Summary
La colonisation des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) dans la rhizosphère est essentielle à son effet favorisant la croissance. Il est nécessaire d’uniformiser la méthode de détection de la colonisation de la rhizosphère bactérienne. Nous décrivons ici une méthode reproductible pour quantifier la colonisation bactérienne à la surface des racines.
Abstract
La mesure de la colonisation bactérienne sur la racine d’Arabidopsis thaliana est l’une des expériences les plus fréquentes dans les études d’interaction plante-microbe. Une méthode standardisée de mesure de la colonisation bactérienne dans la rhizosphère est nécessaire pour améliorer la reproductibilité. Nous avons d’abord cultivé des A. thaliana stériles dans des conditions hydroponiques, puis nous avons inoculé les cellules bactériennes dans la rhizosphère à une concentration finale deDO 600 de 0,01. 2 jours après l’inoculation, le tissu racinaire a été récolté et lavé trois fois dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. Les racines ont ensuite été pesées, et les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été collectées par vortex. La suspension cellulaire a été diluée en gradient avec un tampon salin tamponné au phosphate (PBS), suivie d’un placage sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 10 h, puis les colonies individuelles sur les plaques LB ont été comptées et normalisées pour indiquer les cellules bactériennes colonisées sur les racines. Cette méthode est utilisée pour détecter la colonisation bactérienne dans la rhizosphère dans des conditions de mono-interaction, avec une bonne reproductibilité.
Introduction
Il existe des méthodes quantitatives et qualitatives pour détecter la colonisation de la rhizosphère par une seule souche bactérienne. Pour la méthode qualitative, il faut utiliser une souche qui exprime constitutivement la fluorescence, et la distribution et l’intensité de la fluorescence doivent être examinées à l’aide d’instruments de microscopie à fluorescence ou d’instruments confocaux laser 1,2. Ces stratégies peuvent bien refléter la colonisation bactérienne in situ3, mais elles ne sont pas aussi précises que les méthodes traditionnelles de comptage sur plaque en matière de quantification. De plus, en raison de la limitation de l’affichage de zones racinaires partielles au microscope, elle peut parfois être influencée par un biais subjectif.
Ici, nous décrivons une méthode quantitative, qui comprend la collecte des cellules bactériennes colonisées et le comptage des UFC bactériennes sur une plaque. Cette méthode est basée sur la dilution et le placage par lesquels les souches colonisées qui ont été retirées des racines des plantes peuvent être comptées, et le nombre total de bactéries colonisées sur la racine peut être calculé 4,5.
Tout d’abord, A. thaliana a été cultivé dans des conditions hydroponiques, puis des cellules bactériennes ont été inoculées dans la rhizosphère à une concentration finale de 0,01 OD600. Les tissus racinaires infectés ont été récoltés 2 jours après l’inoculation et lavés dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. De plus, les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été recueillies, diluées dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et plaquées sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Après une incubation à 37 °C pendant 10 h, des colonies individuelles sur des plaques LB ont été comptées et normalisées pour déterminer les cellules bactériennes colonisées sur les racines.
Cette méthode est très applicable, a une bonne répétabilité et est plus adaptée à la détermination précise de la colonisation bactérienne de la rhizosphère.
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Protocol
1. Culture hydroponique stérile d’A. thaliana
- Préparez les plants d’A. thaliana .
- Préparez le milieu de culture des semis d’A. thaliana , qui se compose de 1/2 milieu MS (Murashige et Skoog) avec 2 % (poids/vol) de saccharose et 0,9 % (poids/volume) de gélose.
- Verser le milieu de stérilisation préparé dans des boîtes de Pétri carrées stériles (13 cm x 13 cm) avant la solidification. Évitez le séchage à l’air pour maintenir l’humidité.
- Immerger les graines d’A. thaliana dans un tube de microcentrifugation de 2 mL rempli de 1 mL d’eau stérile à 4 °C pendant plus de 12 h, puis stériliser les graines avec 1 mL de NaClO à 2 % (vol/vol) pendant 2 min.
- Lavez soigneusement les graines avec de l’eau stérile six fois pour éliminer la solution de NaClO. Semez les graines sur des boîtes de Pétri avec un milieu gélosé MS avec une pointe stérile de 1 mL.
- Scellez les boîtes de Pétri avec du ruban médical respirant et placez-les verticalement dans un incubateur léger pour qu’elles poussent pendant 1 semaine. Réglez le rapport jour/nuit de l’incubateur de lumière sur 16 h/8 h, maintenez la température à 23 °C et l’humidité à 40%-60%.
- Repiquage A. thaliana.
- Découpez des trous de 5 mm sur un colorateur de cellules de 40 μm et stérilisez-les.
- Transplantez trois plants d’A. thaliana âgés de 7 jours dans les trous d’une passoire cellulaire et placez-les dans une plaque à 6 puits contenant 3 mL de milieu liquide stérile 1/2 MS avec 0,5 % de saccharose.
- Placez les plaques à 6 puits dans un incubateur léger (figure 1A) et incubez pendant 10 jours.
2. Culture et inoculation de bactéries
- Préparez une suspension bactérienne pour l’inoculation.
- Pour Bacillus velezensis, inoculer des cellules bactériennes dans un milieu LB stérile et incuber à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce qu’il atteigneune OD 600 de 0,8-1,2.
- Prélever les cellules bactériennes par centrifugation à 6000 x g pendant 2 min et remettre les cellules en suspension dans un tampon PBS (2 mM KH,2PO4, 8 mM Na,2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Répétez les étapes de centrifugation et de remise en suspension 3 fois pour éliminer le milieu LB et les métabolites bactériens.
- Mettre en suspension les cellules bactériennes dans un milieu frais 1/2 MS à une concentration finale deOD 600 0,01. Inoculez les suspensions de bactéries aux plaques à 6 puits qui font pousser les semis d’A. thaliana , placez les plaques à 6 puits dans l’incubateur léger et cultivez-les pendant 2 jours.
3. Mesurer les bactéries colonisées sur les racines
- Récoltez le tissu racinaire et mettez en plaque les cellules colonisées.
REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions gnotobiotiques- Pesez les tubes de 2 ml et notez le poids comme W0.
- Récoltez les tissus racinaires d’A. thaliana co-cultivés et lavez-les 3 fois dans de l’eau stérile. Placez la racine sur du papier filtre pour enlever l’excès d’eau.
- Placez la racine dans le tube de microcentrifugation pesé, pesez les racines avec le tube et enregistrez-le en W1.
- Ajoutez 1 mL de PBS dans chaque tube et agitez les tubes pendant 8 min à la vitesse maximale.
- Diluer les suspensions avec les cellules bactériennes colonisées par les racines collectées à 1 x 10-1-1 x 10-4 (selon la capacité de colonisation bactérienne). Étaler les suspensions bactériennes diluées sur des plaques contenant du milieu gélosal LB et incuber à 37 °C pendant 10 h.
- Comptez les colonies et normalisez les données.
- Comptez les colonies bactériennes sur des plaques LB.
- Calculer les UFC en fonction de la dilution correspondante et normaliser les données avec le poids frais des racines (W1-W 0). Les résultats finaux indiquent le nombre de cellules bactériennes colonisées par gramme de racine 2 jours après l’inoculation (figure 1B).
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Representative Results
Pour tester la précision de la capacité de colonisation bactérienne détectée par cette méthode dans la rhizosphère d’A. thaliana, nous avons inoculé séparément Bacillus velezensis SQR9 WT et un mutant dérivé Δ8mcp dans la rhizosphère d’A . thaliana . Le Δ8mcp est un mutant qui n’a pas tous les gènes codant pour les chimiorécepteurs, et il a une colonisation significativement diminuée6. Nous avons mesuré leur colonisation 2 jours après l’inoculation par le test actuel de colonisation des racines. Les résultats ont montré une réduction significative de la colonisation racinaire de Δ8mcp, indiquant que cette condition et cette méthode mesurent efficacement la colonisation bactérienne (Figure 1C).
Figure 1 : Culture d’A. thaliana et colonisation racinaire de Bacillus velezensis SQR9 et Δ8mcp. (A) La vue de dessus d’A. thaliana âgée de 7 jours poussant dans des plaques à 6 puits avec un colorant cellulaire dans des conditions hydroponiques. (B) La vue latérale d’A. thaliana, âgée de 7 jours, poussant dans des plaques à 6 puits, chaque puits contenant 3 semis. (C) Colonisation de B. velezensis de type sauvage SQR9 et Δ8mcp mesurée à l’aide de l’essai présenté. Six répétitions ont été incluses, et les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Pour obtenir une bonne reproductibilité, il y a quatre étapes critiques pour le processus de détection de la colonisation de ce protocole. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que le nombre de cellules bactériennes inoculées est exactement le même dans chaque expérience. Deuxièmement, il est également nécessaire de contrôler l’intensité du nettoyage des bactéries non colonisées avec de l’eau stérile. Troisièmement, chaque processus de dilution d’échantillon doit être vortex avant d’être effectué pour permettre à l’échantillon d’être dans un état de mélange complet afin d’éviter les erreurs d’absorption dues aux caractéristiques des bactéries qui sont faciles à couler dans le tube de microcentrifugation. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser un instrument vortex pour mélanger la suspension bactérienne avant chaque absorption. Quatrièmement, l’asepsie doit être strictement assurée pendant toutes les opérations utilisant cette méthode afin d’éviter toute possibilité de contamination.
Cette méthode est utilisée pour déterminer les bactéries colonisées à la surface des racines. À l’exception des bactéries de surface racinaire, les bactéries endophytes et les champignons colonisent également la rhizosphère végétale7. La capacité de colonisation des bactéries endophytes peut toujours être détectée en utilisant le protocole décrit dans cet article, mais le tissu racinaire doit être broyé pour libérer les bactéries endophytes. Cependant, les champignons endophytes sont différents des bactéries. La plupart des méthodes courantes utilisent la microscopie électronique à transmission (MET) pour observer la croissance des hyphes, qui est une méthode de détection qualitative similaire à celle des bactéries de marquage fluorescent pour la visualisation8.
Lorsque l’on compare la colonisation de différentes souches, elles ne doivent pas être inoculées dans une plaque à 6 puits pour éviter l’influence des composés volatils bactériens9 et des composés volatils végétaux10,11. Nous avons choisi 2 jours après l’inoculation pour la détection de la racine car la colonisation de SQR9 a atteint son maximum entre 2 et 4 jours ; Le temps de détection de la colonisation bactérienne peut être ajusté en fonction des souches.
Comparée à d’autres méthodes décrites, cette méthode est précise et facile à utiliser. Par exemple, la méthode décrite par Noam et al. consiste à inoculer des bactéries à l’arabidopsis cultivé en plein état lorsqu’il est transplanté dans une condition hydroponique12,13. Ici, nous proposons que les bactéries soient inoculées à la rhizosphère après plusieurs jours de repiquage pour éviter l’influence de l’adaptation de la plante à l’environnement de croissance modifié. La méthode décrite dans cette étude est également bonne pour que les plantes libèrent de l’exsudat racinaire, ce qui affecte la colonisation.
Pour permettre aux pousses de plantes de pousser séparément dans l’air et complètement à l’abri de l’immersion liquide, nous avons apporté quelques modifications mineures et un traitement sur le colorateur cellulaire pour les rendre disponibles pour cette méthode hydroponique. De plus, cette méthode est plus adaptée pour la détermination précise de la colonisation bactérienne en petites quantités, mais pas pour de grandes quantités d’exsudats racinaires collectés en hydroculture14. Il est important de noter que cette méthode est modifiée sur la base d’études publiées antérieurement 12,14,15.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32370135), le Programme d’innovation de l’Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS-CSAL-202302), le Projet scientifique et technologique du Collège professionnel d’agriculture et de foresterie du Jiangsu (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
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