Summary
La colonizzazione dei rizobatteri che promuovono la crescita delle piante (PGPR) nella rizosfera è essenziale per il suo effetto di promozione della crescita. È necessario standardizzare il metodo di rilevamento della colonizzazione batterica della rizosfera. Qui descriviamo un metodo riproducibile per quantificare la colonizzazione batterica sulla superficie della radice.
Abstract
La misurazione della colonizzazione batterica sulla radice di Arabidopsis thaliana è uno degli esperimenti più frequenti negli studi di interazione pianta-microbi. Un metodo standardizzato per misurare la colonizzazione batterica nella rizosfera è necessario per migliorare la riproducibilità. Abbiamo prima coltivato A.thaliana sterile in condizioni idroponiche e poi abbiamo inoculato le cellule batteriche nella rizosfera a una concentrazione finale di OD600 di 0,01. A 2 giorni dall'inoculazione, il tessuto radicale è stato raccolto e lavato tre volte in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Le radici sono state quindi pesate e le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte a vortice. La sospensione cellulare è stata diluita in un gradiente con un tampone salino tamponato con fosfato (PBS), seguito da una placcatura su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 10 ore, quindi le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per indicare le cellule batteriche colonizzate sulle radici. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la colonizzazione batterica nella rizosfera in condizioni di mono-interazione, con una buona riproducibilità.
Introduction
Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l'intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser 1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ3, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della limitazione di visualizzare solo zone radicali parziali al microscopio, a volte può essere influenzato da pregiudizi soggettivi.
Qui descriviamo un metodo quantitativo, che include la raccolta delle cellule batteriche colonizzate e il conteggio delle CFU batteriche su una piastra. Questo metodo si basa sulla diluizione e sulla placcatura mediante la quale è possibile contare i ceppi colonizzati che sono stati strappati dalle radici delle piante e calcolare il numero totale di batteri colonizzati sulla radice 4,5.
In primo luogo, A. thaliana è stata coltivata in condizioni idroponiche, quindi le cellule batteriche sono state inoculate nella rizosfera a una concentrazione finale di 0,01 OD600. I tessuti radicali infetti sono stati raccolti 2 giorni dopo l'inoculazione e lavati in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Inoltre, le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte, diluite in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e piastrate su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Dopo l'incubazione a 37 °C per 10 ore, le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per determinare le cellule batteriche colonizzate sulle radici.
Questo metodo è altamente applicabile, ha una buona ripetibilità ed è più adatto per un'accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.
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Protocol
1. Coltivazione idroponica sterile di A. thaliana
- Prepara le piantine di A. thaliana .
- Preparare il terreno di coltura delle piantine di A. thaliana , che consiste in 1/2 terreno MS (Murashige e Skoog) con il 2% (wt/vol) di saccarosio e lo 0,9% (wt/vol) di agar.
- Versare il terreno di sterilizzazione preparato in piastre di Petri quadrate sterili (13 cm x 13 cm) prima della solidificazione. Evitare l'asciugatura all'aria per mantenere l'umidità.
- Immergere i semi di A. thaliana in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con 1 ml di acqua sterile a 4 °C per oltre 12 ore, quindi sterilizzare i semi con 1 ml di NaClO al 2% (vol/vol) per 2 minuti.
- Lavare accuratamente i semi con acqua sterile sei volte per rimuovere la soluzione di NaClO. Semina i semi su piastre di Petri con terreno di coltura MS agar con punta sterile da 1 ml.
- Sigilla le piastre di Petri con nastro medico traspirante e mettile verticalmente in un'incubatrice leggera per crescere per 1 settimana. Impostare il rapporto giorno/notte dell'incubatrice luminosa a 16 h/8 h, mantenere la temperatura a 23 °C e l'umidità al 40%-60%.
- Trapiantare A. thaliana.
- Tagliare fori da 5 mm su un coloratore per cellule con pori da 40 μm e sterilizzarli.
- Trapiantare tre piante di A. thaliana di 7 giorni attraverso i fori di un colino cellulare e metterle in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 ml di terreno liquido sterile 1/2 MS con saccarosio allo 0,5%.
- Posizionare le piastre a 6 pozzetti in un'incubatrice leggera (Figura 1A) e incubare per 10 giorni.
2. Coltivazione e inoculazione di batteri
- Preparare la sospensione batterica per l'inoculazione.
- Per il Bacillus velezensis, inoculare le cellule batteriche in terreno LB sterile e incubare a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere OD600 di 0,8-1,2.
- Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 6000 x g per 2 min e risospendere le cellule in tampone PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione 3 volte per rimuovere il terreno LB e i metaboliti batterici.
- Sospendere le cellule batteriche in un terreno fresco di 1/2 MS ad una concentrazione finale di OD600 0,01. Inoculare le sospensioni batteriche nelle piastre a 6 pozzetti che coltivano piantine di A. thaliana , posizionare le piastre a 6 pozzetti nell'incubatrice leggera e coltivarle per 2 giorni.
3. Misurazione dei batteri colonizzati sulle radici
- Raccogliere il tessuto radicale e placcare le cellule colonizzate.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere condotti in condizioni gnotobiotiche- Pesare le provette da 2 ml e registrare il peso come W0.
- Raccogliere i tessuti radicali di A. thaliana co-coltivati e lavarli in acqua sterile 3 volte. Metti la radice su carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso.
- Mettere la radice nella provetta da microcentrifuga pesata, pesare le radici insieme alla provetta e registrarla come W1.
- Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna provetta e far vorticare le provette per 8 minuti alla massima velocità.
- Diluire le sospensioni con le cellule batteriche colonizzate dalle radici raccolte a 1 x 10-1-1 x 10-4 (in base alla capacità di colonizzazione batterica). Stendere le sospensioni batteriche diluite su piastre contenenti terreno di agar LB e incubare a 37 °C per 10 ore.
- Contare le colonie e normalizzare i dati.
- Contare le colonie batteriche sulle piastre LB.
- Calcolare i CFU in base alla diluizione corrispondente e normalizzare i dati con peso fresco radicale (W1-W 0). I risultati finali indicano il conteggio delle cellule batteriche colonizzate per grammo di radice a 2 giorni dall'inoculazione (Figura 1B).
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Representative Results
Per testare l'accuratezza della capacità di colonizzazione batterica rilevata con questo metodo nella rizosfera di A. thaliana, abbiamo inoculato separatamente Bacillus velezensis SQR9 WT e un mutante derivato Δ8mcp nella rizosfera di A. thaliana . Il Δ8mcp è un mutante che manca di tutti i geni codificanti i chemocettori e ha una colonizzazione significativamente ridotta6. Abbiamo misurato la loro colonizzazione a 2 giorni dopo l'inoculazione con l'attuale test di colonizzazione radicale. I risultati hanno mostrato una significativa riduzione della colonizzazione radicale di Δ8mcp, indicando che questa condizione e questo metodo misurano efficacemente la colonizzazione batterica (Figura 1C).
Figura 1: Coltivazione di A. thaliana e colonizzazione radicale di Bacillus velezensis SQR9 e Δ8mcp. (A) La vista dall'alto di A. thaliana di 7 giorni che cresce in piastre a 6 pozzetti con coloratore di cellule in condizioni idroponiche. (B) La vista laterale di A. thaliana di 7 giorni che cresce in piastre a 6 pozzetti, ogni pozzetto contenente 3 piantine. (C) Colonizzazione di B. velezensis wild-type SQR9 e Δ8mcp misurata utilizzando il saggio presentato. Sono state incluse sei repliche e i dati sono presentati come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per ottenere una buona riproducibilità, ci sono quattro passaggi critici per il processo di rilevamento della colonizzazione di questo protocollo. In primo luogo, è necessario assicurarsi che il numero di cellule batteriche inoculate sia esattamente lo stesso in ogni esperimento. In secondo luogo, è necessario anche controllare l'intensità di pulizia dei batteri non colonizzati con acqua sterile. In terzo luogo, ogni processo di diluizione del campione deve essere agitato prima di essere eseguito per lasciare che il campione sia in uno stato di miscelazione completo per evitare gli errori di assorbimento dovuti alle caratteristiche dei batteri che sono facili da affondare nella provetta della microcentrifuga. Pertanto, si consiglia di utilizzare uno strumento a vortice per miscelare la sospensione batterica prima di ogni assorbimento. In quarto luogo, l'asepsi dovrebbe essere rigorosamente garantita durante tutte le operazioni che utilizzano questo metodo per evitare qualsiasi possibilità di contaminazione.
Questo metodo viene utilizzato per determinare i batteri colonizzati sulla superficie della radice. Tranne che i batteri della superficie radicale, i batteri endofiti e i funghi colonizzano anche la rizosfera della pianta7. La capacità di colonizzazione dei batteri endofiti può ancora essere rilevata utilizzando il protocollo descritto in questo documento, ma il tessuto radicale deve essere macinato per rilasciare batteri endofiti. Tuttavia, i funghi endofiti sono diversi dai batteri. La maggior parte dei metodi tradizionali utilizza la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per osservare la crescita delle ife, che è un metodo di rilevamento qualitativo simile ai batteri di marcatura fluorescente per la visualizzazione8.
Quando si confronta la colonizzazione di ceppi diversi, non dovrebbero essere inoculati in una piastra a 6 pozzetti per evitare l'influenza dei composti volatili batterici9 e dei composti volatili vegetali10,11. Abbiamo scelto 2 giorni dopo l'inoculazione per rilevare la radice perché la colonizzazione di SQR9 ha raggiunto il massimo tra 2 e 4 giorni; Il tempo per rilevare la colonizzazione batterica può essere regolato in base ai ceppi.
Rispetto ad altri metodi descritti, questo metodo è accurato e facile da usare. Ad esempio, il metodo descritto da Noam et al. prevede che l'arabidopsis cresciuta in massa solida venga inoculata con batteri immediatamente quando viene trapiantata in condizioni idroponiche12,13. Qui, proponiamo che i batteri vengano inoculati nella rizosfera dopo diversi giorni di trapianto per evitare l'influenza dell'adattamento delle piante al mutato ambiente di crescita. Il metodo descritto in questo studio è utile anche per le piante per rilasciare essudato radicale, che influisce sulla colonizzazione.
Per far crescere i germogli delle piante separatamente nell'aria e completamente lontani dall'immersione liquida, abbiamo apportato alcune piccole modifiche e lavorazioni al coloratore cellulare per renderli disponibili per questo metodo idroponico. Inoltre, questo metodo è più adatto per la determinazione accurata della colonizzazione batterica in piccole quantità ma non per grandi quantità di essudati radicali raccolti in idrocoltura14. È importante notare che questo metodo è modificato sulla base di studi precedentemente pubblicati 12,14,15.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (32370135), dal Programma di innovazione dell'Accademia cinese delle scienze agricole (CAAS-CSAL-202302), dal Progetto scientifico e tecnologico del Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
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