Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1

Summary

Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.

Abstract

HAT1, também conhecido como Histone acetiltransferase 1, desempenha um papel crucial na síntese de cromatina estabilizando e acetilando H4 nascente antes da montagem do nucleossomo. É necessário para o crescimento do tumor em vários sistemas, tornando-se um alvo potencial para o tratamento do câncer. Para facilitar a identificação de compostos que podem inibir a atividade enzimática do HAT1, desenvolvemos um ensaio de acetil-clique para triagem rápida. Neste ensaio simples, empregamos HAT1/Rbap46 recombinante, que é purificado a partir de células humanas ativadas. O método utiliza o análogo 4-pentynoyl-CoA (4P) do acetil-CoA em uma abordagem de química de cliques. Isso envolve a transferência enzimática de uma alça de alcino através de uma reação de acilação dependente de HAT1 para um peptídeo N-terminal H4 biotinilado. O peptídeo capturado é então imobilizado em placas neutravidina, seguido de funcionalização click-química com biotina-azida. Posteriormente, o recrutamento de estreptavidina-peroxidase é empregado para oxidar o vermelho de amplex, resultando em uma produção fluorescente quantitativa. Através da introdução de inibidores químicos durante a reação de acilação, podemos quantificar a inibição enzimática com base na redução do sinal de fluorescência. É importante ressaltar que essa reação é escalável, permitindo a triagem de alto rendimento de potenciais inibidores da atividade enzimática do HAT1.

Introduction

Dentre as numerosas acetiltransferases eucarióticas, a HAT1 foi a histona acetiltransferase inicial a ser isolada ^1,2,3. Investigações subsequentes estabeleceram firmemente seu papel fundamental na replicação da cromatina, particularmente na síntese de novos nucleossomos durante a fase^{S 4}. Nossos esforços de pesquisa levaram ao reconhecimento de que o HAT1 é altamente estimulado pelo tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) em células mamárias⁵. Além disso, veio à tona que o TAH1 é necessário para a rápida proliferação celular e formação tumoral in vivo6,7,8,9. Os dados indicam que o HAT1 é crítico na coordenação de processos anabólicos e epigenéticos para a divisão celular, impulsionando o crescimento tumoral.

HAT1 di-acetila a cauda amino-terminal da histona H4 nas lisinas 5 e 12 em complexo com a proteína chaperona Rbap46, que se liga à histona e apresenta o amino-terminal ao HAT1. Tetrâmeros de histona ou disomos¹⁰, juntamente com HAT1/Rbap46 e outras chaperonas de histonas¹¹, são então importados para o núcleo. As histonas são então liberadas para serem depositadas na bifurcação de replicação ou em outros locais para suportar a ativação ou repressão gênica. A função da marca de di-acetilação HAT1 na histona H4 não é totalmente compreendida. É provável que seja rapidamente removido dentro de um período de 15-30 min pela ação de histonas desacetilases 12,13,14,15 após a inserção de H4 na cromatina. Assim, a marca de di-acetilação HAT1 não é propagada na cromatina e pode não desempenhar um verdadeiro papel epigenético, embora um papel no recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina para a cromatina nascente tenha sido postulado¹². Além disso, HAT1 não acetila diretamente a cromatina; sua atividade é restrita a histonas solúveis.

O desenvolvimento de inibidores da acetiltransferase de histonas de pequenas moléculas tem sido dificultado por ensaios inespecíficos e de baixo rendimento, resultando muitas vezes na geração de compostos biologicamente reativos^16,17. O ensaio padrão-ouro para medir as atividades da acetiltransferase requer o uso de ³H-acetil-coA, que limita o rendimento e requer radiação. No entanto, recentemente, inibidores específicos e altamente potentes da acetiltransferase de pequenas moléculas visando CBP/p300¹⁸ e KAT6A/B^19,20 foram descritos e confirmados através do uso de ³H-acetil-CoA. Avançando, ensaios aprimorados para alcançar melhor rendimento e evitar riscos de laboratório estão sendo desenvolvidos.

Avanços recentes no monitoramento da acetilação²¹ têm utilizado a química de cliques para permitir o monitoramento de reações enzimáticas. Há uma variedade de precursores habilitados por clique que são acessíveis por rotas sintéticas simples ou disponíveis para compra que podem ser incorporados em reações enzimáticas. Essas reações são tipicamente realizadas em sistemas recombinantes, embora ensaios baseados em células também sejam viáveis²². A vantagem dos cofatores e substratos habilitados por clique é que a triagem pode medir diretamente a atividade enzimática sem a necessidade de sistemas de leitura acoplados que são frequentemente perturbados por compostos de triagem e exigem etapas adicionais de manuseio. Isso permite tratamentos com inibidores apenas durante a etapa enzimática, enquanto todas as etapas de funcionalização e detecção a jusante são realizadas após lavagem extensiva para remover compostos, limitando assim o potencial de interferência do ensaio. Essas vantagens tornam o projeto de ensaios habilitados por clique preferível aos ensaios acoplados que geralmente dependem da detecção de coenzima A livre.

Uma consideração importante é a aceitação de cofatores habilitados por clique no sítio ativo da enzima. Os cofatores existentes habilitados para clique podem não ser totalmente compatíveis com o site ativo otimizado para o cofator nativo. Informações estruturais e modelagem podem ser usadas para projetar substituições de aminoácidos para ampliar o sítio ativo e incorporar substratos alterados²³. Isso pode permitir a triagem com melhor cinética enzimática e níveis mais baixos de substrato e enzima. A desvantagem dessa abordagem é que bolsas catalíticas alteradas podem não identificar inibidores que interagem fortemente com a enzima nativa. Em última análise, uma combinação de abordagens é necessária para identificar e validar potenciais inibidores enzimáticos.

Aqui, descrevemos um método desenvolvido para purificar e dosar a atividade da enzima HAT1 usando o cofator clique 4-pentynoyl-CoA²⁴. Este ensaio (Figura 1) usa a sequência enzimática nativa em complexo com sua proteína parceira necessária Rbap46, que demonstrou aumentar a atividade enzimática. A purificação da enzima a partir de células humanas permite a ativação enzimática no celulo, o que pode preservar modificações pós-traducionais estimulantes importantes para a plena atividade enzimática. O projeto e a otimização de ensaios enzimáticos recombinantes para telas químicas de alto rendimento têm sido usados com sucesso para identificar e caracterizar inibidores de pequenas moléculas de HAT1.

Protocol

1. Método 1: Produção e purificação do complexo recombinante HAT1/Rbap46 Descongelamento, recuperação e expansão de células HEK293fDescongelar 1-10 milhões de células de mamíferos HEK293f26 em 30 mL de meio de expressão freestyle 293 em um frasco de 100 mL. Incubar em 8% CO2 a 37 °C enquanto gira a 60 rpm. No dia seguinte, conte e verifique a viabilidade da célula e, em seguida, ajuste a velocidade de rotação para 120 rpm. E…

Representative Results

Curvas padrão em duplicata (16 poços) devem ser incluídas em cada placa para garantir o desempenho adequado do ensaio. Os dados da curva padrão devem ser estabelecidos em forma de tabela, com um intervalo de 100% a 0% de acordo com a proporção de peptídeo contendo Pra para peptídeo H4 nativo em solução (Tabela 1). O sinal vermelho de Amplex será o mais alto em poços de peptídeo H4 nativo de 100% pra/0% e o mais baixo em poços de peptídeo H4 nativo de 0% pra/100%. Após a fluorescência ter…

Discussion

Na última década, a química de cliques tornou-se proeminente²⁰, permitindo o projeto preciso de estruturas químicas interagentes. Dentro deste contexto, várias conexões covalentes bioortogonais²¹ têm emergido como opções promissoras para a formação de complexos em seu ambiente natural. A química de cliques emprega pares de grupos funcionais que exibem reações rápidas e seletivas, comumente conhecidas como “reações de clique”. Estas reações ocorrem eficien…

Materials

4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher