ऑप्टिकल समाशोधन और बड़े पैमाने पर मानव मस्तिष्क इमेजिंग में प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लेबलिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल तेजी से और एक साथ ऑप्टिकल समाशोधन, म्यूटी-राउंड लेबलिंग, और पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क वर्गों के दसियों के 3 डी वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण के लिए एक कदम-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है (एस– एच2ओ2 – एंटीजन आरएट्रीवल – 2,2′-थियोडायथेनॉल [टीडीई]) एक नियमित रूप से उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल में प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ लघु ऊतक परिवर्तन तकनीक।
Abstract
पिछले दशक में उभरी कई समाशोधन तकनीकों के बावजूद, पोस्टमॉर्टम मानव दिमाग को संसाधित करना इसके आयामों और जटिलता के कारण एक चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है, जो माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन के साथ इमेजिंग को विशेष रूप से कठिन बनाते हैं। यह पत्र एक साथ लघु (एस– एच2ओ2 – एंटीजन आरएट्रीवल – 2,2′-थियोडायथेनॉल [टीडीई]) ऊतक परिवर्तन प्रोटोकॉल के साथ दसियों वर्गों को संसाधित करके मानव मस्तिष्क के वॉल्यूमेट्रिक भागों के पुनर्निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के साथ नमूनों के समाशोधन, लेबलिंग और अनुक्रमिक इमेजिंग को सक्षम बनाता है। शॉर्ट कई न्यूरोनल मार्करों के साथ मोटी स्लाइस के तेजी से ऊतक समाशोधन और सजातीय बहु-लेबलिंग प्रदान करता है, जिससे सफेद और ग्रे दोनों पदार्थों में विभिन्न न्यूरोनल उप-जनसंख्या की पहचान सक्षम होती है। समाशोधन के बाद, स्लाइस माइक्रोमीटर संकल्प के साथ LSFM के माध्यम से और एक तेजी से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए एक साथ कई चैनलों में imaged रहे हैं. नियमित रूप से उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल के भीतर एलएसएफएम विश्लेषण के साथ शॉर्ट के संयोजन से, थोड़े समय में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर बड़े वॉल्यूमेट्रिक क्षेत्रों के 3 डी साइटोआर्किटेक्चर पुनर्निर्माण को प्राप्त करना संभव है, इस प्रकार मानव मस्तिष्क के व्यापक संरचनात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम करना संभव है।
Introduction
मानव मस्तिष्क के बड़े संस्करणों के 3 डी आणविक संगठन और साइटोआर्किटेक्चर का विश्लेषण करने के लिए नमूनों की ऑप्टिकल पारदर्शिता की आवश्यकता होती है, जो व्यापक प्रसंस्करण समय के साथ प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त की जाती है। ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक ऊतकों के भीतर अपवर्तक सूचकांक (आरआई) में विषमता को कम करने के लिए विकसित किए गए थे, जिससे प्रकाश बिखरने को कम करने और उच्च संकल्प इमेजिंग 1,2,3,4,5 के लिए प्रकाश प्रवेश गहराई में वृद्धि हुई. समाशोधन और गहरी ऊतक लेबलिंग तरीकों में वर्तमान प्रगति अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक 6,7,8,9,10,11,12 शोषण द्वारा बरकरार कृंतक अंगों और भ्रूण की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग की अनुमति देते हैं.
हालांकि, पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों का वॉल्यूमेट्रिक 3 डी पुनर्निर्माण अभी भी मॉडल जीवों की तुलना में एक चुनौतीपूर्ण कार्य का प्रतिनिधित्व करता है। जटिल जैविक संरचना और चर पोस्टमॉर्टम निर्धारण और भंडारण की स्थिति ऊतक समाशोधन दक्षता, एंटीबॉडी प्रवेश गहराई, और एपिटोप मान्यता 13,14,15,16,17,18,19से समझौता कर सकती है। इसके अलावा, यांत्रिक ऊतक सेक्शनिंग और बाद में समाशोधन और प्रत्येक टुकड़ा के लेबलिंग अभी भी एक कुशल समाशोधन और बड़े मानव मस्तिष्क क्षेत्रों की वर्दी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप लंबे प्रसंस्करण समय और परिष्कृत कस्टम उपकरण की आवश्यकता होती है, मॉडल जीवों 15,20,21,22 की तुलना में।
एस– एच2हे2 – प्रतिजन आरएट्रीवल-टी डीई (लघु) ऊतक परिवर्तन तकनीक विशेष रूप से मानव मस्तिष्क18,23 की बड़ी मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विकसित की गई है। यह विधि एपिटोप बहाली के साथ संयोजन में, ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए स्विच प्रोटोकॉल11 के ऊतक संरचनात्मक संरक्षण और पेरोक्साइड हाइड्रोजन की उच्च सांद्रता को नियोजित करती है। लघु विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार, glial कोशिकाओं, वाहिका, और myelinated फाइबर18,24 के लिए मार्करों के साथ मानव मस्तिष्क स्लाइस की वर्दी धुंधला की अनुमति देता है. इसके परिणाम कम और उच्च घनत्व वाले प्रोटीन दोनों के विश्लेषण के साथ संगत हैं। जिसके परिणामस्वरूप उच्च पारदर्शिता का स्तर और वर्दी लेबलिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मोटी स्लाइस के वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण सक्षम, विशेष रूप से, तेजी से अधिग्रहण प्रकाश शीट तंत्र के लिए 18,24,25,26,27इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस काम में, हम वर्णन करते हैं कि कैसे लघु ऊतक परिवर्तन तकनीक का उपयोग एक साथ समाशोधन और दसियों फॉर्मलिन-फिक्स्ड मानव मस्तिष्क वर्गों के बहु-दौर लेबलिंग के लिए किया जा सकता है। चार अलग-अलग फ्लोरोसेंट मार्करों का एक साथ उपयोग किया जा सकता है, जिससे विभिन्न सेलुलर उप-आबादी की पहचान हो सकती है। समाशोधन के बाद, उच्च संकल्प वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है. यहां, हमने एक कस्टम-निर्मित उल्टे एलएसएफएम 18,24,25,26,27 का उपयोग किया, जो नमूना के तेजी से ऑप्टिकल सेक्शनिंग और समानांतर में कई चैनलों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। इस नियमित रूप से उच्च throughput प्रोटोकॉल के साथ, यह मानव मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों की एक उप सेलुलर संकल्प के साथ एक व्यापक सेलुलर और संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए संभव है के रूप में पहले से ही एक पूरे ब्रोका के क्षेत्र23 के मानचित्रण में प्रदर्शन किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
बड़े मानव मस्तिष्क क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए ऑप्टिकल समाशोधन और एकल स्लाइस के इम्यूनोलेबलिंग के बाद यांत्रिक ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता होती है। यहाँ प्रस्तु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए मानव मस्तिष्क के नमूने प्रदान करने के लिए ब्रूस फिशल, मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, एए मार्टिनोस सेंटर फॉर बायोमेडिकल इमेजिंग, रेडियोलॉजी विभाग का धन्यवाद करते हैं। इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 654148 (लेसरलैब-यूरोप) के तहत, विशिष्ट अनुदान समझौते संख्या 785907 (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) और नंबर 945539 (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA3) के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल हॉस्पिटल कॉर्पोरेशन सेंटर से विशिष्ट अनुदान समझौते संख्या (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) के MH117023 तहत अनुसंधान और नवाचार के लिए यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से वित्त पोषण प्राप्त हुआ। और यूरो-बायोइमेजिंग इतालवी नोड (ईएसएफआरआई अनुसंधान बुनियादी ढांचे) के ढांचे में शिक्षा के लिए इतालवी मंत्रालय से। अंत में, यह शोध “फोंडाजियोन सीआर फिरेंज़े” के योगदान के साथ किया गया था। इस काम की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करें। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
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