Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme
Summary
Mevcut protokol, (SWITCH – H2O2 – Antijen Reterival – 2,2′-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.
Abstract
Son on yılda ortaya çıkan çok sayıda temizleme tekniğine rağmen, ölüm sonrası insan beyinlerinin işlenmesi, mikrometre çözünürlüğünde görüntülemeyi özellikle zorlaştıran boyutları ve karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir görev olmaya devam ediyor. Bu makale, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) ile numunelerin temizlenmesini, etiketlenmesini ve sıralı görüntülenmesini sağlayan SHORT (S WITCH – H2O2 – Antijen Retrivansı – 2,2′-tiyodietanol [TDE]) doku transformasyon protokolü ile onlarca kesiti aynı anda işleyerek insan beyninin hacimsel bölümlerinin rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktadır. SHORT, hem beyaz hem de gri maddede farklı nöronal alt popülasyonların tanımlanmasını sağlayarak, çeşitli nöronal belirteçlerle hızlı doku temizliği ve kalın dilimlerin homojen çoklu etiketlenmesini sağlar. Temizlendikten sonra, dilimler hızlı bir 3D rekonstrüksiyon için LSFM aracılığıyla mikrometre çözünürlüğünde ve aynı anda birden fazla kanalda görüntülenir. SHORT’u rutin olarak yüksek verimli bir protokol içinde LSFM analizi ile birleştirerek, kısa sürede yüksek çözünürlükte büyük hacimsel alanların 3D sitomimari rekonstrüksiyonunu elde etmek ve böylece insan beyninin kapsamlı yapısal karakterizasyonunu sağlamak mümkündür.
Introduction
İnsan beyninin büyük hacimlerinin 3D moleküler organizasyonunu ve sitomimarisini analiz etmek, kapsamlı işlem süresine sahip protokoller aracılığıyla elde edilen örneklerin optik şeffaflığını gerektirir. Dokulardaki kırılma indisindeki (RI) heterojenliği en aza indirmek, böylece ışık saçılımını azaltmak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyon derinliğini artırmak için optik temizleme teknikleri geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Temizleme ve derin doku etiketleme yöntemlerindeki mevcut gelişmeler, en son mikroskopi tekniklerinden yararlanarak bozulmamış kemirgen organlarının ve embriyoların hacimsel olarak görüntülenmesine izin verir6,7,8,9,10,11,12.
Bununla birlikte, ölüm sonrası insan beyninin geniş alanlarının hacimsel 3D rekonstrüksiyonu, model organizmalarla karşılaştırıldığında hala zorlu bir görevi temsil ediyor. Karmaşık biyolojik bileşim ve değişken postmortem fiksasyon ve saklama koşulları, doku temizleme etkinliğini, antikor penetrasyon derinliğini ve epitop tanıma 13,14,15,16,17,18,19’u tehlikeye atabilir. Ayrıca, büyük insan beyni alanlarının verimli bir şekilde temizlenmesi ve tek tip etiketlenmesi elde etmek için mekanik doku kesitleri ve ardından her dilimin temizlenmesi ve etiketlenmesi hala gereklidir, bu da model organizmalara kıyasla uzun işlem sürelerine ve sofistike özel ekipman ihtiyacına neden olur 15,20,21,22.
SWITCH – H2O2 – antijen Retrieval –TDE (KISA) doku dönüşüm tekniği, insan beyninin büyük hacimlerini analiz etmek için özel olarak geliştirilmiştir18,23. Bu yöntem, epitop restorasyonu ile birlikte doku otofloresansını azaltmak için SWITCH protokolü11’in doku yapısal korumasını ve yüksek konsantrasyonlarda peroksit hidrojeni kullanır. SHORT, farklı nöronal alt tipler, glial hücreler, damar sistemi ve miyelinli lifler için belirteçlerle insan beyni dilimlerinin düzgün boyanmasına izin verir18,24. Sonuçları hem düşük hem de yüksek yoğunluklu proteinlerin analizi ile uyumludur. Ortaya çıkan yüksek şeffaflık seviyeleri ve tek tip etiketleme, floresan mikroskobu ile kalın dilimlerin hacimsel olarak yeniden yapılandırılmasını sağlar, özellikle hızlı elde etme için ışık tabakası aparatı kullanılabilir 18,24,25,26,27.
Bu çalışmada, KISA doku dönüşüm tekniğinin, formalinle sabitlenmiş onlarca insan beyni bölümünün aynı anda temizlenmesi ve çok yönlü etiketlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Dört farklı floresan işaretleyici birlikte kullanılabilir ve bu da farklı hücresel alt popülasyonların tanımlanmasına yol açar. Temizledikten sonra, floresan mikroskobu ile yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme yapılabilir. Burada, numunenin hızlı optik kesitini ve paralel olarak birden fazla kanalın hızlı bir şekilde alınmasını sağlayan özel yapım ters çevrilmiş bir LSFM 18,24,25,26,27 kullandık. Bu rutin olarak yüksek verimli protokolle, tüm Broca alanının haritalanmasında gösterildiği gibi, insan beyninin geniş alanlarının hücre altı çözünürlüğü ile kapsamlı bir hücresel ve yapısal karakterizasyon elde etmek mümkündür23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyük insan beyni alanlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyonu, mekanik doku kesiti ve ardından tek dilimlerin optik olarak temizlenmesi ve immüno-etiketlenmesini gerektirir. Burada sunulan protokol, KISA doku transformasyon yönteminin, LSFM ile hücre altı çözünürlüğe sahip 3D beyin rekonstrüksiyonu için çoklu insan beyninin kalın kesitlerinin hızlı ve eşzamanlı işlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.
Diğer yakla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Massachusetts General Hospital, AA Martinos Biyomedikal Görüntüleme Merkezi, Radyoloji Bölümü’nden Bruce Fischl’e bu çalışmada analiz edilen insan beyni örneklerini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Çerçeve Programı’ndan 654148 No’lu hibe sözleşmesi (Laserlab-Europe), Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Çerçeve Programı’ndan 785907 No’lu (İnsan Beyni Projesi SGA2) ve 945539 No’lu (İnsan Beyni Projesi SGA3) Özel Hibe Sözleşmesi kapsamında, Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Hastane Şirketi Merkezi’nden U01 MH117023 ödül numarası altında, ve Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI araştırma altyapısı) çerçevesinde İtalya Eğitim Bakanlığı’ndan. Son olarak, bu araştırma “Fondazione CR Firenze”nin katkılarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
