Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein
Summary
Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.
Abstract
Ondanks de talrijke ophelderingstechnieken die in het afgelopen decennium zijn ontstaan, blijft het verwerken van postmortale menselijke hersenen een uitdagende taak vanwege de afmetingen en complexiteit, die beeldvorming met micrometerresolutie bijzonder moeilijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om de reconstructie van volumetrische delen van het menselijk brein uit te voeren door tegelijkertijd tientallen secties te verwerken met het SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) weefseltransformatieprotocol, dat clearing, labeling en sequentiële beeldvorming van de monsters mogelijk maakt met light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM). SHORT zorgt voor een snelle weefselopruiming en homogene multi-labeling van dikke plakken met verschillende neuronale markers, waardoor de identificatie van verschillende neuronale subpopulaties in zowel witte als grijze stof mogelijk wordt. Na het opruimen worden de plakjes via LSFM met micrometerresolutie en in meerdere kanalen tegelijk in beeld gebracht voor een snelle 3D-reconstructie. Door SHORT te combineren met LSFM-analyse binnen een routinematig high-throughput protocol, is het mogelijk om in korte tijd de 3D-cytoarchitectuurreconstructie van grote volumetrische gebieden met hoge resolutie te verkrijgen, waardoor een uitgebreide structurele karakterisering van het menselijk brein mogelijk wordt.
Introduction
Het analyseren van de 3D-moleculaire organisatie en cytoarchitectuur van grote volumes van het menselijk brein vereist optische transparantie van monsters, bereikt door protocollen met een lange verwerkingstijd. Optische ophelderingstechnieken werden ontwikkeld om de heterogeniteit in brekingsindex (RI) in de weefsels te minimaliseren, waardoor lichtverstrooiing wordt verminderd en de lichtpenetratiediepte wordt vergroot voor beeldvorming met hoge resolutie 1,2,3,4,5. De huidige vooruitgang op het gebied van opruimings- en diepe weefsellabelingmethoden maakt volumetrische beeldvorming van intacte knaagdierorganen en embryo’s mogelijk door gebruik te maken van geavanceerde microscopietechnieken 6,7,8,9,10,11,12.
Volumetrische 3D-reconstructie van grote delen van het postmortale menselijke brein is echter nog steeds een uitdagende taak in vergelijking met modelorganismen. De complexe biologische samenstelling en de variabele postmortale fixatie- en opslagomstandigheden kunnen de efficiëntie van het opruimen van weefsel, de penetratiediepte van antilichamen en de epitoopherkenning in gevaar brengen 13,14,15,16,17,18,19. Bovendien is het mechanisch doorsnijden van weefsel en het vervolgens wissen en labelen van elke plak nog steeds nodig om een efficiënte opruiming en uniforme etikettering van grote menselijke hersengebieden te bereiken, wat resulteert in lange verwerkingstijden en de behoefte aan geavanceerde aangepaste apparatuur, vergeleken met modelorganismen 15,20,21,22.
De SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (KORTE) weefseltransformatietechniek is speciaal ontwikkeld om grote volumes van het menselijk brein te analyseren18,23. Deze methode maakt gebruik van het weefselstructurele behoud van het SWITCH-protocol11 en hoge concentraties peroxidewaterstof om weefselautofluorescentie te verminderen, in combinatie met epitoopherstel. SHORT maakt uniforme kleuring van menselijke hersenplakjes mogelijk met markers voor verschillende neuronale subtypes, gliacellen, vasculatuur en gemyeliniseerde vezels18,24. De resultaten zijn compatibel met de analyse van eiwitten met zowel lage als hoge dichtheid. De resulterende hoge transparantieniveaus en uniforme etikettering maken volumetrische reconstructie van dikke plakjes mogelijk met fluorescentiemicroscopie, met name voor snelle acquisitie kan light-sheet-apparatuur worden gebruikt 18,24,25,26,27.
In dit werk beschrijven we hoe de SHORT-weefseltransformatietechniek kan worden gebruikt voor het gelijktijdig opruimen en labelen van tientallen met formaline gefixeerde menselijke hersensecties. Vier verschillende fluorescerende markers kunnen samen worden gebruikt, wat leidt tot de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties. Na het klaren kan volumetrische beeldvorming met hoge resolutie worden uitgevoerd met fluorescentiemicroscopie. Hier gebruikten we een op maat gemaakte omgekeerde LSFM 18,24,25,26,27, die een snelle optische doorsnede van het monster en een snelle verwerving van meerdere kanalen parallel mogelijk maakt. Met dit routinematig high-throughput protocol is het mogelijk om een uitgebreide cellulaire en structurele karakterisering te verkrijgen met een subcellulaire resolutie van grote delen van het menselijk brein, zoals al is aangetoond in het in kaart brengen van een volledig Broca-gebied23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beeldvorming met hoge resolutie en 3D-reconstructie van grote menselijke hersengebieden vereisen mechanische weefselsectie, gevolgd door optische opheldering en immunolabeling van afzonderlijke plakjes. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe de SHORT-weefseltransformatiemethode kan worden gebruikt voor snelle en gelijktijdige verwerking van meerdere dikke secties van het menselijk brein voor 3D-hersenreconstructie met een subcellulaire resolutie met LSFM.
In tegenstelling tot andere b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, voor het verstrekken van de menselijke hersenmonsters die in deze studie zijn geanalyseerd. Dit project ontving financiering van het Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 654148 (Laserlab-Europe), van het Horizon 2020-kaderprogramma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de specifieke subsidieovereenkomst nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) en nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), van het General Hospital Corporation Center van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer U01 MH117023, en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs in het kader van Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-onderzoeksinfrastructuur). Ten slotte werd dit onderzoek uitgevoerd met de bijdrage van “Fondazione CR Firenze”. De inhoud van dit werk valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
