Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)
Summary
본 프로토콜은 (SWITCH – H 2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.
Introduction
대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.
그러나 사후 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 3D 재구성은 모델 유기체에 비해 여전히 어려운 작업입니다. 복잡한 생물학적 조성과 가변적인 사후 고정 및 보관 조건은 조직 투명화 효율, 항체 침투 깊이 및 항원결정기 인식을 손상시킬 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19. 더욱이, 큰 인간 뇌 영역의 효율적인 투명화 및 균일한 표지를 달성하기 위해서는 기계적 조직 절편과 각 절편의 후속 투명화 및 표지가 여전히 필요하며, 그 결과 모델 유기체에 비해 처리 시간이 길고 정교한 맞춤형 장비가 필요합니다 15,20,21,22.
SWITCH – H 2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) 조직 형질전환 기술은 인간 뇌18,23의 많은 양을 분석하기 위해 특별히 개발되었다. 이 방법은 에피토프 복원과 함께 SWITCH 프로토콜11의 조직 구조 보존과 고농도의 과산화수소를 사용하여 조직 자가형광을 감소시킵니다. SHORT는 다양한 신경 아형, 신경교세포, 혈관 및 수초화 섬유에 대한 마커를 사용하여 인간 뇌 절편의 균일한 염색을 허용합니다18,24. 그 결과는 저밀도 및 고밀도 단백질의 분석과 모두 호환됩니다. 그 결과 높은 투명도 수준과 균일한 라벨링은 형광 현미경으로 두꺼운 슬라이스의 체적 재구성을 가능하게 하며, 특히 빠른 획득을 위해 광시트 장치를 사용할 수 있습니다 18,24,25,26,27.
이 연구에서는 SHORT 조직 형질전환 기법을 사용하여 수십 개의 포르말린 고정 인간 뇌 절편을 동시에 투명화하고 다중으로 표지하는 방법을 설명합니다. 4개의 서로 다른 형광 마커를 함께 사용할 수 있어 서로 다른 세포 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 투명화 후 형광 현미경으로 고해상도 체적 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기서는 맞춤형 도립 LSFM 18,24,25,26,27을 사용하여 샘플의 빠른 광학 절편과 여러 채널을 병렬로 빠르게 수집할 수 있습니다. 이러한 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜을 사용하여, 전체 Broca의 영역(23)의 매핑에서 이미 입증된 바와 같이 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 세포 내 분해능으로 포괄적인 세포 및 구조적 특성 분석을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.
다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에서 분석된 인간 뇌 표본을 제공해 주신 매사추세츠 종합 병원, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology의 Bruce Fischl에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 보조금 계약 번호 654148(Laserlab-Europe)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램으로부터, 특정 보조금 계약 번호 785907(Human Brain Project SGA2) 및 No. 945539(Human Brain Project SGA3)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation으로부터 자금을 지원받았으며, 수상 번호 U01 MH117023에 따라 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 종합병원 법인 센터(General Hospital Corporation Center)로부터 보조금을 받았습니다. Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI 연구 인프라)의 틀에서 이탈리아 교육부에서. 마지막으로, 이 연구는 “Fondazione CR Firenze”의 기여로 수행되었습니다. 이 작업의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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