Summary
राइजोस्फीयर में पौधे की वृद्धि को बढ़ावा देने वाले राइजोबैक्टीरिया (PGPR) का उपनिवेशण इसके विकास को बढ़ावा देने वाले प्रभाव के लिए आवश्यक है। बैक्टीरियल राइजोस्फीयर उपनिवेशण का पता लगाने की विधि को मानकीकृत करना आवश्यक है। यहां, हम जड़ की सतह पर बैक्टीरिया के उपनिवेशण की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
Arabidopsis thaliana जड़ पर बैक्टीरियल उपनिवेशण को मापना पौधे-सूक्ष्म जीव बातचीत के अध्ययन में सबसे लगातार प्रयोगों में से एक है। प्रजनन क्षमता में सुधार के लिए राइजोस्फीयर में बैक्टीरियल उपनिवेशण को मापने के लिए एक मानकीकृत विधि आवश्यक है। हमने पहले हाइड्रोपोनिक स्थितियों में बाँझ A.thaliana को सुसंस्कृत किया और फिर 0.01 के OD600 की अंतिम एकाग्रता में राइजोस्फीयर में बैक्टीरिया कोशिकाओं को टीका लगाया। टीकाकरण के बाद 2 दिनों में, जड़ ऊतक काटा गया था और बाँझ पानी में तीन बार धोया गया था ताकि अनकोलोनाइज्ड बैक्टीरिया कोशिकाओं को हटाया जा सके। जड़ों को तब तौला गया था, और जड़ पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को भंवर द्वारा एकत्र किया गया था। सेल निलंबन एक फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर के साथ एक ढाल में पतला था, इसके बाद एक लुरिया-बर्टानी (एलबी) अगर माध्यम पर चढ़ाना था। प्लेटों को 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और फिर, एलबी प्लेटों पर एकल कालोनियों को गिना गया और जड़ों पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को इंगित करने के लिए सामान्यीकृत किया गया। इस विधि का उपयोग मोनो-इंटरैक्शन स्थितियों में राइजोस्फीयर में बैक्टीरिया के उपनिवेशण का पता लगाने के लिए किया जाता है, जिसमें अच्छी प्रजनन क्षमता होती है।
Introduction
एकल जीवाणु तनाव द्वारा राइजोस्फीयर उपनिवेशण का पता लगाने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके हैं। गुणात्मक विधि के लिए, एक तनाव है कि संवैधानिक प्रतिदीप्ति व्यक्त इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और प्रतिदीप्ति वितरण और तीव्रता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या लेजर फोकल उपकरणों 1,2 के तहत जांच की जानी चाहिए. उन रणनीतियों अच्छी तरह से स्वस्थानी3 में बैक्टीरियल उपनिवेशण को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, लेकिन वे मात्रा का ठहराव में पारंपरिक प्लेट गिनती के तरीकों के रूप में के रूप में सटीक नहीं हैं. इसके अलावा, माइक्रोस्कोप के तहत केवल आंशिक रूट ज़ोन प्रदर्शित करने की सीमा के कारण, कभी-कभी यह व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह से प्रभावित हो सकता है।
यहां, हम एक मात्रात्मक विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करना और एक प्लेट पर बैक्टीरिया सीएफयू की गिनती करना शामिल है। यह विधि कमजोर पड़ने और चढ़ाना पर आधारित है जिसके द्वारा पौधों की जड़ों से छीन लिए गए उपनिवेशित उपभेदों को गिना जा सकता है, और जड़ पर कुल उपनिवेशित बैक्टीरिया संख्या की गणना 4,5 की जा सकती है।
सबसे पहले, ए थालियाना को हाइड्रोपोनिक स्थितियों में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर जीवाणु कोशिकाओं को 0.01 आयुध डिपो600 की अंतिम एकाग्रता में राइजोस्फीयर में टीका लगाया गया था। संक्रमित जड़ के ऊतकों को टीकाकरण के 2 दिन बाद काटा गया और बिना उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को हटाने के लिए बाँझ पानी में धोया गया। इसके अलावा, जड़ पर उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को एकत्र किया गया, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर में पतला किया गया, और एक लुरिया-बर्टानी (एलबी) अगर माध्यम पर चढ़ाया गया। 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, एलबी प्लेटों पर एकल कालोनियों को गिना गया और जड़ों पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए सामान्यीकृत किया गया।
यह विधि अत्यधिक लागू है, इसमें अच्छी पुनरावृत्ति है, और सटीक राइजोस्फीयर बैक्टीरियल उपनिवेशण निर्धारण के लिए अधिक उपयुक्त है।
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Protocol
1. बाँझ हाइड्रोपोनिक ए. थालियाना की खेती
- ए. थालियाना के पौधे तैयार करें।
- कल्चर ए. थालियाना अंकुर माध्यम तैयार करें, जिसमें 2% (wt/vol) सुक्रोज और 0.9% (wt/vol) अगर के साथ 1/2 MS माध्यम (मुराशिगे और स्कूग) शामिल हैं।
- जमना से पहले बाँझ वर्ग पेट्री व्यंजन (13 सेमी x 13 सेमी) में तैयार नसबंदी माध्यम डालो. नमी बनाए रखने के लिए हवा में सुखाने से बचें।
- 12 घंटे से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी के 1 एमएल से भरे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ए. थालियाना के बीज विसर्जित करें, और फिर 2 मिन के लिए 2% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) NaClO के 1 एमएल के साथ बीज को निष्फल करें।
- NaClO समाधान को हटाने के लिए छह बार बाँझ पानी के साथ बीज को अच्छी तरह से धो लें। एक बाँझ 1 एमएल टिप के साथ एमएस अगर माध्यम के साथ पेट्री व्यंजन पर बीज बोना.
- सांस चिकित्सा टेप के साथ पेट्री व्यंजन सील और उन्हें 1 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए एक प्रकाश इनक्यूबेटर में खड़ी जगह है. प्रकाश इनक्यूबेटर दिन/रात अनुपात को 16 घंटे/8 घंटे पर सेट करें, तापमान को 23 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता को 40% -60% पर बनाए रखें।
- प्रत्यारोपण ए. थालियाना।
- 40 माइक्रोन ताकना आकार सेल दाग पर 5 मिमी छेद काटें और उन्हें बाँझ.
- एक सेल छलनी के छेद के माध्यम से तीन 7 दिन पुराने ए thaliana पौधों प्रत्यारोपण और उन्हें 0.5% सुक्रोज के साथ बाँझ तरल 1/2 एमएस मध्यम के 3 एमएल युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली में डाल दिया.
- एक प्रकाश इनक्यूबेटर (चित्रा 1 ए) में 6 अच्छी तरह से प्लेटें रखें और 10 दिनों के लिए सेते हैं.
2. बैक्टीरिया की खेती और टीकाकरण
- टीकाकरण के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन तैयार करें।
- बैसिलस वेलेज़ेंसिस के लिए, जीवाणु कोशिकाओं को बाँझ एलबी माध्यम में टीका लगाएं और 170 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि यह 0.8-1.2 के आयुध डिपो600 तक नहीं पहुंच जाता।
- 2 मिन के लिए 6000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बैक्टीरिया कोशिकाओं को इकट्ठा करें और पीबीएस बफर (2 एमएम केएच2पीओ4, 8 एमएम ना2एचपीओ4, 136 एमएम एनएसीएल, 2.6 एमएम केसीएल) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एलबी माध्यम और जीवाणु चयापचयों को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र और निलंबित चरणों को 3 बार दोहराएं।
- आयुध डिपो600 0.01 की अंतिम एकाग्रता पर एक ताजा 1/2 एमएस माध्यम में बैक्टीरिया कोशिकाओं को निलंबित करें। 6 अच्छी तरह से प्लेटों है कि ए thaliana अंकुर बढ़ने के लिए बैक्टीरिया निलंबन टीका लगाना, प्रकाश इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से प्लेटों जगह है, और उन्हें 2 दिनों के लिए खेती.
3. जड़ों पर उपनिवेशित बैक्टीरिया को मापना
- जड़ ऊतक फसल और उपनिवेशित कोशिकाओं प्लेट.
नोट: सभी चरणों को ग्नोटोबायोटिक स्थिति के तहत आयोजित किया जाना चाहिए- 2 एमएल ट्यूबों का वजन करें और वजन को डब्ल्यू0 के रूप में रिकॉर्ड करें।
- सह-सुसंस्कृत ए. थालियाना जड़ ऊतकों फसल और बाँझ पानी में उन्हें धो 3 बार. अतिरिक्त पानी को निकालने के लिए रूट को फिल्टर पेपर पर रखें।
- जड़ को तौला हुआ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, ट्यूब के साथ जड़ों को तौलें, और इसे डब्ल्यू1 के रूप में रिकॉर्ड करें।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और अधिकतम गति पर 8 मिनट के लिए ट्यूबों भंवर.
- एकत्रित जड़-उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं के साथ निलंबन को 1 x 10-1-1 x 10-4 (बैक्टीरिया उपनिवेशण क्षमता के अनुसार) तक पतला करें। एलबी अगर मध्यम युक्त प्लेटों पर पतला जीवाणु निलंबन फैलाएं और 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- कॉलोनियों की गणना करें और डेटा को सामान्य करें।
- एलबी प्लेटों पर जीवाणु कालोनियों की गणना करें।
- इसी कमजोर पड़ने के अनुसार सीएफयू की गणना करें और रूट ताजा वजन (डब्ल्यू1-डब्ल्यू 0) के साथ डेटा को सामान्य करें। अंतिम परिणाम 2 दिनों के बाद इनोक्यूलेशन(चित्रा 1बी)में जड़ के प्रति ग्राम उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं की गिनती का संकेत देते हैं।
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Representative Results
ए. थालियाना राइजोस्फीयर में इस विधि द्वारा पता लगाए गए बैक्टीरिया उपनिवेशण क्षमता की सटीकता का परीक्षण करने के लिए, हमने बैसिलस वेलेज़ेंसिस SQR9 WT और एक व्युत्पन्न उत्परिवर्ती Δ8mcp को A. thaliana राइजोस्फीयर में अलग से टीका लगाया। Δ8mcp एक उत्परिवर्ती है जिसमें सभी केमोरिसेप्टर एन्कोडिंग जीन का अभाव है, और इसमें काफी कम उपनिवेशण6 है। हमने वर्तमान रूट उपनिवेशीकरण परख द्वारा टीकाकरण के 2 दिनों के बाद उनके उपनिवेशीकरण को मापा। परिणामों ने Δ8mcp की एक महत्वपूर्ण जड़ उपनिवेशण कमी दिखाई, यह दर्शाता है कि यह स्थिति और विधि बैक्टीरिया उपनिवेशण (चित्रा 1C) को प्रभावी ढंग से मापती है।
चित्र 1: बढ़ते ए. थालियाना और बैसिलस वेलेज़ेंसिस SQR9 और Δ8mcp का रूट उपनिवेशण। (ए) हाइड्रोपोनिक स्थिति में सेल स्टेनर के साथ 6-अच्छी प्लेटों में बढ़ रहे 7-दिन पुराने ए थालियाना का शीर्ष दृश्य। (बी) 7-दिन पुराने ए थालियाना का साइड व्यू 6-अच्छी प्लेटों में बढ़ रहा है, प्रत्येक अच्छी तरह से 3 अंकुर हैं। (सी) बी velezensis जंगली प्रकार SQR9 और Δ8mcp प्रस्तुत परख का उपयोग कर मापा का औपनिवेशीकरण. छह प्रतिकृतियां शामिल की गईं, और डेटा को SEM ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
अच्छा प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल के उपनिवेशण का पता लगाने की प्रक्रिया के लिए चार महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि टीका बैक्टीरिया कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक प्रयोग में बिल्कुल समान है। दूसरा, बाँझ पानी के साथ अनियंत्रित बैक्टीरिया सफाई तीव्रता को नियंत्रित करना भी आवश्यक है। तीसरा, हर नमूना कमजोर पड़ने की प्रक्रिया को प्रदर्शन करने से पहले भंवर की आवश्यकता होती है ताकि नमूना बैक्टीरिया की विशेषताओं के कारण अवशोषण त्रुटियों से बचने के लिए एक पूर्ण मिश्रण अवस्था में हो सके जो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डूबना आसान है। इसलिए, हम प्रत्येक अवशोषण से पहले बैक्टीरिया निलंबन मिश्रण करने के लिए एक भंवर साधन का उपयोग करने की सलाह देते हैं। चौथा, संदूषण की किसी भी संभावना से बचने के लिए इस पद्धति का उपयोग करके सभी कार्यों के दौरान एसेप्सिस को सख्ती से सुनिश्चित किया जाना चाहिए।
इस विधि का उपयोग जड़ की सतह पर उपनिवेशित बैक्टीरिया को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। जड़ की सतह बैक्टीरिया को छोड़कर, एंडोफाइटिक बैक्टीरिया, और कवक भी संयंत्र राइजोस्फीयर7 उपनिवेशण करते हैं। एंडोफाइटिक बैक्टीरिया की उपनिवेशण क्षमता अभी भी इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है, लेकिन एंडोफाइटिक बैक्टीरिया को छोड़ने के लिए जड़ ऊतक जमीन होना चाहिए। हालांकि, एंडोफाइटिक कवक बैक्टीरिया से अलग हैं। मुख्यधारा के तरीकों में से अधिकांश संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग हाइपहे, जो दृश्य8 के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग बैक्टीरिया के समान एक गुणात्मक पता लगाने विधि है के विकास का निरीक्षण करने के लिए.
जब विभिन्न उपभेदों के उपनिवेशण की तुलना, वे बैक्टीरियल वाष्पशील यौगिकों 9 और संयंत्र अस्थिर यौगिकों10,11 के प्रभाव से बचने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में टीका लगाया नहीं जाना चाहिए. हमने रूट का पता लगाने के लिए 2-दिवसीय पोस्ट-इनोक्यूलेशन चुना क्योंकि SQR9 का उपनिवेशण 2 से 4 दिनों के बीच अधिकतम तक पहुंच गया; बैक्टीरियल उपनिवेशण का पता लगाने का समय उपभेदों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
अन्य वर्णित विधियों की तुलना में, यह विधि सटीक और संचालित करने में आसान है। उदाहरण के लिए, नोम एट अल द्वारा वर्णित विधि ठोस विकसित Arabidopsis तुरंत जब हाइड्रोपोनिक हालत12,13 के लिए प्रत्यारोपित बैक्टीरिया के साथ टीका लगाया है. यहां, हम प्रस्ताव करते हैं कि बैक्टीरिया को बदले हुए विकास वातावरण में पौधे के अनुकूलन के प्रभाव से बचने के लिए प्रत्यारोपण के कई दिनों के बाद राइजोस्फीयर में टीका लगाया जाना चाहिए। इस अध्ययन में वर्णित विधि पौधों के लिए रूट एक्सयूडेट जारी करने के लिए भी अच्छी है, जो उपनिवेशण को प्रभावित करती है।
पौधे की शूटिंग को हवा में अलग से बढ़ने और तरल विसर्जन से पूरी तरह से दूर करने के लिए, हमने इस हाइड्रोपोनिक विधि के लिए उन्हें उपलब्ध कराने के लिए सेल स्टेनर पर कुछ मामूली संशोधन और प्रसंस्करण किया। इसके अलावा, इस विधि कम मात्रा में सटीक बैक्टीरियल उपनिवेशण निर्धारण के लिए अधिक उपयुक्त है, लेकिन जड़ exudates की बड़ी मात्रा के लिए नहीं हाइड्रोकल्चर14 में एकत्र किया. यह ध्यान दें कि इस विधि पहले प्रकाशित अध्ययन 12,14,15के आधार पर संशोधित किया गया है महत्वपूर्ण है.
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख की सामग्री के साथ उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32370135), चाइनीज एकेडमी ऑफ एग्रीकल्चरल साइंसेज (CAAS-CSAL-202302) के इनोवेशन प्रोग्राम, जिआंगसु वोकेशनल कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चर एंड फॉरेस्ट्री (2021kj29) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
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