Ацетил-клик-химический анализ для измерения ацетилирования гистон-ацетилтрансферазы 1
Summary
Быстрые и точные химические анализы для скрининга специфических ингибиторов являются важным инструментом в арсенале разработки лекарств. Здесь мы представляем масштабируемый химический анализ с ацетиловым щелком для измерения ингибирования активности ацетилирования HAT1.
Abstract
HAT1, также известный как гистон-ацетилтрансфераза 1, играет решающую роль в синтезе хроматина, стабилизируя и ацетилируя зарождающийся H4 перед сборкой нуклеосом. Он необходим для роста опухолей в различных системах, что делает его потенциальной мишенью для лечения рака. Чтобы облегчить идентификацию соединений, которые могут ингибировать ферментативную активность HAT1, мы разработали ацетил-клик-анализ для быстрого скрининга. В этом простом анализе мы используем рекомбинантный HAT1/Rbap46, который очищается от активированных клеток человека. В методе используется аналог ацетил-КоА 4-пентиноил-КоА (4P) в клик-химическом подходе. Это включает в себя ферментативный перенос алкинового ручки через HAT1-зависимую реакцию ацилирования на биотинилированный N4-концевой пептид. Затем захваченный пептид иммобилизуют на нейтравидиновых планшетах с последующей клик-химическим функционализированием с помощью биотина-азида. Затем рекрутирование стрептавидин-пероксидазы используется для окисления амплексного красного, что приводит к количественному выходу флуоресцентного сигнала. Вводя химические ингибиторы во время реакции ацилирования, мы можем количественно оценить ферментативное ингибирование на основе снижения сигнала флуоресценции. Важно отметить, что эта реакция является масштабируемой, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг потенциальных ингибиторов ферментативной активности HAT1.
Introduction
Среди многочисленных эукариотических ацетилтрансфераз HAT1 был исходной гистон-ацетилтрансферазой, которая была выделена 1,2,3. Последующие исследования твердо установили его ключевую роль в репликации хроматина, особенно в синтезе новых нуклеосом во время S-фазы4. Наши исследования привели к признанию того, что HAT1 сильно стимулируется лечением эпидермального фактора роста (EGF) в клетках молочной железы5. Кроме того, выяснилось, что HAT1 необходим для быстрой пролиферации клеток и образования опухолей in vivo 6,7,8,9. Данные указывают на то, что HAT1 имеет решающее значение в координации анаболических и эпигенетических процессов деления клеток, стимулируя рост опухоли.
HAT1 диацетилирует аминоконцевой хвост гистона H4 на лизинах 5 и 12 в комплексе с белком-шапероном Rbap46, который связывает гистон и представляет аминоконцевой конец HAT1. Затем тетрамеры или дисомыгистонов 10 вместе с HAT1/Rbap46 и другими шаперонамигистонов 11 импортируются в ядро. Затем гистоны высвобождаются, чтобы отложиться в репликационной вилке или других местах для поддержки активации или репрессии генов. Функция метки диацетилирования HAT1 на гистон H4 до конца не изучена. Вероятно, он быстро удаляется в течение 15-30 мин под действием гистондеацетилаз 12,13,14,15 после вставки H4 в хроматин. Таким образом, метка диацетилирования HAT1 не размножается в хроматине и может не играть истинной эпигенетической роли, хотя постулируется роль в рекрутировании хроматин-модифицирующих ферментов в зарождающийся хроматин12. Кроме того, HAT1 не ацетилирует хроматин напрямую; Его активность ограничена растворимыми гистонами.
Разработка низкомолекулярных ингибиторов гистон-ацетилтрансферазы затрудняется неспецифическими и малопроизводительными анализами, часто приводящими к образованию биологически реакционноспособных соединений16,17. Золотой стандарт анализа для измерения активности ацетилтрансферазы требует использования 3H-ацетил-коА, что ограничивает пропускную способность и требует облучения. Тем не менее, в последнее время были описаны и подтверждены специфические и высокоэффективные низкомолекулярные ингибиторы ацетилтрансферазы, нацеленные на CBP/p30018 и KAT6A/B19,20 с использованием 3-H-ацетил-КоА. В дальнейшем разрабатываются более совершенные анализы для достижения большей пропускной способности и предотвращения лабораторных опасностей.
Недавние достижения в области мониторинга ацетилирования21 позволили использовать клик-химию для обеспечения мониторинга ферментативных реакций. Существует множество прекурсоров с поддержкой щелчков, которые доступны простыми синтетическими путями или доступны для покупки, которые могут быть включены в ферментативные реакции. Эти реакции, как правило, проводятся в рекомбинантных системах, хотя клеточные анализы также возможны22. Преимущество кофакторов и субстратов с поддержкой щелчков заключается в том, что скрининг может напрямую измерять активность ферментов без необходимости использования связанных систем считывания, которые часто нарушаются просеивающими соединениями и требуют дополнительных действий по обработке. Это позволяет проводить обработку ингибиторами только на ферментативной стадии, в то время как все последующие этапы функционализации и детектирования выполняются после обширной промывки для удаления соединений, что ограничивает возможность возникновения интерференции при анализе. Эти преимущества делают разработку анализов с поддержкой щелчков предпочтительнее связанных анализов, которые обычно полагаются на обнаружение свободного коэнзима А.
Одним из важных соображений является принятие кофакторов, включенных щелчками, в активный центр фермента. Существующие кофакторы с поддержкой кликов могут быть не полностью совместимы с активным сайтом, оптимизированным для собственного кофактора. Структурная информация и моделирование могут быть использованы для разработки аминокислотных замен для увеличения активного центра для включения измененных субстратов23. Это может позволить проводить скрининг с улучшенной кинетикой ферментов и более низкими уровнями субстратов и ферментов. Недостаток этого подхода заключается в том, что измененные каталитические карманы могут не идентифицировать ингибиторы, которые сильно взаимодействуют с нативным ферментом. В конечном счете, для выявления и валидации потенциальных ингибиторов ферментов требуется комбинация подходов.
В данной статье мы опишем метод, разработанный для очистки и анализа активности фермента HAT1 с использованием клик-кофактора 4-пентиноил-КоА24. В этом анализе (рис. 1) последовательность нативного фермента используется в комплексе с его необходимым партнерским белком Rbap46, который, как было показано, повышает активность фермента. Очистка фермента из клеток человека позволяет активировать фермент в целлюло, что может сохранить стимулирующие посттрансляционные модификации, важные для полной активности фермента. Разработка и оптимизация анализов рекомбинантных ферментов для высокопроизводительных химических скринингов были успешно использованы для идентификации и характеристики низкомолекулярных ингибиторов HAT1.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последнее десятилетие клик-химиястала широко распространенной, позволив точно проектировать взаимодействующие химические структуры. В этом контексте различные биоортогональные ковалентные связи21 стали перспективными вариантами формирования комплексов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джорджа Чжэна (George Zheng) за предоставление H4K12CoA. Мы благодарим сотрудников Gruber Lab за полезные дискуссии и отзывы. Мы благодарим за поддержку NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) и V Foundation (V2022-022).
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
- Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
- Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
- Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
- Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
- Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
- Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
- Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
- Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
- Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
- Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
- Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
- Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
- Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
- Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
- Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
- Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
- He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
- Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
- Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
- Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
- Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
- Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
- Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
- Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
