Summary
يعد استعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) في الغلاف الجذري أمرا ضروريا لتأثيره المعزز للنمو. من الضروري توحيد طريقة الكشف عن استعمار الجذور البكتيرية. هنا ، نصف طريقة قابلة للتكرار لقياس الاستعمار البكتيري على سطح الجذر.
Abstract
يعد قياس الاستعمار البكتيري على جذر Arabidopsis thaliana أحد أكثر التجارب شيوعا في دراسات التفاعل بين النبات والميكروب. طريقة موحدة لقياس الاستعمار البكتيري في الجذور ضرورية لتحسين التكاثر. قمنا أولا بزراعة A.thaliana المعقمة في ظروف الزراعة المائية ثم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدرهOD 600 من 0.01. في 2 أيام بعد التلقيح ، تم حصاد أنسجة الجذر وغسلها ثلاث مرات في الماء المعقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. ثم تم وزن الجذور ، وتم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر بواسطة دوامة. تم تخفيف تعليق الخلية في تدرج مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا بالطلاء على وسط أجار Luria-Bertani (LB). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، وبعد ذلك ، تم عد المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها للإشارة إلى الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن الاستعمار البكتيري في الجذور في ظروف التفاعل الأحادي ، مع قابلية استنساخ جيدة.
Introduction
هناك طرق كمية ونوعية للكشف عن استعمار الجذور بواسطة سلالة بكتيرية واحدة. بالنسبة للطريقة النوعية ، يجب استخدام سلالة تعبر بشكل أساسي عن التألق ، ويجب فحص توزيع التألق وشدته تحت المجهر الفلوري أو أدوات البؤر بالليزر 1,2. يمكن أن تعكس هذه الاستراتيجيات الاستعمار البكتيري في الموقع3 ، لكنها ليست دقيقة مثل طرق عد الألواح التقليدية في القياس الكمي. إلى جانب ذلك ، نظرا لمحدودية عرض مناطق الجذر الجزئية فقط تحت المجهر ، يمكن أن تتأثر أحيانا بالتحيز الذاتي.
هنا ، نصف طريقة كمية ، والتي تتضمن جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة وعد وحدات CFU البكتيرية على طبق. تعتمد هذه الطريقة على التخفيف والطلاء الذي يمكن من خلاله حساب السلالات المستعمرة التي تم تجريدها من جذور النباتات ، ويمكن حساب إجمالي عدد البكتيريا المستعمرة على الجذر 4,5.
أولا ، تم استزراع A. thaliana في ظروف الزراعة المائية ، ثم تم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدره 0.01 OD600. تم حصاد الأنسجة الجذرية المصابة 2 أيام بعد التلقيح وغسلها في ماء معقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. علاوة على ذلك ، تم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر ، وتخفيفها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومطلي على وسط أجار Luria-Bertani (LB). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، تم حساب المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها لتحديد الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور.
هذه الطريقة قابلة للتطبيق بدرجة كبيرة ، ولديها قابلية تكرار جيدة ، وهي أكثر ملاءمة لتحديد الاستعمار البكتيري الجذري بدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الزراعة المائية المعقمة A. thaliana
- تحضير شتلات A. thaliana .
- تحضير وسط شتلات A. thaliana المستزرع والذي يتكون من وسط 1/2 MS (Murashige و Skoog) مع 2٪ (وزن / حجم) سكروز و 0.9٪ (وزن / مجلد) أجار.
- صب وسط التعقيم المحضر في أطباق بتري مربعة معقمة (13 سم × 13 سم) قبل التصلب. تجنب تجفيف الهواء للحفاظ على الرطوبة.
- اغمر بذور A. thaliana في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب 1 مل من الماء المعقم عند 4 درجات مئوية لأكثر من 12 ساعة ، ثم عقم البذور ب 1 مل من 2٪ (حجم / حجم) كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين.
- اغسل البذور جيدا بالماء المعقم ست مرات لإزالة محلول كلوريد الصوديوم. زرع البذور على أطباق بتري مع MS أجار المتوسطة مع طرف معقم 1 مل.
- ختم أطباق بتري مع شريط طبي تنفس ووضعها عموديا في حاضنة خفيفة لتنمو لمدة 1 أسبوع. اضبط نسبة حاضنة الضوء ليلا ونهارا على 16 ساعة / 8 ساعات ، وحافظ على درجة الحرارة عند 23 درجة مئوية والرطوبة عند 40٪ -60٪.
- زرع A. ثاليانا.
- قطع ثقوب 5 مم على صبغة خلية بحجم 40 ميكرومتر وتعقيمها.
- زرع ثلاثة نباتات A. thaliana عمرها 7 أيام من خلال ثقوب مصفاة خلية ووضعها في صفيحة من 6 آبار تحتوي على 3 مل من السائل المعقم 1/2 MS وسط مع 0.5٪ سكروز.
- ضع الألواح المكونة من 6 آبار في حاضنة خفيفة (الشكل 1 أ) واحتضانها لمدة 10 أيام.
2. زراعة البكتيريا وتلقيحها
- تحضير تعليق بكتيري للتلقيح.
- بالنسبة ل Bacillus velezensis ، قم بتلقيح الخلايا البكتيرية في وسط LB معقم واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 170 دورة في الدقيقة حتى تصل إلىOD 600 من 0.8-1.2.
- جمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 6000 × غرام لمدة دقيقتين وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت PBS (2 mM KH2PO4 ، 8 mMNa 2HPO4 ، 136 mM NaCl ، 2.6 mM KCl). كرر خطوات الطرد المركزي والتعليق 3 مرات لإزالة وسط LB والمستقلبات البكتيرية.
- تعليق خلايا البكتيريا في وسط جديد 1/2 مللي ثانية عند تركيز نهائي من OD600 0.01. تلقيح معلقات البكتيريا إلى لوحات 6 آبار التي تنمو شتلات A. thaliana ، ووضع لوحات 6 آبار في حاضنة الضوء ، وزراعتها لمدة 2 أيام.
3. قياس البكتيريا المستعمرة على الجذور
- حصاد أنسجة الجذر ولوحة الخلايا المستعمرة.
ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات في ظل ظروف جنوتوبيوتيك- وزن أنابيب 2 مل وسجل الوزن ك W0.
- حصاد الأنسجة الجذرية A. thaliana المشتركة وغسلها في الماء المعقم 3 مرات. ضع الجذر على ورق الترشيح لإزالة الماء الزائد.
- ضع الجذر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الموزون ، وقم بوزن الجذور مع الأنبوب ، وقم بتسجيله ك W1.
- أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب ودوامة الأنابيب لمدة 8 دقائق بأقصى سرعة.
- تمييع المعلقات مع الخلايا البكتيرية المستعمرة الجذر التي تم جمعها إلى 1 × 10-1-1 × 10-4 (وفقا لقدرة استعمار البكتيريا). انشر المعلقات البكتيرية المخففة على ألواح تحتوي على وسط أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.
- عد المستعمرات وتطبيع البيانات.
- عد المستعمرات البكتيرية على ألواح LB.
- احسب وحدات CFU وفقا للتخفيف المقابل وقم بتطبيع البيانات بوزن جذر جديد (W1-W 0). تشير النتائج النهائية إلى عدد الخلايا البكتيرية المستعمرة لكل جرام من الجذر في يومين بعد التلقيح (الشكل 1 ب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاختبار دقة قدرة استعمار البكتيريا المكتشفة بهذه الطريقة في جذمور A. thaliana ، قمنا بتلقيح Bacillus velezensis SQR9 WT ومتحولة مشتقة Δ8mcp في A. thaliana rhizzosphere بشكل منفصل. Δ8mcp هو متحولة تفتقر إلى جميع جينات تشفير المستقبلات الكيميائية ، ولها استعمار منخفض بشكل ملحوظ6. قمنا بقياس استعمارهم في 2 أيام بعد التلقيح بواسطة مقايسة استعمار الجذر الحالية. أظهرت النتائج انخفاضا كبيرا في استعمار الجذر ل Δ8mcp ، مما يشير إلى أن هذه الحالة والطريقة تقيس بشكل فعال استعمار البكتيريا (الشكل 1C).
الشكل 1: زراعة A. thaliana والاستعمار الجذري ل Bacillus velezensis SQR9 و Δ8mcp. (أ) المنظر العلوي ل A. thaliana البالغ من العمر 7 أيام ينمو في ألواح ذات 6 آبار مع صبغة خلوية في حالة الزراعة المائية. (ب) المنظر الجانبي ل A. thaliana البالغ من العمر 7 أيام وهو ينمو في 6 أطباق من 6 آبار ، تحتوي كل بئر على 3 شتلات. (ج) استعمار B. velezensis من النوع البري SQR9 و Δ8mcp المقاس باستخدام الفحص المقدم. تم تضمين ستة نسخ متماثلة ، ويتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتحقيق قابلية استنساخ جيدة ، هناك أربع خطوات حاسمة لعملية الكشف عن الاستعمار لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري التأكد من أن عدد خلايا البكتيريا الملقحة هو نفسه تماما في كل تجربة. ثانيا ، من الضروري أيضا التحكم في كثافة تنظيف البكتيريا غير المستعمرة بالماء المعقم. ثالثا ، يجب أن تكون كل عملية تخفيف للعينة دوامة قبل إجراؤها للسماح للعينة بأن تكون في حالة خلط كاملة لتجنب أخطاء الامتصاص بسبب خصائص البكتيريا التي يسهل غرقها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. لذلك ، نوصي باستخدام أداة دوامة لخلط التعليق البكتيري قبل كل امتصاص. رابعا ، يجب ضمان التعقيم بدقة أثناء جميع العمليات باستخدام هذه الطريقة لتجنب أي احتمال للتلوث.
تستخدم هذه الطريقة لتحديد البكتيريا المستعمرة على سطح الجذر. باستثناء بكتيريا سطح الجذر ، تستعمر البكتيريا الداخلية والفطريات أيضا جذور النبات7. لا يزال من الممكن اكتشاف قدرة استعمار البكتيريا الداخلية باستخدام البروتوكول الموضح في هذه الورقة ، ولكن يجب أن يكون نسيج الجذر مطحونا لإطلاق البكتيريا الداخلية. ومع ذلك ، فإن الفطريات الداخلية تختلف عن البكتيريا. تستخدم معظم الطرق السائدة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لمراقبة نمو الخيوط الفطرية ، وهي طريقة كشف نوعي مشابهة لبكتيريا وضع العلامات الفلورية للتصور8.
عند مقارنة استعمار سلالات مختلفة ، لا ينبغي تلقيحها في صفيحة واحدة من 6 آبار لتجنب تأثير المركبات المتطايرة البكتيرية9 والمركبات المتطايرة النباتية10,11. اخترنا يومين بعد التلقيح للكشف عن الجذر لأن استعمار SQR9 وصل إلى الحد الأقصى بين 2 و 4 أيام ؛ يمكن ضبط وقت الكشف عن الاستعمار البكتيري وفقا للسلالات.
بالمقارنة مع الطرق الموصوفة الأخرى ، فإن هذه الطريقة دقيقة وسهلة التشغيل. على سبيل المثال ، الطريقة التي وصفها Noam et al. لديها أرابيدوبسيس صلب النمو ملقح بالبكتيريا فور زرعه في حالة الزراعة المائية12,13. هنا ، نقترح تلقيح البكتيريا في الجذور بعد عدة أيام من الزرع لتجنب تأثير تكيف النبات مع بيئة النمو المتغيرة. الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة جيدة أيضا للنباتات لإطلاق إفرازات الجذر ، مما يؤثر على الاستعمار.
للسماح لبراعم النبات بالنمو بشكل منفصل في الهواء وبعيدا تماما عن الغمر السائل ، أجرينا بعض التعديلات الطفيفة والمعالجة على صبغة الخلية لإتاحتها لهذه الطريقة المائية. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة أكثر ملاءمة لتحديد الاستعمار البكتيري بدقة بكميات صغيرة ولكن ليس للكميات الكبيرة من إفرازات الجذر التي تم جمعها في الزراعة المائية14. من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة تم تعديلها بناء على الدراسات المنشورة مسبقا12،14،15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32370135) ، وبرنامج الابتكار التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية (CAAS-CSAL-202302) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا لكلية جيانغسو المهنية للزراعة والغابات (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
