Summary
在这里，我们提出了第一个用于大型植物遗传转化的体内研究的局部真空浸润方案。使用这种方法，我们首次实现了农杆菌介导的植物可可瞬时转化。
Abstract
植物转化中的瞬时是植物遗传转化的一种快速且具有成本效益的替代方案。大多数植物转化方案都依赖于使用农杆菌介导的转化。然而，由于将大型工厂进行真空处理的物理和经济限制，目前使用的方案是标准化的。这项工作提出了一种针对大型植物定制的局部真空农业渗透的有效方案。为了评估所提出的方法的功效，我们测试了其在可可植物中的应用，可可植物是一种难以遗传转化的热带植物物种。我们的方案允许对可可叶的局部地上部分施加高达0.07 MPa的真空，重复，从而可以迫使农杆菌浸润到附着叶的细胞间隙中。结果，我们实现了农杆菌介导的植物转化中对RUBY报告基因系统表达的附着可可叶的瞬时反应。这也是农杆菌介导的植物可可瞬时转化的首例。该协议将允许将基于真空的农业渗透方法应用于具有类似大小限制的其他植物物种，并为顽固的木本大尺寸物种的基因在植物中表征打开大门。
Introduction
植物遗传转化方法对于测试基因的生物学功能至关重要，鉴于后基因组时代预测的大量未表征基因，今天特别有用1.这些方法可用于获得完全转化的细胞系或瞬时表达基因。当宿主吸收的外源DNA完全且不可逆地整合到宿主基因组中，并且遗传修饰传递给后代时，就会发生稳定转化。瞬时表达，称为瞬时转化，发生在 农杆菌 转移到细胞中的多个 T-DNA 拷贝，这些拷贝尚未整合到宿主基因组中，并在感染后 2-4 天达到峰值2。
值得注意的是，瞬时表达测定通常足以用于基因的功能表征，并且与稳定转化相比具有多种优势。例如，瞬时转化不需要基于组织培养的再生程序。另一个优点是它与 植物 基因的功能分析兼容，现有的几个成功的例子，为模式植物物种标准化了协议，如 拟南芥3 和 本氏烟草4，但在非模式物种5中仍然受到限制。
瞬态检测的发展依赖于高效基因转移方法的可用性。为此，最流行的方法是基于 农杆菌 浸润，它利用 农杆菌 将 DNA 转移到植物细胞的独特能力 6.这些分析的另一个有用工具是使用报告基因，例如绿色荧光蛋白 （GFP）、β-葡萄糖醛酸酶 （GUS）、荧光素酶或 RUBY，所有这些都用于跟踪转化事件。在这些报告系统中，RUBY是目前最容易可视化的，它依赖于酪氨酸通过三个酶促步骤反应转化为甜菜碱。与其他报告系统相反，所得甜菜碱可以很容易地在转化的植物组织上观察到颜色鲜艳的色素，而无需复杂的设备或额外的反应物7。
当将 农杆菌 悬浮液浸润到叶肉叶肉的细胞间隙时，成功进行农业感染的最关键步骤是克服叶子表皮角质层施加的物理屏障8。虽然对于某些植物，用无针注射器（注射器Agroinfiltration）产生的压力梯度足以实现有效的农业渗透，如 Nicotiana benthamiana9中发生的情况，但其他植物物种可能需要更大的压力梯度，例如在真空泵10的帮助下产生的压力梯度。在真空辅助工艺中，农业渗透分两步进行。在第一种情况下，真空的作用是使植物材料承受减压，迫使气体通过气孔和伤口从叶肉空气空间释放。然后，在再加压阶段， 农杆菌 悬浮液通过气孔浸润细胞间隙并伤口11。
与注射器渗透相比，真空渗透允许更高的使用频率、可重复性，并且能够在渗透过程的每个阶段控制压力和持续时间10。在菠菜（Spinacia oleracea）12、牡丹（多年生木本植物）（Paeonia ostii）13和豇豆（Vigna unguiculata）14等不同植物物种的叶子中，真空农渗方案实现了比注射器浸润更深的浸润率。同样，在番茄（Lycopersicon esculentum）15和非洲菊（非洲菊杂交）16中，真空农业浸润比注射器浸润产生更强、更均匀的基因沉默。与注射器浸润相比，真空浸润的另一个优点是对基因型的依赖性较低，最近在三种柑橘品种（Fortunella obovata、 Citrus limon 和 C. grandis）中观察到了这一点17。然而，当试图将真空农业渗透应用于太大而无法放入干燥器的植物时，真空室的尺寸可能是一个限制，这通常发生在热带木本植物中。
下面，我们描述了一种克服真空室空间限制的方案，测试其在植物中可可叶瞬态转化的效用。我们提出了第一种可可的局部真空渗透方法，该方法不需要额外的设备，甚至允许使用与整个植物渗透相同的实验室干燥器，但具有简单的适应性，允许进入真空室内的植物的一部分，允许其在植物发育的不同阶段使用。为了验证所提出的局部真空渗透方法的实用性，我们选择可可作为难以转化的大叶热带植物物种的代理。使用这种局部浸润方法，我们最近报告了通过农杆菌介导的真空浸润在鳄梨中首次出现植物瞬时表达，条件先前针对分离的叶子进行了优化 18，在这里我们报告了可可中植物瞬时表达的第一次。
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Protocol
1. 根癌农杆菌培养
- 解冻 根癌农杆菌 菌株的电感受态细胞LBA4404。
- 加入 1 mL 酵母麦芽 （YM; 表1）将肉汤放入 17 mm x 100 mm 培养管中。保存此试管以备后用，并将其保存在室温 （RT） 下。
- 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 30 μL 解冻的 农杆菌 细胞和 100-250 ng（最多 5 μL）含有 35S：RUBY 的 DNA。轻轻混合。
注： 35S：RUBY 是赵云德送给赵云德的礼物。为避免样品电弧，请尽可能减少离子化合物的存在。这些离子化合物可能是DNA19乙醇沉淀的残留盐。 - 此时，将 1 mm 电穿孔比色皿放在冰上。
- 将先前的悬浮混合物转移到冷却的 1 mm 电穿孔比色皿中。把所有东西都放在冰上。擦拭比色皿的金属电极。
- 将电穿孔器设置为 Agr （2.2 kV，~5 ms，1 个脉冲）。将比色皿放入电穿孔室内。
- 按 下脉冲 按钮。注册脉冲参数。如果样品呈电弧，则电穿孔过程失败。
注意：在脉冲后立即将细胞快速转移到 YM 肉汤中至关重要。延迟这种转移会大大降低转换效率20。 - 立即使用保存的YM肉汤将细胞从比色皿转移到17mm x 100 mm管中。轻轻重悬细胞。
- 将转化的细胞在28°C和250rpm下在轨道培养箱上孵育3小时。
注意：这种培养物不含抗生素;注意适当的无菌条件。 - 将该培养物划线到选择性 YM 琼脂平板上 21.对于转化的 LBA4404-RUBY 菌株，确保这些平板含有利福平 （25 μg/mL）、大观霉素 （50 μg/mL） 和链霉素 （50 μg/mL）。将该板在28°C立式培养箱中孵育过夜。
注意：在该方案中，使用载体 35S：RUBY ，其赋予细菌对大观霉素（50μg/ mL）的耐药性，并作为浸润植物组织的视觉报告基因。 - 将过夜培养物中的菌落接种在 12.5 mL YM 肉汤和 Luria Bertani （LB） 肉汤的混合物上（分别以 9：1 的比例）、10 mM MES、pH 5.722。确保该选择性液体培养基含有与步骤1.10相同的抗生素。请参阅 表 1 查看这些培养基的成分和浓度。
- 孵育 农杆菌时，为培养物留出足够的曝气空间，约为液体体积的 4 至 5 倍。将 YM 肉汤用于 农杆菌 菌株LBA4404以避免细胞结块23.
- 在28°C轨道培养箱上以250rpm孵育培养物16小时。
- 使用步骤1.11中使用的相同培养基将培养物放大至初始体积的10倍。
- 在28°C轨道培养箱上孵育培养物16小时和250rpm。
- 将过夜培养物调整至光密度（OD600）为0.4。加入 20 μM 乙酰丁香酮 （AS）。
- 在28°C轨道培养箱上以250rpm孵育，直至OD600 达到约1.0。
- 在20°C下以4500× g 离心细胞10分钟。
- 用悬浮液（10mM MES，10mM MgCl 2，pH 5.7）重悬沉淀，调节OD600至0.6。加入 200 μM AS24。
注意：悬浮液在28°C下预孵育。 如果悬浮液在添加时是冷的，细胞会沉淀。 - 在黑暗条件下和25°C下将细菌悬浮液放置2-24小时。 不需要搅拌22.
2.植物选择
- 选择具有叶子的树枝的植物，处于农业渗透的最佳阶段。
注意：该植物可能是成熟的或成熟的树。对于可可，建议使用C期的嫩叶。这些叶子是青铜色到浅绿色的;它们没有完全膨胀，也没有像 D 阶段那样坚硬25（图 1）。- 作为对照，同时对其他植物（例如， 烟草）进行农业渗透，其所用菌株和载体报告了高农业渗透效率。
注意：如果在此对照中没有获得阳性结果，则阴性结果可能是由于所使用的应变或载体造成的。
- 作为对照，同时对其他植物（例如， 烟草）进行农业渗透，其所用菌株和载体报告了高农业渗透效率。
3. 真空室设置
- 作为真空室，使用带有真空计的干燥器来测量内部的真空压力。
- 从步骤1.19开始，将250μM茉莉酸（JA）18,26加入农杆菌悬浮液中。
- 将 农杆菌 培养物转移到广口烧杯中，以淹没选定的树枝和叶子。然后，将装 有农杆菌 培养物的烧杯放入干燥器内。
- 将树枝放在干燥器及其盖子之间。确保将所需的叶子浸没在 农杆菌 培养物中。接下来，使用跳环，这是一个带有切口的圆形环，允许植物分支进入干燥器。跳跃环还充当干燥器底部和顶部之间的垫片。
- 确保垫圈在结构上足够稳定，以避免被盖子压扁，足够灵活，可以弯曲和调整到干燥器的圆周，并且不是由多孔材料制成。
注意：本研究使用了一根绞合金属线，该金属线由几根较小的电线绞合在一起组成，并涂有类似于垫圈的无孔塑料材料（图2）。 - 要将树枝固定在干燥器上，请使用硅胶印模材料。确保材料具有粘性、无孔性、对干燥器和植物的化学惰性，并且易于涂抹和填充分支、垫圈和干燥器之间的小间隙。
- 一旦硅胶印模材料聚合（大约需要 1 分钟）并将分支固定到位，关闭干燥器。确保不要留下任何缝隙。
- 将干燥器连接到真空泵（图 3）。
4.真空渗透
- 启动真空泵，直到达到 -0.07 MPa。
- 一旦达到此压力，关闭压力阀并关闭真空泵。保持此压力5分钟。
- 打开压力阀以恢复腔室压力。
注意：这是一个关键步骤。逐渐稳定地恢复腔室压力。对干燥器完全重新加压可能需要长达 3 分钟的时间。延长再加压会增加浸润组织内的细菌数量10。 - 再重复此过程两次。
- 从细胞悬液和干燥器上取下树枝。
- 用蒸馏水清洁渗入的叶子。
5.浸润叶的孵化
- 让浸润的叶子在25°C的黑暗条件下停留48小时。
- 然后，将浸润的组织暴露在 16/8 小时的光/暗光周期下。
- 评估感染后 3-7 天 （DPI） 的瞬时叶片转化。
图1：可可叶发育阶段。 （A-E） 发展阶段25.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：真空室配置及其组件。 真空室是连接到真空计的干燥器。垫圈/O 形圈被切割，因此它有一个放置分支的开口。（A）真空计，（B）盖子，（C）垫圈/O形圈，（D）压力阀，（E）干燥器，（F）软管。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3： 在植物 真空农业渗透系统中。 为避免渗透过程中的真空损失，必须将分支固定在干燥器上，并用硅胶压印材料固定垫圈/O 形圈。（A）可可植物，（B）真空室，（C）硅胶压印材料，（D）浸没在 农杆菌 悬浮液上的叶子，（E）真空泵。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
该协议为大型木本植物提供了一种有效的农业渗透方法。通过该协议，我们能够实现-0.07 MPa的真空压力，从而对可可叶进行有效的局部渗透。在 图 4 中，我们观察了渗透系统的设置过程，在 图 5 中，我们观察了最终配置。
图 4：真空室设置。 （A） 注意垫圈两端之间的分支位置。该垫圈足够大，可以让分支穿过干燥器及其盖子之间。观察由于树枝的不规则表面而形成的间隙。（B）将树枝固定在干燥器上，形成的间隙用硅胶压印材料填充。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：真空渗透系统设置。 使用拟议方案的大型可可植物真空渗透系统的设置示例。 请点击这里查看此图的较大版本.
在农业浸润的第一阶段，组织受到减压，这导致气体通过气孔和伤口从气孔腔和相邻的叶肉空气空间释放。随着真空度的增加，可以用肉眼看到浸入 农杆菌 悬浮液中的叶子表面的小气泡。下一步是给组织重新加压，并迫使内部 农杆菌 悬浮液填充空气11留下的空隙。在某些区域，渗透的叶子颜色较深（图6）。这表明 农杆菌 悬浮液已穿透组织并扩散到整个组织，填充了叶片的细胞间隙 8.
图6：真空农业渗透完成后成年可可叶的轴向视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
该协议实现了对大型可可植物局部叶片的农业渗透。通过这样做，我们用携带 35S：RUBY 的载体作为报告系统，瞬时转换了大型可可植物。我们发现该报告系统是可可成功瞬时转化的有用指标，因为叶片中甜菜碱的积累表明了转化的效率。Betalains是鲜红色的色素，在绿色的叶子上产生明显的信号，可以用肉眼观察到（图7）。由于叶子附着在植物上，如果浸润的组织保持其活力，甜菜碱可能会积聚。 图 8 显示了一系列结果，从高到低的甜菜碱积累在 C 阶段转化的可可叶上。值得一提的是，这是该物种首次报道的 植物 瞬时转化。
图 7：可可叶瞬时转化为过表达 35S：RUBY。甜菜碱积累导致的可可叶片上的红点是评估植物局部真空农业渗透方案的一种简单快速的方法。图像为 6 DPI，比例尺：1 厘米，光学变焦：8 倍。 请点击这里查看此图的较大版本.
图8：可可叶上的甜菜素积累。 6 DPI下可可叶上甜菜碱积累的不同水平和模式，通过农 杆菌介导的RUBY报告基因瞬时转化。比例尺： 1 厘米， 光学变焦： 8 倍. 请点击这里查看此图的较大版本.
| LB培养基 | YM培养基 | |
| 酵母提取物 | 5 克/升 | 0.4 克/升 |
| 酪蛋白的胰蛋白胨酶消化物 | 10 克/升 | |
| 氯化钠 | 5 克/升 | 0.1 克/升 |
| 甘露醇 | 10 克/升 | |
| MgSO4·7h20 | 0.204 克/升 | |
| K2HPO4 | 0.38 克/升 | |
| MES系统 | 1.95 克/升（10 米） | 1.95 克/升（10 米） |
| 氯化镁2 |
表1：YM和LB培养基的组成。
补充图1：使用无针注射器对可可叶进行强制农业渗透的代表性图像。 注射器浸润不会导致肉眼可见的叶子中 RUBY 表达，但在使用无针注射器施加压力时确实会导致损伤。图像为 6 DPI，比例尺：5 mm，光学变焦：25 倍。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这项工作中，我们以可可植物为例，提出了一种高效、低成本的木本 植物瞬时 转化农业渗透方案。鉴于众所周知的叶子角质层对植物组织转化的限制，我们专注于开发一种策略，以促进木本植物的真空渗透，这些植物通常不愿意这个过程。
真空室内实现的真空压力只能通过有效密封和填充干燥器、树枝、垫圈/O 形圈和干燥器盖子之间产生的小间隙来实现，这是协议的主要挑战。因此，使用硅胶印模材料将树枝固定在干燥器上至关重要。这种材料是无孔的，被证明具有足够的粘性，可以将分支粘附在干燥器和垫圈上，并且具有化学惰性，因此渗透的分支和干燥器都不会损坏。
此外，需要使用真空泵在叶片部分内实现压力梯度，使空气从气孔腔和叶肉区域吸出，然后在再加压过程中较大的压力梯度将 农杆菌 悬浮液通过气孔推入叶片并缠绕10。我们使用冷冻干燥机作为真空泵。这是该协议对每个实验室需求的多功能性和适应性的一个例子。以冷冻干燥机为真空泵，约需3分钟即可达到-0.07MPa。这对可可是有效的，因为以前的作者也用相同的真空压力25真空浸润可可分离的叶子。这是首选的浸润方法，因为它比无辅助或无针注射器浸润更具可重复性（补充图1）。当使用真空泵进行真空渗透时，用户可以控制组织暴露于真空10的压力和时间。
在其他植物中，如杨树，已经研究过，由于叶肉细胞的排列，叶片结构可能会影响渗透效率。这些细胞的不同和可变排列可能导致农杆菌悬浮液 8,27 的不均匀浸润，因为叶子的内部结构具有细胞间气隙8。虽然当将叶子浸没在农杆菌悬浮液中时，可能会发生通过叶片气孔的自发浸润，但大气压力不足以克服表皮角质层并用细菌悬浮液置换这些空气空间;这已经在其他顽固的物种上进行了尝试，例如 Persea americana18。出于这个原因，强制真空介导的农业渗透被证明是促进物质通过气孔或伤口渗透到叶片中的有效方法10。最近报道了通过生物接种和农业接种用 badnavirus cacao 肿胀芽加纳 M 病毒感染性克隆接种可可幼苗28.在可可中，大多数瞬时转化测定是在分离的叶片上进行的25,29，由于植物材料降解，导致瞬时表达维持减少。据我们所知，没有关于可可植物瞬时遗传转化的报道。在这里，我们实现了可可的第一次瞬时转化，此前，我们的同一研究小组在Persea americana18中实现了这一点，使其成为一种可行的方法，可以对仅在叶子上表达的代谢物或分子进行局部体内分析。
35S：RUBY载体的瞬时转化通过甜菜碱在可可叶上的瞬时表达得到证实。该载体在不自然产生这些色素的植物上重建甜菜碱生物合成途径。只有一些石竹可以自然地从酪氨酸生物合成甜菜碱，并具有自己的代谢途径30。为了复制这种代谢，35S：RUBY包含三种酶的异源表达的遗传信息，这些酶将常见的氨基酸酪氨酸转化为甜菜碱7。
在植物 中，瞬态转化方案比稳定转化方案具有许多优点，包括更快、更具成本效益和增强的转化效率31。此外， 在植物 中瞬时转化可应用于许多功能基因组学分析32。对可可的功能基因组学研究旨在解决该物种对许多病原体的疾病易感性，如 Moniliophthora perniciosa 和 Phytophthora spp33，提高其抗旱性34，并改善其感官质量35。该协议有可能改善和深化可可功能基因组学研究， 因为它使植物 在大型可可树甚至其他大型顽固和多年生植物物种上的瞬时转化成为可能。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们感谢 Lic。赫苏斯·富恩特斯·冈萨雷斯和内斯托尔·伊万·罗伯斯·奥利瓦雷斯协助拍摄视频片段。我们感谢 CIATEJ（可可植物） 的 Antonia Gutierrez Mora 博士的慷慨捐赠。我们还要感谢 CIATEJ 和墨西哥 Laboratorio Nacional PlanTECC 的设施支持。H.E.H.D.（CVU：1135375）在墨西哥国家人类与技术委员会（CONAHCYT）的资助下进行了硕士研究。R.U.L. 感谢哈利斯科州科学与技术委员会 （COECYTJAL） 和墨西哥哈利斯科州创新与技术秘书处 （SICYT） 的支持 （Grant 7270-2018）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
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