo de pacientes o animales de investigación, reflejan con mayor precisión el entorno celular natural y las respuestas inherentes del cristalino in vivo. A pesar de la complejidad añadida de su extracción y cultivo, a menudo se prefieren en estudios que exigen una alta relevancia fisiológica, ya que ofrecen resultados más precisos y fiables.
Hay que tener en cuenta algunos puntos clave a la hora de seguir este protocolo. En estos estudios se utilizaron ratones jóvenes C57BL/6J, por lo general menores de 2 semanas de edad. Observamos que los LEC cosechados de estos ratones jóvenes demostraron un crecimiento más vigoroso en comparación con los LEC de ratones de 2 meses o más. Esto indica una correlación negativa entre la edad de los ratones y el crecimiento celular.
La disección del cristalino de un ojo de ratón es una tarea delicada, que requiere el uso cuidadoso de herramientas de disección para preservar la integridad del cristalino y su cápsula. El procedimiento descrito en la sección 1 del protocolo garantiza que la lente se extraiga con éxito con un daño mínimo. Si bien mantener la salud y la integridad de la cápsula de la lente es un desafío, no se puede subestimar su importancia, ya que cualquier daño podría afectar la calidad y la cantidad de LEC aislados. Cabe destacar que la mayoría de las divisiones celulares suelen ocurrir en la zona germinativa cerca de la región ecuatorial en el cristalino, un área de difícil acceso para el cultivo. De acuerdo con Zetterberg et al., aunque la parte central del epitelio del cristalino muestra una actividad mitótica mínima en circunstancias normales, los experimentos que utilizan el marcaje de timidina tritiada (3-H-Tdr) han marcado estas células del epitelio del cristalino posicionadas en el centro como células madre potenciales 17,22. Las células madre exhiben características distintivas, como una capacidad de proliferación ilimitada a pesar de tener una baja tasa de proliferación en condiciones estándar. Como tal, la parte central del epitelio del cristalino puede proporcionar una mejor representación de la capacidad proliferativa de las LEC que la zona germinativa.
El aislamiento de las LEC, tal y como se detalla en la sección 2 del protocolo, constituye un paso fundamental en este procedimiento experimental. Las acciones integrales, incluida la extracción de la cápsula del cristalino, la digestión enzimática y la fragmentación del tejido, se realizan cuidadosamente para separar las células epiteliales individuales de la cápsula. Uno de los elementos críticos dentro de este proceso es la duración de la digestión de la tripsina. Se recomienda que el período de digestión se establezca entre 8 y 10 min. Si este período se acorta a menos de 5 minutos, puede resultar en una separación celular incompleta. Por el contrario, la extensión excesiva de este marco de tiempo puede comprometer significativamente la viabilidad celular. La elección estratégica de emplear tripsina-EDTA como reactivo de disociación celular, junto con un medio de cultivo DMEM suplementado con FBS al 20% y gentamicina 10 μg/mL, optimiza la liberación celular y la posterior proliferación, al tiempo que mitiga los posibles riesgos de contaminación.
Los antibióticos se utilizan con frecuencia para prevenir la contaminación bacteriana durante los cultivos primarios de LEC. Sin embargo, la elección de los antibióticos debe hacerse con cuidado. Los antibióticos comúnmente utilizados, como la penicilina y la estreptomicina, así como los agentes antifúngicos, tienen el potencial de afectar la viabilidad de los LEC. Como alternativa, se recomienda emplear una solución de gentamicina a una concentración de 10 μg/mL para un crecimiento óptimo de la LEC.
Además, mantener una alta densidad celular es otro factor crucial para el éxito del cultivo primario de LEC. A diferencia de las líneas celulares establecidas, las LEC primarias necesitan una mayor densidad celular para un crecimiento óptimo. Esto se debe principalmente a su dependencia de una comunicación intercelular efectiva, facilitada por el contacto directo o la señalización paracrina, que ayuda a mantener su estado de diferenciación y función. La alta densidad celular también mitiga los efectos adversos del "choque de cultivo", una condición experimentada por las células primarias cuando se aíslan y se colocan en un ambiente in vitro significativamente diferente de su origen in vivo 23. Al imitar un entorno más parecido al in vivo, una alta densidad celular aumenta las tasas de supervivencia. Además, esta densidad ayuda a establecer un gradiente de concentración de factores de crecimiento y citoquinas que favorece el crecimiento y la función celular. Dado que muchas células primarias dependen del anclaje, lo que requiere la unión a la superficie para la proliferación, una alta densidad celular ofrece un número adecuado de células vecinas para la adhesión, promoviendo así un crecimiento saludable. En consecuencia, la regulación de la densidad celular es una consideración crucial en el cultivo de células primarias debido a su impacto significativo en la comunicación, supervivencia y proliferación celular. Se recomienda optar por placas de cultivo más pequeñas, como placas de 24 o 6 pocillos, para crear un entorno ideal para los LEC. Seguir este protocolo suele dar como resultado que las LEC alcancen un estado confluente ~10-14 días después del cultivo. Recomendamos utilizar LECs en un número bajo de pasajes, idealmente entre P0 y P6, para asegurar el comportamiento más natural en los experimentos. Más allá de 7-10 pasajes, las LEC pueden exhibir un crecimiento disminuido y pueden no reaccionar a las condiciones experimentales de la misma manera que las células en los pasajes inferiores.
La concentración sérica está directamente relacionada con la tasa de crecimiento celular. Es más probable que los niveles más bajos de FBS induzcan un crecimiento más lento, lo que se asemeja a las características del epitelio central. Por el contrario, los niveles más altos de FBS imitan las condiciones de la zona proliferativa. Si el crecimiento celular es lento, como puede ocurrir cuando es necesario aislar LEC de animales mayores o modificados genéticamente, puede ser beneficioso aumentar la FBS al 20% o agregar un suplemento de crecimiento como EpiCGS-a (5 mL, ver Tabla de Materiales) al medio de cultivo. Este enriquecimiento de suero y suplemento puede mejorar la proliferación celular y promover el crecimiento óptimo de las células epiteliales.
El protocolo de almacenamiento y envío (sección 5 del protocolo) considera los desafíos asociados con la preservación y el transporte de células vivas. La elección del medio de congelación es fundamental para la supervivencia de los LEC durante el almacenamiento y el transporte. Hemos experimentado con diferentes medios de congelación, incluyendo un 70% de medio de cultivo completo + 20% de FBS + 10% de DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; y medio de congelación libre de DMSO y suero. La evidencia de nuestros experimentos sugiere que una solución que comprende un 10% de DMSO y un 90% de FBS exhibe un rendimiento superior en la preservación de la viabilidad celular. Utilizando esta formulación específica, hemos mantenido con éxito LEC primarios almacenados a -80 °C durante períodos superiores a 10 años, lo que demuestra la solidez de este enfoque y su capacidad para facilitar la reactivación celular después del almacenamiento.
La αA-cristalina y la γ-cristalina se utilizaron como marcadores de LECs. PROX1 se utilizó como marcador para las células de fibra del cristalino. También se pueden emplear marcadores adicionales como PAX6, FOXE3 y E-cadherina para caracterizar el fenotipo LEC. Si los investigadores están interesados en explorar la EMT, se debe utilizar la αSMA como marcador. Es esencial ajustar los tiempos de incubación y las diluciones de acuerdo con los requisitos específicos del experimento y las recomendaciones proporcionadas para los respectivos anticuerpos utilizados.
Si bien este estudio presenta una metodología robusta para el cultivo de LEC primarios, es importante reconocer sus limitaciones. Si bien las células aisladas inicialmente son LEC primarias, cualquier procedimiento de subcultivo, tripsinización y reanimación conducirá a alteraciones en su estado. El protocolo que hemos diseñado emplea principalmente lentes de ratón como fuente de LEC; sin embargo, las LEC también pueden cultivarse a partir de otros recursos, incluyendo muestras de pacientes con cataratas, ojos de banco de ojos o pacientes con diferentes enfermedades oculares como glaucoma y retinopatía diabética17,24. Es posible que las LEC extraídas de personas mayores o con afecciones oculares específicas no cumplan con el protocolo con la misma eficacia que las células de contrapartes más jóvenes y sanas. El cultivo de LEC de individuos o animales mayores o modificados genéticamente puede requerir la optimización del medio de cultivo, potencialmente aumentando el FBS al 20% o incorporando factores de crecimiento adicionales. Además, estudios previos de Menko et al., realizados en cultivos primarios de células epiteliales embrionarias de cristalino de pollo, demostraron la diferenciación espontánea que se produce después del segundo día de cultivo25. Por lo tanto, los investigadores deben tener cuidado y considerar las diferencias en las metodologías, especialmente si el estudio de la diferenciación es su principal objetivo de investigación.
Se pueden utilizar varios métodos para cultivar LEC primarios. Por ejemplo, los métodos desarrollados por Ibaraki et al., Sundelin et al., y Andjelic et al., implican el cultivo de LECs primarios directamente en la placa de Petri utilizando la porción anterior de la cápsula del cristalino recolectada durante la cirugía de cataratas 16,17,19,20. Este enfoque mantiene los contactos naturales de célula a célula y la matriz extracelular, lo que proporciona una alta relevancia fisiológica crucial para afecciones como la OCP. Por otra parte, el método de explante del cristalino, como el descrito por Zelenka et al., preserva la arquitectura del tejido nativo, lo que permite realizar estudios más relevantes desde el punto de vista fisiológico, especialmente beneficiosos para explorar la diferenciación terminal de las LEC, las interacciones celulares y los procesos de desarrollo del cristalino, lo que garantiza una comprensión detallada de los eventos celulares y moleculares secuenciales durante la diferenciación26.
Por el contrario, el método de tripsinización descrito en este protocolo produce una suspensión unicelular uniforme, lo que simplifica la siembra uniforme y el recuento celular preciso, lo que es ventajoso para ciertos experimentos, como los ensayos de viabilidad y proliferación celular, el cribado de fármacos y el análisis de la vía de señalización celular. Sin embargo, es fundamental reconocer que, si bien este método facilita estudios controlados y precisos debido a su población celular uniforme, puede alterar el comportamiento celular y comprometer la relevancia fisiológica observada en los métodos de explante y cultivo directo debido al procesamiento enzimático. Para los investigadores centrados exclusivamente en el estudio de las células epiteliales, este método resulta muy aplicable y conveniente, ya que ofrece información fiable sobre las características y el comportamiento de estas células. Sin embargo, para aquellos cuyas investigaciones científicas se extienden a la diferenciación celular, se hace imprescindible contemplar métodos alternativos como las técnicas de explante, o adaptar y optimizar el actual para abarcar estos aspectos.
En general, este protocolo está diseñado teniendo en cuenta cuidadosamente las necesidades y requisitos específicos de los LEC. Cada paso, desde la disección hasta la validación, se elabora cuidadosamente para mantener la viabilidad y la funcionalidad de las células. Como resultado, puede ser una guía valiosa para los investigadores que estudian las LEC y su papel en la fisiología y patología ocular. Los estudios futuros pueden adaptar y modificar este protocolo para explorar diferentes aspectos de la biología de la LEC, proporcionando una plataforma para nuevos avances en la comprensión de las enfermedades relacionadas con el cristalino y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la prevención de cataratas y SOP.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Departamento de Defensa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green y Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
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