Summary

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Abstract

HAT1, ook bekend als histonacetyltransferase 1, speelt een cruciale rol bij de chromatinesynthese door ontluikend H4 te stabiliseren en te acetyleren vóór de nucleosoomassemblage. Het is nodig voor tumorgroei in verschillende systemen, waardoor het een potentieel doelwit is voor de behandeling van kanker. Om de identificatie van verbindingen die de enzymatische activiteit van HAT1 kunnen remmen te vergemakkelijken, hebben we een acetyl-kliktest ontwikkeld voor snelle screening. In deze eenvoudige test gebruiken we recombinant HAT1/Rbap46, dat wordt gezuiverd uit geactiveerde menselijke cellen. De methode maakt gebruik van het acetyl-CoA-analoog 4-pentynoyl-CoA (4P) in een klik-chemiebenadering. Dit omvat de enzymatische overdracht van een alkynehandvat via een HAT1-afhankelijke acylatiereactie naar een gebiotinyleerd H4 N-terminaal peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geïmmobiliseerd op neutravidineplaten, gevolgd door functionalisatie van klikchemie met biotine-azide. Vervolgens wordt rekrutering van streptavidine-peroxidase gebruikt om amplexrood te oxideren, wat resulteert in een kwantitatieve fluorescerende output. Door chemische remmers in te brengen tijdens de acylatiereactie, kunnen we enzymatische remming kwantificeren op basis van een reductie van het fluorescentiesignaal. Belangrijk is dat deze reactie schaalbaar is, waardoor potentiële remmers met een hoge doorvoer kunnen worden gescreend op HAT1-enzymatische activiteit.

Introduction

Van de talrijke eukaryote acetyltransferasen was HAT1 de eerste histonacetyltransferase die 1,2,3 werd geïsoleerd. Latere onderzoeken hebben de centrale rol ervan in de replicatie van chromatine stevig vastgesteld, met name bij de synthese van nieuwe nucleosomen tijdens S-fase4. Ons onderzoek leidde tot de erkenning dat HAT1 sterk wordt gestimuleerd door behandeling met epidermale groeifactor (EGF) in borstcellen5. Verder is aan het licht gekomen dat HAT1 nodig is voor snelle celproliferatie en tumorvorming in vivo 6,7,8,9. Gegevens geven aan dat HAT1 van cruciaal belang is bij het coördineren van anabole en epigenetische processen voor celdeling, waardoor tumorgroei wordt gestimuleerd.

HAT1 di-acetyleert de amino-terminale staart van histon H4 op lysines 5 en 12 in complex met het chaperonne-eiwit Rbap46, dat het histon bindt en de amino-terminus presenteert aan HAT1. Histontetrameren of disomes10, samen met HAT1/Rbap46 en andere histonchaperonnes11, worden vervolgens in de kern geïmporteerd. Histonen worden vervolgens vrijgegeven om te worden afgezet op de replicatievork of andere plaatsen om genactivering of -onderdrukking te ondersteunen. De functie van de HAT1-di-acetyleringsmarkering op histon H4 is niet volledig begrepen. Het wordt waarschijnlijk snel verwijderd binnen een tijdsbestek van 15-30 minuten door de werking van histondeacetylasen 12,13,14,15 nadat H4 in chromatine is ingebracht. Het HAT1-di-acetyleringsmerk wordt dus niet gepropageerd in chromatine en speelt mogelijk geen echte epigenetische rol, hoewel een rol bij de rekrutering van chromatine-modificerende enzymen tot ontluikend chromatine is gepostuleerd12. Ook acetyleert HAT1 chromatine niet direct; De activiteit ervan is beperkt tot oplosbare histonen.

De ontwikkeling van histonacetyltransferaseremmers met kleine moleculen wordt belemmerd door niet-specifieke tests met een lage doorvoer, wat vaak resulteert in de generatie van biologisch reactieve verbindingen16,17. De gouden standaardtest om acetyltransferase-activiteiten te meten, vereist het gebruik van 3H-acetyl-coA, wat de doorvoer beperkt en straling vereist. Desalniettemin zijn onlangs specifieke en zeer krachtige acetyltransferaseremmers met kleine moleculen gericht op CBP/p30018 en KAT6A/B19,20 beschreven en bevestigd door het gebruik van 3-H-acetyl-CoA. In de toekomst worden verbeterde tests ontwikkeld om een betere doorvoer te bereiken en laboratoriumrisico’s te voorkomen.

Recente ontwikkelingen op het gebied van acetylatiemonitoring21 hebben klikchemie gebruikt om enzymatische reactiemonitoring mogelijk te maken. Er zijn verschillende klik-enabled precursoren die toegankelijk zijn via eenvoudige synthetische routes of beschikbaar zijn voor aankoop die kunnen worden opgenomen in enzymreacties. Deze reacties worden meestal uitgevoerd in recombinante systemen, hoewel celgebaseerde assays ook haalbaar zijn22. Het voordeel van klik-enabled co-factoren en substraten is dat screening de enzymactiviteit direct kan meten zonder dat er gekoppelde uitleessystemen nodig zijn die vaak worden verstoord door screeningsverbindingen en extra verwerkingsstappen vereisen. Dit maakt alleen remmerbehandelingen mogelijk tijdens de enzymatische stap, terwijl alle stroomafwaartse functionaliserings- en detectiestappen worden uitgevoerd na uitgebreid wassen om verbindingen te verwijderen, waardoor de kans op testinterferentie wordt beperkt. Deze voordelen maken het ontwerp van klik-enabled assays te verkiezen boven gekoppelde assays die gewoonlijk afhankelijk zijn van de detectie van vrij co-enzym A.

Een belangrijke overweging is de acceptatie van klik-enabled co-factoren in de enzymactieve plaats. Bestaande co-factoren met klikfunctie zijn mogelijk niet volledig compatibel met de actieve site die is geoptimaliseerd voor de native co-factor. Structurele informatie en modellering kunnen worden gebruikt om aminozuursubstituties te ontwerpen om de actieve plaats te vergroten om gewijzigde substraten op te nemen23. Dit kan screening mogelijk maken met verbeterde enzymkinetiek en lagere substraat- en enzymniveaus. Het nadeel van deze aanpak is dat veranderde katalytische pockets mogelijk geen remmers identificeren die sterk interageren met het oorspronkelijke enzym. Uiteindelijk is een combinatie van benaderingen nodig om potentiële enzymremmers te identificeren en te valideren.

Hier beschrijven we een methode die is ontwikkeld om de activiteit van het HAT1-enzym te zuiveren en te testen met behulp van de klikco-factor 4-pentynoyl-CoA24. Deze test (Figuur 1) maakt gebruik van de oorspronkelijke enzymsequentie in complex met het vereiste partnereiwit Rbap46, waarvan is aangetoond dat het de enzymactiviteit verhoogt. Zuivering van het enzym uit menselijke cellen zorgt voor enzymactivering in cellulo, waardoor stimulerende posttranslationele modificaties die belangrijk zijn voor volledige enzymactiviteit behouden kunnen blijven. Ontwerp en optimalisatie van recombinante enzymtesten voor high-throughput chemische schermen zijn met succes gebruikt om HAT1-remmers van kleine moleculen te identificeren en te karakteriseren.

Protocol

1. Methode 1: Produceren en zuiveren van recombinant HAT1/Rbap46-complex HEK293f-cellen ontdooien, herstellen en uitbreidenOntdooi 1-10 miljoen HEK293f zoogdiercellen26 in 30 ml freestyle 293 expressiemedia in een kolf van 100 ml. Incubeer in 8% CO2 bij 37 °C terwijl je roteert bij 60 tpm. Tel en controleer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en pas vervolgens de rotatiesnelheid aan tot 120 tpm. Breid uit tot een kweek van 300 m…

Representative Results

Standaardcurven in tweevoud (16 putjes) moeten op elke plaat worden opgenomen om een goede testprestatie te garanderen. Standaardcurvegegevens moeten in tabelvorm worden opgesteld, met een bereik van 100% tot 0%, afhankelijk van de verhouding tussen Pra-bevattend peptide en natuurlijk H4-peptide in oplossing (tabel 1). Het rode signaal van Amplex is het hoogst in 100% pra/0% native H4-peptideputten en het laagst in 0% pra/100% native H4-peptideputten. Nadat fluorescentie is gedetecteerd en het gemiddelde…

Discussion

In het afgelopen decennium werd klikchemie prominent20, waardoor het mogelijk werd om nauwkeurig op elkaar inwerkende chemische structuren te ontwerpen. Binnen deze context zijn verschillende bioorthogonale covalente verbindingen21 naar voren gekomen als veelbelovende opties voor het vormen van complexen in hun natuurlijke omgeving. Klikchemie maakt gebruik van paren van functionele groepen die snelle en selectieve reacties vertonen, algemeen bekend als ‘klikreacties’. Deze…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken George Zheng voor het beschikbaar stellen van H4K12CoA. We danken de leden van het Gruber Lab voor de nuttige discussies en feedback. We danken de steun van de NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) en de V Foundation (V2022-022).

Materials

4P CoA Cayman Chemical 10547 Click chemistry co-factor
Amplex Red Fisher Sci A12222 Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide Alfa Aesar J64996MC Click chemistry
Copper Sulfate Sigma-aldrich  7758-98-7 Click chemistry
DMSO Fisher Scientific  67-68-5 diluent
DTT Acros Organics 03-12-3483 reducting agent
Forskolin VWR 102987-310 Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium Thermo Fisher 12338018 Media
Freestyle 293-F cells Thermo Fisher R790-07 Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin Anaspec AS65097 peptide substrate
HEPES Sigma-aldrich  7365-45-9 EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution Sigma-aldrich  Z00183-99-0 initiator
M2 FLAG antibody slurry Millipore-Sigma A2220 Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab) VWR 89131-980 Protein purification
Neutravidin Plate Thermo Sci 15127 BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL) MP Biomedical 198596 20x buffer
pHEK-293 plasmid Takara Bio 3390 Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x Alfa Aesar  Z00082-33-6 wash buffer
Pra peptide Genscript Custom synthesis biotinylated
Sodium Ascorbate Sigma-aldrich  134-03-2 Click chemistry
Sodium chloride Sigma-aldrich  7647-14-5 EB buffer
Sodium phosphate VWR International 7558-80-7 buffer
Streptavidin EMD Millipore 189730 competitor
Streptavidin-HRP Cell Signaling 3999S enzyme
THPTA ligand Fisher Sci 1010-500 Click chemistry
Tris base Sigma-aldrich  77-86-1 20x buffer
Triton-X 100 VWR International  9002-93-1 EB buffer
Tween-20 Sigma-aldrich  9005-64-5 Wash buffer
Urea Sigma-Aldrich 57-13-6 quencher

References

  1. Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
  2. Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
  3. Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
  4. Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
  5. Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
  6. Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
  7. Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
  8. Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
  9. Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
  10. Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
  11. Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
  12. Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
  13. Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
  14. Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
  15. Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
  16. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
  17. Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
  18. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  19. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  20. Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
  21. He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
  22. Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
  23. Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
  24. Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
  25. Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
  26. Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
  27. Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
  28. Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
  29. Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).

Play Video

Cite This Article
Rajkumar, S., Dixon, D., Lipchik, A. M., Gruber, J. J. An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation. J. Vis. Exp. (203), e66054, doi:10.3791/66054 (2024).

View Video