المقاصة البصرية ووضع العلامات للفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في تصوير الدماغ البشري على نطاق واسع
Summary
يوفر البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة للمسح البصري السريع والمتزامن ، ووضع العلامات المستديرة المعطية ، وإعادة البناء الحجمي ثلاثي الأبعاد لعشرات أقسام الدماغ البشري بعد الوفاة من خلال الجمع بين تقنية تحويل الأنسجة القصيرة (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2،2′-thiodiethanol [TDE]) مع التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني.
Abstract
على الرغم من العديد من تقنيات التطهير التي ظهرت في العقد الماضي ، لا تزال معالجة أدمغة البشر بعد الوفاة مهمة صعبة بسبب أبعادها وتعقيدها ، مما يجعل التصوير بدقة ميكرومتر صعبا بشكل خاص. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإجراء إعادة بناء الأجزاء الحجمية من الدماغ البشري عن طريق معالجة عشرات الأقسام في وقت واحد باستخدام بروتوكول تحويل الأنسجة SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2،2′-thiodiethanol [TDE]) ، والذي يتيح التطهير ووضع العلامات والتصوير المتسلسل للعينات باستخدام المجهر الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). يوفر SHORT إزالة الأنسجة بسرعة ووضع علامات متعددة متجانسة للشرائح السميكة مع العديد من العلامات العصبية ، مما يتيح تحديد مجموعات فرعية عصبية مختلفة في كل من المادة البيضاء والرمادية. بعد المقاصة ، يتم تصوير الشرائح عبر LSFM بدقة ميكرومتر وفي قنوات متعددة في وقت واحد لإعادة بناء 3D سريعة. من خلال الجمع بين تحليل SHORT و LSFM ضمن بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على إعادة بناء العمارة الخلوية 3D للمناطق الحجمية الكبيرة بدقة عالية في وقت قصير ، وبالتالي تمكين التوصيف الهيكلي الشامل للدماغ البشري.
Introduction
يتطلب تحليل التنظيم الجزيئي 3D والهندسة الخلوية لكميات كبيرة من الدماغ البشري شفافية بصرية للعينات ، يتم تحقيقها من خلال بروتوكولات ذات وقت معالجة مكثف. تم تطوير تقنيات المسح البصري لتقليل عدم التجانس في معامل الانكسار (RI) داخل الأنسجة ، وبالتالي تقليل تشتت الضوء وزيادة عمق اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة1،2،3،4،5. تسمح التطورات الحالية في طرق التطهير ووضع العلامات على الأنسجة العميقة بالتصوير الحجمي لأعضاء القوارض والأجنة السليمة من خلال استغلال تقنيات الفحص المجهري المتطورة6،7،8،9،10،11،12.
ومع ذلك ، لا تزال إعادة البناء الحجمي 3D لمناطق واسعة من الدماغ البشري بعد الوفاة تمثل مهمة صعبة مقارنة بالكائنات الحية النموذجية. يمكن أن يؤدي التركيب البيولوجي المعقد وظروف التثبيت والتخزين المتغيرة بعد الوفاة إلى الإضرار بكفاءة إزالة الأنسجة وعمق اختراق الأجسام المضادة والتعرف على الحواتم13،14،15،16،17،18،19. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة الميكانيكية والتطهير ووضع العلامات اللاحقة لكل شريحة لتحقيق تطهير فعال ووضع علامات موحدة على مناطق الدماغ البشري الكبيرة ، مما يؤدي إلى أوقات معالجة طويلة والحاجة إلى معدات مخصصة متطورة ، مقارنة بالكائنات النموذجية15،20،21،22.
تم تطوير تقنية تحويل الأنسجة SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) خصيصا لتحليل كميات كبيرة من الدماغ البشري18,23. تستخدم هذه الطريقة الحفاظ على بنية الأنسجة لبروتوكول SWITCH11 وتركيزات عالية من هيدروجين البيروكسيد لتقليل التألق الذاتي للأنسجة ، بالاقتران مع ترميم الحاتمة. يسمح SHORT بتلطيخ موحد لشرائح الدماغ البشري مع علامات لأنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والأوعية الدموية والألياف الميالينية18,24. نتائجه متوافقة مع تحليل كل من البروتينات منخفضة وعالية الكثافة. تتيح مستويات الشفافية العالية الناتجة ووضع العلامات الموحدة إعادة البناء الحجمي للشرائح السميكة باستخدام المجهر الفلوري ، على وجه الخصوص ، من أجل الحصول السريع على جهاز الصفيحة الخفيفة الذي يمكن استخدامه18،24،25،26،27.
في هذا العمل ، نصف كيف يمكن استخدام تقنية تحويل الأنسجة القصيرة للتطهير المتزامن ووضع العلامات متعددة الجولات لعشرات أقسام الدماغ البشري الثابتة بالفورمالين. يمكن استخدام أربع علامات فلورية مختلفة معا ، مما يؤدي إلى تحديد مجموعات فرعية خلوية مختلفة. بعد التطهير ، يمكن إجراء التصوير الحجمي عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. هنا ، استخدمنا LSFM المقلوب حسب الطلب18،24،25،26،27 ، والذي يتيح التقسيم البصري السريع للعينة والاستحواذ السريع على قنوات متعددة بالتوازي. مع هذا البروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على توصيف خلوي وهيدي شامل مع دقة خلوية فرعية لمناطق واسعة من الدماغ البشري كما هو موضح بالفعل في رسم خرائط منطقة بروكابأكملها 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب التصوير عالي الدقة وإعادة بناء 3D لمناطق الدماغ البشري الكبيرة تقسيما ميكانيكيا للأنسجة يليه المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية لشرائح مفردة. يصف البروتوكول المقدم هنا كيف يمكن استخدام طريقة تحويل الأنسجة القصيرة للمعالجة السريعة والمتزامنة لأقسام سميكة متعددة من الدماغ البش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بروس فيشل ، مستشفى ماساتشوستس العام ، مركز إيه إيه مارتينوس للتصوير الطبي الحيوي ، قسم الأشعة ، على توفير عينات الدماغ البشري التي تم تحليلها في هذه الدراسة. حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج إطار البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 654148 (Laserlab-Europe) ، من برنامج إطار عمل Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار بموجب اتفاقية المنحة المحددة رقم 785907 (مشروع الدماغ البشري SGA2) ورقم 945539 (مشروع الدماغ البشري SGA3) ، من مركز مؤسسة المستشفيات العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم U01 MH117023 ، ومن وزارة التعليم الإيطالية في إطار العقدة الإيطالية للتصوير الحيوي الأوروبي (البنية التحتية لأبحاث ESFRI). أخيرا ، تم إجراء هذا البحث بمساهمة “Fondazione CR Firenze”. محتوى هذا العمل هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
