Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala
Summary
Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l’imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.
Abstract
Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell’ultimo decennio, l’elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l’imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l’imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l’identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l’analisi SHORT con LSFM all’interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.
Introduction
L’analisi dell’organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l’eterogeneità dell’indice di rifrazione (RI) all’interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l’imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli attuali progressi nei metodi di clearing e marcatura dei tessuti profondi consentono l’imaging volumetrico di organi ed embrioni di roditori intatti sfruttando tecniche di microscopia all’avanguardia 6,7,8,9,10,11,12.
Tuttavia, la ricostruzione volumetrica 3D di vaste aree del cervello umano post-mortem rappresenta ancora un compito impegnativo rispetto agli organismi modello. La complessa composizione biologica e le variabili condizioni di fissazione e conservazione post-mortem possono compromettere l’efficienza di eliminazione dei tessuti, la profondità di penetrazione degli anticorpi e il riconoscimento dell’epitopo 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, il sezionamento meccanico dei tessuti e la successiva pulizia ed etichettatura di ogni fetta sono ancora necessari per ottenere una pulizia efficiente e un’etichettatura uniforme di grandi aree cerebrali umane, con conseguenti lunghi tempi di lavorazione e la necessità di sofisticate apparecchiature personalizzate, rispetto agli organismi modello 15,20,21,22.
La tecnica di trasformazione tissutale SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) è stata sviluppata specificamente per analizzare grandi volumi del cervello umano18,23. Questo metodo impiega la conservazione strutturale dei tessuti del protocollo SWITCH11 e alte concentrazioni di perossido di idrogeno per ridurre l’autofluorescenza tissutale, in combinazione con il ripristino dell’epitopo. SHORT consente una colorazione uniforme di fette di cervello umano con marcatori per diversi sottotipi neuronali, cellule gliali, vascolarizzazione e fibre mieliniche18,24. I suoi risultati sono compatibili con l’analisi di proteine sia a bassa che ad alta densità. Gli elevati livelli di trasparenza che ne derivano e l’etichettatura uniforme consentono la ricostruzione volumetrica di fette spesse con microscopia a fluorescenza, in particolare, per l’acquisizione rapida è possibile utilizzare apparecchi a foglio di luce 18,24,25,26,27.
In questo lavoro, descriviamo come la tecnica di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzata per la pulizia simultanea e l’etichettatura multi-round di decine di sezioni di cervello umano fissate in formalina. Quattro diversi marcatori fluorescenti possono essere utilizzati insieme, portando all’identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari. Dopo la pulizia, è possibile eseguire l’imaging volumetrico ad alta risoluzione con microscopia a fluorescenza. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM invertito su misura 18,24,25,26,27, che consente un rapido sezionamento ottico del campione e una rapida acquisizione di più canali in parallelo. Con questo protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere una caratterizzazione cellulare e strutturale completa con una risoluzione sub-cellulare di vaste aree del cervello umano, come già dimostrato nella mappatura di un’intera area di Broca23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione 3D di grandi aree cerebrali umane richiedono il sezionamento meccanico dei tessuti, seguito dalla pulizia ottica e dall’immunomarcatura di singole fette. Il protocollo qui presentato descrive come il metodo di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzato per l’elaborazione rapida e simultanea di più sezioni spesse del cervello umano per la ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare con LSFM.
A differenza di altri appro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Dipartimento di Radiologia, per aver fornito i campioni di cervello umano analizzati in questo studio. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma quadro di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 654148 (Laserlab-Europe), dal programma quadro Horizon 2020 dell’Unione europea per la ricerca e l’innovazione nell’ambito dell’accordo di sovvenzione specifico n. 785907 (Human Brain Project SGA2) e n. 945539 (Human Brain Project SGA3), dal General Hospital Corporation Center del National Institutes of Health con il numero di premio U01 MH117023, e dal Ministero dell’Istruzione nell’ambito di Euro-Bioimaging Italian Node (infrastruttura di ricerca ESFRI). Infine, questa ricerca è stata realizzata con il contributo di “Fondazione CR Firenze”. Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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