Summary
Ce manuscrit décrit un protocole vidéo détaillé pour la culture de cellules épithéliales primaires du cristallin (LEC), visant à améliorer la reproductibilité et à faciliter la recherche sur la cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (PCO). Il offre des instructions étape par étape sur la dissection du cristallin, l’isolation et la validation des LEC, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux arrivants dans le domaine.
Abstract
Les cellules épithéliales du cristallin (LEC) jouent de multiples rôles importants dans le maintien de l’homéostasie et de la fonction normale du cristallin. Les LEC déterminent la croissance, le développement, la taille et la transparence des lentilles. À l’inverse, un CLE dysfonctionnel peut entraîner la formation de cataracte et l’opacification de la capsule postérieure (OCP). Par conséquent, la mise en place d’un système de culture primaire LEC robuste est importante pour les chercheurs engagés dans le développement de lentilles, la biochimie, les traitements de la cataracte et la prévention du SOPK. Cependant, la culture des LEC primaires a longtemps présenté des défis en raison de leur disponibilité limitée, de leur faible taux de prolifération et de leur nature délicate.
Cette étude aborde ces obstacles en présentant un protocole complet pour la culture primaire des LEC. Le protocole comprend des étapes essentielles telles que la formulation d’un milieu de culture optimisé, l’isolement précis des capsules de lentilles, les techniques de trypsinisation, les procédures de sous-culture, les protocoles de récolte et les directives pour le stockage et l’expédition. Tout au long du processus de culture, la morphologie cellulaire a été surveillée à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
Pour confirmer l’authenticité des LEC en culture, des tests d’immunofluorescence ont été effectués pour détecter la présence et la distribution subcellulaire de protéines critiques du cristallin, à savoir les αA- et γ-cristallins. Ce protocole détaillé fournit aux chercheurs une ressource précieuse pour cultiver et caractériser les LEC primaires, permettant des progrès dans notre compréhension de la biologie du cristallin et le développement de stratégies thérapeutiques pour les troubles liés au cristallin.
Introduction
Le cristallin de l’œil joue un rôle crucial dans la vision en concentrant la lumière entrante sur la rétine. Il s’agit d’une structure avasculaire transparente composée de cellules spécialisées, parmi lesquelles les cellules épithéliales du cristallin (LEC) sont des acteurs clés. Les LEC sont situés sur la surface antérieure du cristallin et sont responsables du maintien de sa transparence, de la régulation de l’équilibre hydrique et de la participation à la croissance et au développement du cristallin 1,2. Les LEC sont un type unique de cellules situées dans la partie antérieure du cristallin, jouant un rôle essentiel dans le maintien de la clarté et de la fonction du cristallin en produisant continuellement des fibres du cristallin tout au long de la vie.
La cataracte se caractérise par l’opacification progressive du cristallin, entraînant la distorsion et la diffusion de la lumière, ce qui compromet la vision 3,4. Les mécanismes précis sous-jacents à la formation de la cataracte sont complexes et multifactoriels, impliquant divers processus cellulaires et moléculaires tels que les rayons UV, les dommages oxydatifs et la glycation 5,6. Il a été constaté que les LEC contribuent de manière significative au développement de la cataracte, ce qui en fait un axe essentiel de recherche 1,2,7,8,9.
De plus, l’un des problèmes les plus urgents en ophtalmologie aujourd’hui est l’incidence relativement élevée de l’opacification de la capsule postérieure (OCP), également connue sous le nom de cataracte secondaire. Le SOPK reste la complication la plus fréquente après une chirurgie de la cataracte, touchant jusqu’à 20 à 40 % des patients adultes et 100 % des enfants dans les 5 ans suivant la chirurgie10. L’OCP est principalement causée par les LEC résiduels qui restent dans le sac capsulaire après l’extraction de la cataracte. Ces cellules subissent une transformation physiopathologique à multiples facettes impliquant non seulement la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), mais aussi la différenciation des LEC en fibres du cristallin, ce qui donne une population cellulaire qui est un mélange de LEC, de fibres et de myofibroblastes 11,12,13. Les cellules transformées prolifèrent et migrent à travers la capsule postérieure du cristallin, entraînant une déficience visuelle. Comprendre le comportement et les mécanismes de contrôle des LEC dans les modèles de culture peut fournir des informations précieuses sur la prévention et la gestion du PCO. Par conséquent, ce protocole de culture des LEC constitue un outil essentiel pour les chercheurs en ophtalmologie visant à étudier, comprendre et, en fin de compte, combattre cette complication postopératoire répandue.
Pour démêler les subtilités de la biologie du LEC et son rôle dans la formation de la cataracte et du PCO, il est essentiel d’établir des systèmes de culture cellulaire primaire in vitro robustes et reproductibles. La culture primaire de LEC fournit aux chercheurs un environnement contrôlé pour étudier les fonctions, la signalisation et les caractéristiques moléculaires des LEC. En outre, il permet d’étudier les processus cellulaires et les effets de différentes conditions expérimentales, fournissant des informations précieuses sur la physiologie et la pathologie du cristallin.
Des recherches antérieures ont enrichi notre compréhension des techniques de culture LEC 14,15,16,17,18,19,20. Bien que ces études aient utilisé diverses méthodologies et donné des résultats significatifs sur le comportement et les caractéristiques des LEC, il n’existe pas de protocole d’enregistrement vidéo complet et accessible pour la culture des LEC dans la littérature actuelle. Cette limitation peut entraver la capacité des chercheurs novices à reproduire fidèlement les techniques et peut entraîner des incohérences et des variations dans les résultats expérimentaux. En fournissant un protocole d’enregistrement vidéo, ce document de recherche vise à combler cette lacune et à fournir une ressource standardisée qui peut améliorer la reproductibilité et faciliter le transfert de connaissances dans le domaine de la culture LEC.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. L’approbation procédurale a été accordée par le comité de protection et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Nord du Texas (numéro de protocole : IACUC-2022-0008). De jeunes souris C57BL/6J, généralement âgées de moins de 2 semaines, ont été utilisées dans ces études.
1. Préparation du milieu de culture et dissection du cristallin
- Préparer le milieu de culture en ajoutant 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,1 mL de gentamicine à 50 mg/mL à 450 mL de DMEM.
- Euthanasier sans cruauté les souris C57BL/6J de moins de 2 semaines.
REMARQUE : Nous avons euthanasié en utilisant la méthode d’inhalation de CO2 . Un débit optimal pour les systèmes d’euthanasie au CO2 doit déplacer 30 % à 70 % du volume de la chambre ou de la cage/min. - Retirez délicatement les paupières à l’aide de ciseaux chirurgicaux et appliquez une pression délicate avec une pince à épiler incurvée sur les côtés opposés de l’orbite, ce qui fait saillir l’œil vers l’extérieur. Faites une incision soigneuse sur la cornée à l’aide du couteau à cataracte et extrayez soigneusement le cristallin à l’aide d’une pince à épiler incurvée, en veillant à ce que le cristallin ou sa capsule ne soit pas endommagé.
REMARQUE : Soyez prudent lors de l’exécution de ces étapes pour maintenir l’intégrité de la capsule de lentille. En raison de la nature délicate de l’objectif, il est important d’utiliser des outils de dissection avec des pointes incurvées et émoussées pour minimiser le risque d’endommager l’objectif. - Utiliser une pince à épiler incurvée à pointe émoussée pour transférer les lentilles dans une boîte de culture tissulaire en plastique de 60 mm remplie de 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) préchauffée et stérile contenant 10 μg/mL de gentamicine.
- Rincer délicatement les lentilles avec une solution DPBS contenant 10 μg/mL de gentamicine pour éliminer tout débris ou contaminant potentiel, préparer les lentilles pour un traitement ultérieur et maintenir un environnement de culture stérile.
- Pour obtenir un nombre suffisant de LEC, mettez en commun quatre lentilles pour une plaque de culture à 24 puits et six lentilles pour une plaque de culture à 6 puits.
2. Isolement des ESL
- Une fois le processus de rinçage terminé, placez l’objectif sur un morceau de papier filtre, en le laissant sécher.
- Une fois que la lentille est suffisamment sèche, transférez-la soigneusement sur le couvercle d’une boîte de Pétri en vue du retrait de la capsule de la lentille.
- Faites pivoter la lentille vers le haut, en vous assurant que le segment antérieur est orienté vers le haut. Lorsque vous utilisez la pince à épiler pour tenir la capsule antérieure, utilisez la pince capsulorhexis dans la main dominante pour créer une petite déchirure dans la capsule. Tirez doucement les deux outils dans des directions opposées pour retirer la capsule et placez-la dans DPBS jusqu’à ce que toutes les dissections de l’objectif soient terminées.
REMARQUE : Pour éviter toute divergence, les chercheurs doivent disséquer rapidement chaque capsule épithéliale du cristallin et les stocker temporairement dans le DPBS. Ce n’est qu’après avoir terminé toutes les dissections que les capsules sont transférées collectivement à la trypsine maintenues à 37 °C, assurant une exposition synchronisée et uniforme. - Transférez délicatement la capsule de lentille sur une plaque à 6 puits. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,05 % dans chaque puits pour amorcer le processus de digestion enzymatique.
- Agitez doucement la solution de trypsine pour assurer une perméation uniforme. Placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et laisser la capsule être digérée pendant 8 à 10 minutes à 37 °C.
REMARQUE : Cette étape facilite la dégradation du tissu de la capsule du cristallin et la libération ultérieure des cellules épithéliales individuelles. - Après l’incubation, hachez soigneusement la capsule de lentille digérée à l’aide de ciseaux à dissection pour décomposer les amas de tissus restants et favoriser la séparation cellulaire.
REMARQUE : La minutie du hachage des tissus est mise en avant pour assurer une libération efficace des cellules des capsules de lentilles digérées. - Ajouter 0,5 mL du milieu de culture contenant 10 % de FBS pour éteindre la trypsine. Transférer les échantillons de tissus dans un tube de centrifugation et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Utilisez 1 mL de milieu de culture pour remettre les cellules en suspension et ensemencer les cellules dans une plaque à 24 puits.
- Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours.
3. Sous-culture des LEC
- Une fois que les cellules ont atteint la confluence, retirez le milieu de la boîte de culture. Procéder au lavage des cellules 2x avec 1 mL de DPBS.
- Ajouter 200 μL de solution trypsine-EDTA et placer les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
- Après l’incubation, retirez les cellules de l’incubateur et inspectez-les au microscope pour confirmer qu’elles se sont détachées de la boîte de culture et ont commencé à flotter.
- Ajouter 1 mL de milieu de culture et pipeter doucement les cellules 3 à 5 fois pour détacher toutes les cellules.
- Transférer les cellules dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
- Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de croissance complet.
- Si nécessaire, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Subdiviser la suspension cellulaire dans un rapport de 1:2 ou 1:3 à des fins de sous-culture.
- Lorsque la culture redevient confluente, répétez les procédures susmentionnées.
REMARQUE : Les LEC s’épanouissent dans des conditions de culture à haute densité. Évitez de diluer excessivement les cellules, car cela pourrait entraver leur croissance.
4. Stockage et expédition
REMARQUE : Le numéro de cellule idéal pour le stockage est ~1 × 106.
- Lavez soigneusement les cellules 3x avec 1 mL de DPBS. Après le lavage, ajouter 1 mL de solution trypsine-EDTA et placer les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
- Ajouter 2 mL de milieu de culture complet et transférer la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu de congélation composé de 90 % de FBS et de 10 % de DMSO, en visant une densité cellulaire de 1 × 106 cellules/mL. Transférer la suspension cellulaire dans le cryoflacon.
- Déplacer immédiatement les cellules dans un environnement à -20 °C pendant 1 h, puis à -80 °C pendant la nuit, avant de les stocker définitivement dans de l’azote liquide.
REMARQUE : Si l’azote liquide n’est pas disponible, les cellules peuvent être stockées à -80 °C après une heure initiale à -20 °C. - Si un envoi est nécessaire, expédiez les cellules dans le cryoflacon dans un colis avec de la glace carbonique pour une livraison le lendemain.
- À la réception des cellules, assurez-vous d’une récupération rapide et placez les cellules dans la sous-culture. Si la culture immédiate n’est pas possible, transférez les cellules dans de l’azote liquide pour un stockage prolongé.
REMARQUE : Si les cellules doivent être expédiées, assurez-vous que les échantillons sont profondément enfouis dans la glace sèche pour éviter les dommages potentiels causés par les fluctuations de température.
5. Validation des ESL
- Placer les LEC dans des boîtes de culture de 35 mm avec des verres de couverture et les cultiver pendant environ 48 h.
- Laver les cellules 2x avec du PBS et fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 10 min à -20 °C.
- Laver les cellules fixes pendant 3 x 5 min avec du PBS et incuber les cellules fixes avec un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique.
- Après le blocage, incuber les cellules pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires (αA-cristallin, γ-cristallin et anticorps PROX1) dilués individuellement dans un rapport de 1:50 dans un tampon diluant.
- Laver les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS et incuber les cellules avec l’anticorps secondaire dilué 1:100 dans un tampon de diluant pendant 1 h.
- Laver les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 5 μg/mL Hoechst 33342 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante pour visualiser les noyaux.
- Lavez les cellules pendant 2 x 5 minutes avec du PBS pour éliminer l’excès de solution de coloration et capturez des images fluorescentes des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence utilisant le canal DAPI pour les noyaux et le canal FITC pour les αA-, γ-cristallins et PROX1.
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Representative Results
Comme le montre la figure 2, en suivant ce protocole, les LEC primaires des souris C57BL/6J ont adhéré aux antennes dans un délai de 4 h. Notamment, il y avait des restes visibles d’autres tissus tels que des sections de la capsule postérieure et des cellules de fibre du cristallin. Cependant, ces éléments non intentionnels ne se fixaient pas à la boîte et pouvaient donc être supprimés en changeant le milieu de culture. Par la suite, entre le troisième et le cinquième jour, les LEC ont entamé leur phase de prolifération. Une croissance rapide, caractéristique de la phase de prolifération logarithmique, a alors pu être observée entre le septième et le dixième jour. Dans les cas où les cellules ne progressent pas vers la phase de croissance rapide, il peut être conseillé d’incorporer des suppléments de croissance, tels que EpiCGS-a, dans le milieu de culture. De plus, nous avons observé que les cellules présentent un taux de croissance plus rapide dans le milieu contenant 20 % de FBS par rapport à 10 % de FBS. Une concentration de FBS plus faible favorise généralement une croissance plus lente, reflétant les caractéristiques de l’épithélium central du cristallin, tandis qu’une concentration de FBS de 20 % reproduit les attributs de la zone proliférative du cristallin.
Selon Reddy et al. et Andley et al., qui ont développé la lignée cellulaire épithéliale du cristallin humain immortalisée B3, on s’attend à ce que les LEC expriment diverses protéines spécifiques du cristallin telles que les αA- et γ-cristallins 2,21. Par conséquent, dans cette étude, nous avons utilisé des αA- et γ-cristallins comme marqueurs cellulaires pour valider l’identité des cellules en tant que LEC. Les LEC dans les trois premiers passages ont été cultivés sur des lamelles de verre. Les anticorps primaires spécifiques aux αA- et γ-cristallins ont été utilisés pour incuber les cellules pendant la nuit. Comme le montre la figure 3, ces cellules ont montré une expression robuste des αA- et γ-cristallins, fournissant une preuve définitive qu’il s’agit de cellules épithéliales dérivées du cristallin. De plus, nous avons utilisé PROX1 comme marqueur bien établi pour les cellules à fibres pour marquer les LEC primaires. Les données ont indiqué que ces LEC présentaient une coloration négative pour PROX1, confirmant que ces cellules sont des cellules épithéliales et n’avaient pas encore subi de différenciation en cellules fibreuses.
Figure 1 : Flux de travail étape par étape pour la culture LEC. La figure représente les étapes séquentielles impliquées dans la culture des cellules épithéliales primaires du cristallin. L’étape 1 consiste à créer une petite déchirure dans la capsule antérieure. L’étape 2 consiste à retirer délicatement la capsule de la lentille. À l’étape 3, la capsule de lentille est soigneusement transférée dans une plaque à 24 puits et incubée avec une solution de trypsine à 0,05 % à 37 °C pendant 10 min. Après l’incubation, la capsule de lentille digérée est hachée à l’aide de ciseaux de dissection pour favoriser la séparation cellulaire. L’étape 4 consiste à tremper la trypsine en ajoutant 0,5 mL de milieu de culture contenant 20 % de FBS dans le tube de centrifugation et en centrifugeant les échantillons de tissus à 1 000 × g pendant 5 min. L’étape 5 consiste à remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture et à les ensemencer dans une plaque de 24 puits. Enfin, l’étape 6 consiste à changer le milieu de culture tous les 2 à 3 jours pour soutenir la croissance et le maintien des cellules tout au long de l’expérience. Abréviations : LEC = cellules épithéliales du cristallin ; FBS = sérum fœtal bovin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Profil de croissance des ESL au fil du temps. Les changements morphologiques des cellules épithéliales primaires du cristallin à différents moments de leur croissance ont été enregistrés au microscope à contraste de phase. Les images capturées aux jours 1, 2, 3, 5, 7 et 10 illustrent l’évolution de la morphologie cellulaire, donnant un aperçu du développement et du comportement des cellules épithéliales du cristallin au fil du temps. Flèche rouge indiquant l’emplacement des cellules épithéliales du cristallin qui prolifèrent activement. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : LEC = cellules épithéliales du cristallin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Validation des LEC. (A) Immunomarquage de l’αA-cristalline dans les LEC de souris. Les mLEC primaires ont été colorées avec Hoechst 33342 (bleu) et l’anticorps αA-cristallin (vert). (B) Immunomarquage de la γ-cristalline dans les LEC de souris. (C) Immunomarquage de PROX1 dans les LEC de souris. Les mLEC primaires ont été colorées avec l’anticorps Hoechst 33342 (bleu) et PROX1 (vert). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : LEC = cellules épithéliales du cristallin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté dans ce document fournit un guide complet, étape par étape, pour réussir l’isolement, la culture et la sous-culture des ESL primaires, accompagné d’une documentation vidéo. Le guide visuel détaillé ainsi que les instructions écrites améliorent la clarté et l’accessibilité du protocole, favorisant son utilisation et sa reproductibilité auprès des chercheurs dans le domaine. L’objectif ultime est de contribuer à l’ensemble croissant des connaissances entourant le rôle des LEC dans la formation de la cataracte et le PCO, une complication répandue après une chirurgie de la cataracte.
Lorsque l’on compare les LEC primaires avec les lignées cellulaires épithéliales du cristallin, telles que HLE-B3 et SRA01/04, chacune présente des avantages et des défis uniques dans un contexte de recherche. La lignée cellulaire HLE-B3, ainsi que la lignée SRA01/04, représentent une catégorie de lignées cellulaires qui, tout en étant faciles à manipuler et durables, présentent souvent des changements génétiques et phénotypiques en raison de leur réplication continue et de leurs conditions de culture prolongées. Cela peut entraîner des différences importantes par rapport à la fonction des ESL d’origine, réduisant ainsi l’authenticité de leurs réponses. À l’inverse, les LEC primaires, directement isolées des tissus vivants de patients ou d’animaux de recherche, reflètent plus fidèlement l’environnement cellulaire naturel et les réponses inhérentes du cristallin in vivo. Malgré la complexité supplémentaire de leur extraction et de leur culture, ils sont souvent préférés dans les études exigeant une grande pertinence physiologique, car ils fournissent des résultats plus précis et plus fiables.
Certains points clés doivent être pris en compte lors du respect de ce protocole. De jeunes souris C57BL/6J, généralement âgées de moins de 2 semaines, ont été utilisées dans ces études. Nous avons observé que les LEC récoltées sur ces jeunes souris présentaient une croissance plus vigoureuse que les LEC sur des souris âgées de 2 mois ou plus. Cela indique une corrélation négative entre l’âge des souris et la croissance cellulaire.
La dissection du cristallin à partir d’un œil de souris est une tâche délicate, nécessitant l’utilisation prudente d’outils de dissection pour préserver l’intégrité du cristallin et de sa capsule. La procédure décrite dans la section 1 du protocole garantit que le cristallin est extrait avec succès avec un minimum de dommages. Bien que le maintien de la santé et de l’intégrité de la capsule de lentille soit un défi, son importance ne peut être sous-estimée car tout dommage pourrait avoir un impact sur la qualité et la quantité de LEC isolés. Il convient de noter que la majorité des divisions cellulaires se produisent généralement dans la zone germinative près de la région équatoriale du cristallin, une zone difficilement accessible pour la culture. Selon Zetterberg et al., bien que la partie centrale de l’épithélium du cristallin présente une activité mitotique minimale dans des circonstances normales, des expériences utilisant le marquage à la thymidine tritiée (3H-Tdr) ont marqué ces cellules de l’épithélium du cristallin positionnées au centre comme des cellules souches potentielles17,22. Les cellules souches présentent des caractéristiques distinctes, telles qu’une capacité de prolifération illimitée malgré un faible taux de prolifération dans des conditions standard. Ainsi, la partie centrale de l’épithélium du cristallin peut fournir une meilleure représentation de la capacité proliférative des LEC que la zone germinative.
L’isolement des ESL, tel que détaillé dans la section 2 du protocole, constitue une étape cruciale de cette procédure expérimentale. Des actions intégrales, y compris le retrait de la capsule du cristallin, la digestion enzymatique et la fragmentation des tissus, sont soigneusement effectuées pour séparer les cellules épithéliales individuelles de la capsule. L’un des éléments critiques de ce processus est la durée de la digestion de la trypsine. Il est recommandé de régler la période de digestion entre 8 et 10 min. Si cette période est raccourcie à moins de 5 minutes, cela peut entraîner une séparation incomplète des cellules. À l’inverse, une prolongation excessive de ce délai peut compromettre considérablement la viabilité cellulaire. Le choix stratégique d’utiliser la trypsine-EDTA comme réactif de dissociation cellulaire, en conjonction avec un milieu de culture DMEM complété par 20 % de FBS et 10 μg/mL de gentamicine, optimise la libération cellulaire et la prolifération ultérieure tout en atténuant les risques potentiels de contamination.
Les antibiotiques sont fréquemment utilisés pour prévenir la contamination bactérienne lors des cultures primaires de LEC. Cependant, le choix des antibiotiques doit être fait avec soin. Les antibiotiques couramment utilisés tels que la pénicilline et la streptomycine, ainsi que les agents antifongiques, peuvent avoir un impact sur la viabilité des LEC. Comme alternative, il est recommandé d’utiliser une solution de gentamicine à une concentration de 10 μg/mL pour une croissance optimale de la LEC.
De plus, le maintien d’une densité cellulaire élevée est un autre facteur crucial pour une culture primaire réussie de LEC. Contrairement aux lignées cellulaires établies, les LEC primaires ont besoin d’une densité cellulaire plus élevée pour une croissance optimale. Cela est principalement dû à leur dépendance à une communication intercellulaire efficace, facilitée par contact direct ou par signalisation paracrine, qui aide à maintenir leur statut et leur fonction de différenciation. Une densité cellulaire élevée atténue également les effets néfastes du « choc de culture », une condition subie par les cellules primaires lorsqu’elles sont isolées et placées dans un environnement in vitro significativement différent de leur origine in vivo 23. En imitant un environnement plus proche de celui d’in vivo, une densité cellulaire élevée augmente les taux de survie. De plus, cette densité aide à établir un gradient de concentration de facteurs de croissance et de cytokines qui soutient la croissance et la fonction cellulaires. Étant donné que de nombreuses cellules primaires dépendent de l’ancrage, nécessitant une fixation de surface pour la prolifération, une densité cellulaire élevée offre un nombre adéquat de cellules voisines pour l’adhésion, favorisant ainsi une croissance saine. Par conséquent, la régulation de la densité cellulaire est une considération cruciale dans la culture des cellules primaires en raison de son impact significatif sur la communication, la survie et la prolifération cellulaires. Il est recommandé d’opter pour des plats de culture plus petits, tels que des plaques à 24 ou 6 puits, pour créer un environnement idéal pour les LEC. En suivant ce protocole, les LEC atteignent généralement un état confluent ~10-14 jours après la culture. Nous recommandons d’utiliser les LEC à un faible nombre de passages, idéalement entre P0 et P6, pour assurer le comportement le plus naturel dans les expériences. Au-delà de 7 à 10 passages, les LEC peuvent présenter une croissance réduite et ne pas réagir aux conditions expérimentales de la même manière que les cellules des passages inférieurs.
La concentration sérique est directement liée au taux de croissance cellulaire. Des niveaux plus faibles de FBS sont plus susceptibles d’induire une croissance plus lente, ressemblant aux caractéristiques de l’épithélium central. En revanche, des niveaux plus élevés de FBS imitent les conditions de la zone proliférative. Si la croissance cellulaire est lente, comme cela peut se produire lorsque les LEC doivent être isolés d’animaux plus âgés ou génétiquement modifiés, il peut être avantageux d’augmenter le FBS à 20 % ou d’ajouter un supplément de croissance comme EpiCGS-a (5 mL, voir le tableau des matériaux) au milieu de culture. Cet enrichissement en sérum et en supplément peut améliorer la prolifération cellulaire et favoriser la croissance optimale des cellules épithéliales.
Le protocole de stockage et d’expédition (section 5 du protocole) tient compte des défis associés à la conservation et au transport des cellules vivantes. Le choix du milieu de congélation est essentiel à la survie des ESL pendant l’entreposage et le transport. Nous avons expérimenté différents milieux de congélation, dont 70 % de milieu de culture complet + 20 % de FBS + 10 % de DMSO ; 90 % FBS + 10 % DMSO ; et milieu de congélation sans DMSO ni sérum. Les résultats de nos expériences suggèrent qu’une solution comprenant 10 % de DMSO et 90 % de FBS présente des performances supérieures dans la préservation de la viabilité cellulaire. En utilisant cette formulation spécifique, nous avons réussi à maintenir les LEC primaires en stockage à -80 °C pendant des durées supérieures à 10 ans, démontrant la robustesse de cette approche et sa capacité à faciliter la renaissance des cellules après le stockage.
L’αA-cristalline et la γ-cristalline ont été utilisées comme marqueurs pour les LEC. PROX1 a été utilisé comme marqueur pour les cellules de fibre de lentille. D’autres marqueurs tels que PAX6, FOXE3 et E-cadhérine peuvent également être utilisés pour caractériser le phénotype LEC. Si les chercheurs souhaitent explorer l’EMT, l’αSMA devrait être utilisé comme marqueur. Il est essentiel d’ajuster les temps d’incubation et les dilutions en fonction des exigences spécifiques de l’expérience et des recommandations fournies pour les anticorps respectifs utilisés.
Bien que cette étude présente une méthodologie robuste pour la culture des ESL primaires, il est important de reconnaître ses limites. Bien que les cellules isolées initialement soient des LEC primaires, toute procédure de sous-culture, de trypsinisation et de réanimation entraînera des altérations de leur statut. Le protocole que nous avons conçu utilise principalement la lentille de la souris comme source des LEC ; cependant, les LEC peuvent également être cultivées à partir d’autres ressources, notamment des échantillons de patients atteints de cataracte, des yeux de banque d’yeux ou des patients atteints de différentes maladies oculaires, notamment le glaucome et la rétinopathie diabétique17,24. Les LEC prélevés sur des personnes âgées ou souffrant de maladies oculaires spécifiques peuvent ne pas se conformer au protocole aussi efficacement que les cellules de leurs homologues plus jeunes et en meilleure santé. L’élevage de LEC à partir d’individus ou d’animaux plus âgés ou génétiquement modifiés peut nécessiter une optimisation du milieu de culture, éventuellement en augmentant le FBS à 20 % ou en incorporant des facteurs de croissance supplémentaires. De plus, des études antérieures menées par Menko et al., sur des cultures primaires de cellules épithéliales embryonnaires du cristallin de poulet, ont démontré une différenciation spontanée survenant après le deuxième jour de culture25. Par conséquent, les chercheurs doivent faire preuve de prudence et tenir compte des différences entre les méthodologies, surtout si l’étude de la différenciation est leur principal objectif de recherche.
Diverses méthodes peuvent être utilisées pour cultiver les LEC primaires. Par exemple, les méthodes développées par Ibaraki et al., Sundelin et al., et Andjelic et al., impliquent la culture de LEC primaires directement sur la boîte de Pétri en utilisant la partie antérieure de la capsule du cristallin prélevée lors d’une chirurgie de la cataracte 16,17,19,20. Cette approche maintient les contacts naturels de cellule à cellule et la matrice extracellulaire, offrant une grande pertinence physiologique cruciale pour des conditions telles que le PCO. Alternativement, la méthode d’explant du cristallin, telle que décrite par Zelenka et al., préserve l’architecture des tissus natifs, permettant des études plus pertinentes sur le plan physiologique, particulièrement utiles pour explorer la différenciation terminale des LEC, les interactions cellulaires et les processus de développement du cristallin, permettant une compréhension détaillée des événements cellulaires et moléculaires séquentiels au cours de la différenciation26.
En revanche, la méthode de trypsinisation décrite dans ce protocole produit une suspension unicellulaire uniforme, simplifiant l’ensemencement uniforme et le comptage précis des cellules, ce qui est avantageux pour certaines expériences telles que les tests de viabilité cellulaire et de prolifération, le criblage de médicaments et l’analyse des voies de signalisation cellulaire. Cependant, il est essentiel de reconnaître que si cette méthode facilite les études contrôlées et précises en raison de sa population cellulaire uniforme, elle peut modifier le comportement cellulaire et compromettre la pertinence physiologique observée dans les méthodes d’explant et de culture directe en raison du traitement enzymatique. Pour les chercheurs qui se concentrent exclusivement sur l’étude des cellules épithéliales, cette méthode s’avère très applicable et pratique, offrant des informations fiables sur les caractéristiques et les comportements de ces cellules. Cependant, pour ceux dont les recherches scientifiques s’étendent à la différenciation cellulaire, il devient essentiel d’envisager des méthodes alternatives telles que les techniques d’explantation, ou d’adapter et d’optimiser la méthode actuelle pour englober ces aspects.
Dans l’ensemble, ce protocole est conçu en tenant compte des besoins et des exigences spécifiques des ESL. Chaque étape, de la dissection à la validation, est soigneusement conçue pour maintenir la viabilité et la fonctionnalité des cellules. Par conséquent, il peut être un guide précieux pour les chercheurs qui étudient les LEC et leur rôle dans la physiologie et la pathologie oculaires. Des études futures peuvent adapter et modifier ce protocole pour explorer différents aspects de la biologie du LEC, fournissant une plate-forme pour de nouvelles avancées dans la compréhension des maladies liées au cristallin et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prévention de la cataracte et du SOPK.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NEI R21EY033941 (à Hongli Wu) ; le ministère de la Défense W81XWH2010896 (à Hongli Wu) ; R15GM123463-02 (à Kayla Green et Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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