大規模ヒト脳イメージングにおけるライトシート蛍光顕微鏡のための光学的透明化と標識
Summary
現在のプロトコルは(Sの魔女- H2O2 -抗原 Retrieval – 2,2′ -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。
Abstract
過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。
Introduction
ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。
しかし、死後の人間の脳の広い領域の体積3D再構成は、モデル生物と比較して依然として困難な課題です。複雑な生物学的組成とさまざまな死後の固定および保存条件は、組織の透明化効率、抗体の浸透深さ、およびエピトープ認識を損なう可能性があります13、14、15、16、17、18、19。さらに、モデル生物と比較して、大きなヒトの脳領域の効率的な透明化と均一な標識を達成するためには、機械的組織切片とそれに続く各スライスの透明化と標識が依然として必要であり、その結果、処理時間が長くなり、高度なカスタム機器が必要になります15,20,21,22。
SWITCH – H2O2 – 抗原 R賦活化 – TDE (SHORT) 組織形質転換技術は、ヒトの脳の大量の分析に特化して開発された18,23。この方法では、SWITCHプロトコル11の組織構造保存と高濃度の過酸化水素を使用して、エピトープ修復と組み合わせて組織の自家蛍光を減少させます。SHORTは、異なるニューロンサブタイプ、グリア細胞、血管系、および有髄線維のマーカーを用いて、ヒトの脳スライスを均一に染色することを可能にします18,24。その結果は、低密度および高密度タンパク質の両方の分析に適合します。得られた高い透明性レベルと均一な標識により、蛍光顕微鏡法による厚切りの体積再構成が可能になり、特に、高速取得ライトシート装置18、24、25、26、27を使用することができる。
この研究では、SHORT組織形質転換技術を使用して、ホルマリン固定された数十のヒト脳切片の同時透明化とマルチラウンドラベリングを行う方法について説明します。4つの異なる蛍光マーカーを併用することで、異なる細胞亜集団を同定することができます。クリアリング後、蛍光顕微鏡で高分解能の体積イメージングを行うことができます。ここでは、カスタムメイドの逆LSFM 18,24,25,26,27を使用し、サンプルの高速光学セクショニングと複数のチャンネルの並列取得を可能にしました。この日常的にハイスループットプロトコルにより、ブローカの領域全体のマッピングですでに実証されているように、人間の脳の広い領域の細胞内分解能で包括的な細胞および構造特性評価を得ることができます23。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。
他のアプローチとは異…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マサチューセッツ総合病院、A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging、放射線科のBruce Fischl氏に、この研究で分析されたヒト脳標本を提供していただいたことに感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)のホライズン2020研究・イノベーションフレームワークプログラム(Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme)から助成金契約第654148号(Laserlab-Europe)、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation(研究・イノベーションのためのホライズン2020フレームワークプログラム)から特定助成契約第785907号(Human Brain Project SGA2)および第945539号(Human Brain Project SGA3)から、米国国立衛生研究所総合病院コーポレーションセンター(National Institutes of Health)から助成金U01 MH117023で資金提供を受けました。 Euro-Bioimaging Italian Node(ESFRI研究インフラストラクチャ)の枠組みにおけるイタリア教育省から。最後に、この研究は「Fondazione CR Firenze」の協力を得て行われました。この作業の内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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