히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석
Summary
특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.
Abstract
히스톤 아세틸전이효소 1(Histone acetyltransferase 1)이라고도 하는 HAT1은 뉴클레오솜 조립 전에 초기 H4를 안정화하고 아세틸화하여 염색질 합성에 중요한 역할을 합니다. 다양한 시스템에서 종양 성장에 필요하므로 암 치료의 잠재적 표적이 될 수 있습니다. HAT1 효소 활성을 억제할 수 있는 화합물의 식별을 용이하게 하기 위해 당사는 신속한 스크리닝을 위한 아세틸 클릭 분석을 고안했습니다. 이 간단한 분석에서는 활성화된 인간 세포에서 정제된 재조합 HAT1/Rbap46을 사용합니다. 이 방법은 클릭 화학 접근 방식에서 아세틸-CoA 아날로그 4-펜티노일-CoA(4P)를 활용합니다. 여기에는 HAT1 의존성 아실화 반응을 통해 비오틴화된 H4 N-말단 펩타이드로 알카인 핸들의 효소 전달이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 펩타이드를 뉴트라비딘 플레이트에 고정시킨 후 비오틴-아지드로 클릭 화학 기능화를 수행합니다. 그 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 모집을 사용하여 amplex red를 산화시켜 정량적 형광 출력을 생성합니다. 아실화 반응 중에 화학적 억제제를 도입하면 형광 신호의 감소를 기반으로 효소 억제를 정량화할 수 있습니다. 중요한 것은 이 반응이 확장 가능하여 HAT1 효소 활성에 대한 잠재적 억제제의 고처리량 스크리닝이 가능하다는 것입니다.
Introduction
수많은 진핵 아세틸 전이 효소 중에서, HAT1은 1,2,3 분리 될 초기 히스톤 아세틸 전이 효소였습니다. 후속 연구는 염색질 복제, 특히 S상4단계 동안 새로운 뉴클레오솜 합성에서 중추적인 역할을 확고하게 확립했습니다. 우리의 연구 노력은 HAT1이 유방 세포의 표피 성장 인자(EGF) 치료에 의해 매우 자극된다는 것을 인식하게 했다5. 또한, HAT1은 생체 내 빠른 세포 증식 및 종양 형성에 필요하다는 것이 밝혀졌습니다 6,7,8,9. 데이터에 따르면 HAT1은 세포 분열을 위한 동화 작용 및 후성유전학적 과정을 조정하여 종양 성장을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다.
HAT1은 히스톤을 결합하고 아미노 말단을 HAT1에 제시하는 샤페론 단백질 Rbap46과 복합체로 라이신 5 및 12에서 히스톤 H4의 아미노 말단 꼬리를 디 아세틸화합니다. 히스톤 사량체 또는 디솜(10)은 HAT1/Rbap46 및 다른 히스톤 샤페론(11)과 함께 핵으로 수입된다. 그런 다음 히스톤은 복제 포크 또는 유전자 활성화 또는 억제를 지원하기 위해 다른 부위에 기탁되도록 방출됩니다. 히스톤 H4에 대한 HAT1 디 아세틸화 표시의 기능은 완전히 이해되지 않았습니다. H15가 염색질에 삽입 된 후 히스톤 탈아 세틸 화제 12,13,14,15의 작용에 의해 30-4 분 이내에 빠르게 제거 될 가능성이 높습니다. 따라서, HAT1 디-아세틸화 표시는 염색질에서 증식되지 않으며, 초기 염색질에 대한 염색질 변형 효소의 모집에 대한 역할이 가정되었지만, 진정한 후성유전학적 역할을 하지 않을 수 있다12. 또한 HAT1은 염색질을 직접 아세틸화하지 않습니다. 그 활성은 용해성 히스톤으로 제한됩니다.
저분자 히스톤 아세틸전이효소 억제제의 개발은 비특이적이고 처리량이 낮은 분석에 의해 방해를 받아 종종 생물학적 반응성 화합물16,17의 생성을 초래합니다. 아세틸전이효소 활성을 측정하기 위한 골드 스탠다드 분석에는 처리량이 제한되고 방사선이 필요한 3H-아세틸-coA를 사용해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 최근에는 CBP/p30018 및 KAT6A/B19,20을 표적으로 하는 특이적이고 매우 강력한 저분자 아세틸전이효소 억제제가 3 H-아세틸-CoA의 사용을 통해 기술되고 확인되었습니다. 앞으로 더 나은 처리량을 달성하고 실험실 위험을 피하기 위한 개선된 분석법이 고안되고 있습니다.
아세틸화 모니터링(acetylation monitoring)21 의 최근 발전은 효소 반응 모니터링을 가능하게 하기 위해 클릭 화학(click chemistry)을 사용하였다. 간단한 합성 경로로 접근하거나 효소 반응에 통합할 수 있는 구매가 가능한 다양한 클릭 기반 전구체가 있습니다. 이러한 반응은 전형적으로 재조합 시스템에서 수행되지만, 세포 기반 분석도 가능하다22. 클릭 가능 보조 인자 및 기질의 장점은 스크리닝이 종종 스크리닝 화합물에 의해 교란되고 추가 처리 단계가 필요한 결합된 판독 시스템 없이 효소 활성을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 효소 단계에서만 억제제 처리가 가능한 반면, 모든 다운스트림 기능화 및 검출 단계는 화합물을 제거하기 위해 광범위한 세척 후에 수행되므로 분석 간섭이 발생할 가능성이 제한됩니다. 이러한 장점으로 인해 클릭 기반 분석의 설계는 일반적으로 유리 코엔자임 A의 검출에 의존하는 결합 분석보다 선호됩니다.
한 가지 중요한 고려 사항은 클릭 가능 보조 인자를 효소 활성 부위에 수용하는 것입니다. 기존의 클릭 지원 보조 요인은 기본 보조 요인에 최적화된 활성 사이트와 완전히 호환되지 않을 수 있습니다. 구조 정보 및 모델링은 변형된 기질(23)을 통합하기 위해 활성 부위를 확대하기 위한 아미노산 치환을 설계하는데 사용될 수 있다. 이를 통해 향상된 효소 역학과 더 낮은 기질 및 효소 수준으로 스크리닝할 수 있습니다. 이 접근법의 단점은 변형된 촉매 포켓이 네이티브 효소와 강하게 상호 작용하는 억제제를 식별하지 못할 수 있다는 것입니다. 궁극적으로, 잠재적인 효소 억제제를 식별하고 검증하기 위해서는 다양한 접근법의 조합이 필요합니다.
여기에서는 클릭 보조 인자 4-펜티노일-CoA24를 사용하여 HAT1 효소 활성을 정제하고 분석하기 위해 개발된 방법을 설명합니다. 이 분석법(그림 1)은 효소 활성을 높이는 것으로 밝혀진 필수 파트너 단백질 Rbap46과 복합체의 네이티브 효소 서열을 사용합니다. 인간 세포에서 효소를 정제하면 셀룰로에서 효소가 활성화되어 완전한 효소 활성에 중요한 자극적인 번역 후 변형을 보존할 수 있습니다. 고처리량 화학 스크리닝을 위한 재조합 효소 분석의 설계 및 최적화는 HAT1 저분자 억제제를 식별하고 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 10년 동안 클릭 화학이 두각을 나타내면서 상호 작용하는 화학 구조의 정밀한 설계가 가능해졌습니다. 이러한 맥락에서, 다양한 생체 직교 공유 연결(bioorthogonal covalent connections)21 은 자연 환경에서 복합체를 형성하기 위한 유망한 옵션으로 등장했다. 클릭 화학은 일반적으로 “클릭 반응”으로 알려진 빠르고 선택적인 반응을 나타내는 작용기 쌍을 사용합니?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H4K12CoA를 제공해 주신 George Zheng에게 감사드립니다. 유용한 토론과 피드백을 주신 Gruber Lab 구성원 여러분께 감사드립니다. NIH/NCI(1K08CA245024), CPRIT(RR200090) 및 V Foundation(V2022-022)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
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