مقايسة كيميائية أسيتيل كليك لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل
Summary
تعد المقايسات الكيميائية السريعة والدقيقة للكشف عن مثبطات محددة أداة مهمة في ترسانة تطوير الأدوية. هنا ، نقدم مقايسة كيميائية قابلة للتطوير فوق الأسيتيل لقياس تثبيط نشاط أستلة HAT1.
Abstract
يلعب HAT1 ، المعروف أيضا باسم Histone acetyltransferase 1 ، دورا مهما في تخليق الكروماتين عن طريق تثبيت وأستلة H4 الوليدة قبل تجميع النيوكليوسوم. وهو مطلوب لنمو الورم في أنظمة مختلفة ، مما يجعله هدفا محتملا لعلاج السرطان. لتسهيل تحديد المركبات التي يمكن أن تمنع النشاط الأنزيمي HAT1 ، ابتكرنا مقايسة نقرة الأسيتيل للفحص السريع. في هذا الفحص البسيط ، نستخدم HAT1 / Rbap46 المؤتلف ، والذي يتم تنقيته من الخلايا البشرية المنشطة. تستخدم الطريقة الأسيتل-CoA التناظري 4-pentynoyl-CoA (4P) في نهج كيمياء النقر. يتضمن ذلك النقل الأنزيمي لمقبض الألكاين من خلال تفاعل أسيلة يعتمد على HAT1 إلى ببتيد H4 N-terminal البيوتينيل. ثم يتم تجميد الببتيد الذي تم التقاطه على ألواح النيوترفيدين ، متبوعا بوظيفة كيمياء النقر باستخدام البيوتين أزيد. بعد ذلك ، يتم استخدام توظيف streptavidin-peroxidase لأكسدة amplex red ، مما يؤدي إلى ناتج فلوري كمي. من خلال إدخال مثبطات كيميائية أثناء تفاعل الأسيل ، يمكننا تحديد التثبيط الأنزيمي بناء على تقليل إشارة التألق. الأهم من ذلك ، أن هذا التفاعل قابل للتطوير ، مما يسمح بفحص عالي الإنتاجية للمثبطات المحتملة للنشاط الأنزيمي HAT1.
Introduction
من بين العديد من أسيتيل ترانسفيراز حقيقية النواة ، كان HAT1 هو أسيتيل ترانسفيراز هيستون الأولي الذي تم عزله1،2،3. أثبتت التحقيقات اللاحقة دورها المحوري في تكرار الكروماتين ، لا سيما في تخليق نيوكليوسومات جديدة خلال المرحلةS-phase 4. أدت مساعينا البحثية إلى إدراك أن HAT1 يتم تحفيزه بشكل كبير من خلال علاج عامل نمو البشرة (EGF) في الخلايا الثديية5. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن HAT1 مطلوب للتكاثر السريع للخلايا وتشكيل الورم في الجسم الحي6،7،8،9. تشير البيانات إلى أن HAT1 أمر بالغ الأهمية في تنسيق العمليات الابتنائية واللاجينية لانقسام الخلايا ، مما يؤدي إلى نمو الورم.
HAT1 ثنائي الأسيتيلات الذيل الأميني الطرفي للهيستون H4 على الليسين 5 و 12 في مركب مع بروتين chaperone Rbap46 ، الذي يربط الهستون ويقدم المحطة الأمينية إلى HAT1. ثم يتم استيراد رباعيات الهستون أو disomes10 ، جنبا إلى جنب مع HAT1 / Rbap46 وغيرها من مرافقي هيستون11 ، إلى النواة. ثم يتم إطلاق الهستونات ليتم إيداعها في شوكة النسخ المتماثل ، أو مواقع أخرى لدعم تنشيط الجينات أو قمعها. وظيفة علامة HAT1 di-acetylation على هيستون H4 ليست مفهومة تماما. من المحتمل إزالته بسرعة في غضون 15-30 دقيقة بفعل هيستون ديسيتيلاز12،13،14،15 بعد إدخال H4 في الكروماتين. وبالتالي ، لا يتم نشر علامة HAT1 di-acetylation في الكروماتين وقد لا تؤدي دورا جينيا حقيقيا ، على الرغم من افتراض دور في تجنيد الإنزيمات المعدلة للكروماتين إلى الكروماتينالناشئ 12. أيضا ، HAT1 لا أسيتيل الكروماتين مباشرة. يقتصر نشاطها على الهستونات القابلة للذوبان.
تم إعاقة تطوير مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز ذات الجزيئات الصغيرة بسبب المقايسات غير المحددة ومنخفضة الإنتاجية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى توليد مركبات تفاعلية بيولوجيا16،17. يتطلب اختبار المعيار الذهبي لقياس أنشطة أسيتيل ترانسفيراز استخدام 3H-acetyl-CoA ، مما يحد من الإنتاجية ويتطلب الإشعاع. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، تم وصف وتأكيد مثبطات أسيتيل ترانسفيراز جزيء صغير محددة وقوية للغاية تستهدف CBP / p30018 و KAT6A / B19،20 من خلال استخدام 3H-acetyl-CoA. للمضي قدما ، يتم وضع فحوصات محسنة لتحقيق إنتاجية أفضل وتجنب المخاطر المختبرية.
استخدمت التطورات الحديثة في مراقبة أستلة21 كيمياء النقر لتمكين مراقبة التفاعل الأنزيمي. هناك مجموعة متنوعة من السلائف التي تدعم النقر والتي يمكن الوصول إليها عن طريق طرق اصطناعية بسيطة أو متاحة للشراء والتي يمكن دمجها في تفاعلات الإنزيم. عادة ما يتم إجراء هذه التفاعلات في الأنظمة المؤتلفة ، على الرغم من أن المقايسات القائمة على الخلايا ممكنة أيضا22. تتمثل ميزة العوامل والركائز التي تدعم النقر في أن الفحص يمكن أن يقيس نشاط الإنزيم مباشرة دون الحاجة إلى أنظمة قراءة مقترنة غالبا ما تزعجها مركبات الفحص وتتطلب خطوات معالجة إضافية. وهذا يسمح بمعالجة المثبطات فقط خلال الخطوة الأنزيمية ، في حين يتم تنفيذ جميع خطوات التشغيل والكشف النهائية بعد الغسيل المكثف لإزالة المركبات ، مما يحد من احتمال حدوث تداخل المقايسة. هذه المزايا تجعل تصميم المقايسات التي تدعم النقر أفضل من المقايسات المقترنة التي تعتمد عادة على اكتشاف أنزيم A الحر.
أحد الاعتبارات المهمة هو قبول العوامل المساعدة التي تدعم النقر في الموقع النشط للإنزيم. قد لا تكون العوامل المشتركة الحالية التي تم تمكين النقر عليها متوافقة تماما مع الموقع النشط المحسن للعامل المساعد الأصلي. يمكن استخدام المعلومات الهيكلية والنمذجة لتصميم بدائل الأحماض الأمينية لتوسيع الموقع النشط لدمج الركائز المعدلة23. قد يتيح ذلك الفحص باستخدام حركية إنزيم محسنة ومستويات أقل من الركيزة والإنزيم. عيب هذا النهج هو أن الجيوب التحفيزية المتغيرة قد لا تحدد المثبطات التي تتفاعل بقوة مع الإنزيم الأصلي. في النهاية ، هناك حاجة إلى مجموعة من الأساليب لتحديد مثبطات الإنزيم المحتملة والتحقق من صحتها.
هنا ، نصف طريقة تم تطويرها لتنقية وفحص نشاط إنزيم HAT1 باستخدام العامل المساعد للنقر 4-pentynoyl-CoA24. يستخدم هذا الفحص (الشكل 1) تسلسل الإنزيم الأصلي في مركب مع البروتين الشريك المطلوب Rbap46 ، والذي ثبت أنه يعزز نشاط الإنزيم. يسمح تنقية الإنزيم من الخلايا البشرية بتنشيط الإنزيم في السليلولو ، مما قد يحافظ على تحفيز تعديلات ما بعد الترجمة المهمة لنشاط الإنزيم الكامل. تم استخدام تصميم وتحسين مقايسات الإنزيم المؤتلف للشاشات الكيميائية عالية الإنتاجية بنجاح لتحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة HAT1.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقد الماضي ، أصبحت كيمياء النقر بارزة20 ، مما يتيح التصميم الدقيق للهياكل الكيميائية المتفاعلة. في هذا السياق ، ظهرت العديد من الاتصالات التساهمية المتعامدةالحيوية 21 كخيارات واعدة لتشكيل مجمعات في بيئتها الطبيعية. تستخدم كيمياء النقرات أزواجا من المجموعات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جورج تشنغ على توفير H4K12CoA. نشكر أعضاء Gruber Lab على المناقشات والتعليقات المفيدة. نشكر الدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (1K08CA245024) و CPRIT (RR200090) ومؤسسة V (V2022-022).
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
- Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
- Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
- Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
- Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
- Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
- Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
- Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
- Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
- Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
- Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
- Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
- Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
- Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
- Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
- Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
- Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
- He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
- Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
- Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
- Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
- Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
- Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
- Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
- Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
