Summary
We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.
Abstract
We presenteren een methode om complexe eiwitnetwerken in blaasjes op te nemen, met integrale membraaneiwitten, enzymen en op fluorescentie gebaseerde sensoren, met behulp van gezuiverde componenten. Deze methode is relevant voor het ontwerp en de bouw van bioreactoren en de studie van complexe metabole reactienetwerken die uit evenwicht zijn. We beginnen met het reconstrueren van (meerdere) membraaneiwitten tot grote unilamellaire blaasjes (LUV's) volgens een eerder ontwikkeld protocol. Vervolgens kapselen we een mengsel van gezuiverde enzymen, metabolieten en op fluorescentie gebaseerde sensoren (fluorescerende eiwitten of kleurstoffen) in via vries-dooi-extrusie en verwijderen we niet-opgenomen componenten door centrifugatie en/of grootte-uitsluitingschromatografie. De prestaties van de metabole netwerken worden in realtime gemeten door de ATP/ADP-verhouding, metabolietconcentratie, interne pH of andere parameters te bewaken door middel van fluorescentie-uitlezing. Onze membraaneiwitbevattende blaasjes met een diameter van 100-400 nm kunnen worden omgezet in reuzen-unilamellaire blaasjes (GUV's), met behulp van bestaande maar geoptimaliseerde procedures. De aanpak maakt het mogelijk om oplosbare componenten (enzymen, metabolieten, sensoren) op te nemen in blaasjes ter grootte van een micrometer, waardoor het volume van de bioreactoren met ordes van grootte wordt opgeschaald. Het metabolische netwerk dat GUV's bevat, zit gevangen in microfluïdische apparaten voor analyse door optische microscopie.
Introduction
Het vakgebied van bottom-up synthetische biologie richt zich op het bouwen van (minimale) cellen 1,2 en metabole bioreactoren voor biotechnologische 3,4 of biomedische doeleinden 5,6,7,8. De constructie van synthetische cellen biedt een uniek platform dat onderzoekers in staat stelt om (membraan)eiwitten te bestuderen in goed gedefinieerde omstandigheden die die van inheemse omgevingen nabootsen, waardoor opkomende eigenschappen en verborgen biochemische functies van eiwitten en reactienetwerken kunnen worden ontdekt9. Als tussenstap naar een autonoom functionerende synthetische cel worden modules ontwikkeld die essentiële kenmerken van levende cellen vastleggen, zoals metabolisch energiebehoud, eiwit- en lipidensynthese en homeostase. Dergelijke modules vergroten niet alleen ons begrip van het leven, maar hebben ook potentiële toepassingen op het gebied van geneeskunde8 en biotechnologie10.
Transmembraaneiwitten vormen de kern van vrijwel elk metabolisch netwerk, omdat ze moleculen in of uit de cel transporteren, signalen geven en reageren op de kwaliteit van de omgeving, en tal van biosynthetische rollen spelen. De engineering van metabole modules in synthetische cellen vereist dus in de meeste gevallen de reconstitutie van integrale en/of perifere membraaneiwitten tot een membraandubbellaag die is samengesteld uit specifieke lipiden en een hoge integriteit (lage permeabiliteit). De omgang met deze membraaneiwitten is uitdagend en vereist specifieke kennis en experimentele vaardigheden.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om membraaneiwitten in fosfolipideblaasjes te reconstrueren, meestal met als doel de functie11,12, regulatie13, kinetische eigenschappen14,15, lipideafhankelijkheid15,16 en/of stabiliteit17 van een specifiek eiwit te bestuderen. Deze methoden omvatten de snelle verdunning van detergent-oplosbaar eiwit in waterige media in aanwezigheid van lipiden18, de verwijdering van detergenten door het incuberen van detergent-solubel eiwit met detergent-gedestabiliseerde lipideblaasjes en absorptie van het detergent(en) op polystyreenkorrels19, of het verwijderen van detergenten door dialyse of grootte-uitsluitingschromatografie20. Organische oplosmiddelen zijn gebruikt om lipideblaasjes te vormen, bijvoorbeeld via de vorming van olie-water-interfasen21, maar de meeste integrale membraaneiwitten worden geïnactiveerd wanneer ze worden blootgesteld aan dergelijke oplosmiddelen.
In ons laboratorium reconstrueren we meestal membraaneiwitten door middel van de detergent-absorptiemethode om grote unilamellaire blaasjes (LUV's) te vormen19. Deze methode maakt de co-reconstitutie van meerdere membraaneiwitten en de inkapseling in het blaasjeslumen van enzymen, metabolieten en sondes mogelijk22,23. De membraaneiwitbevattende LUV's kunnen worden omgezet in reusachtige-unilamellaire blaasjes (GUV's) met/zonder inkapseling van in water oplosbare componenten, met behulp van elektroformatie24 of gelondersteunde zwelling25 en specifieke omstandigheden om de integriteit van de membraaneiwitten te behouden26.
Dit artikel presenteert een protocol voor de reconstitutie in LUV's van een uit evenwicht zijnd metabolisch netwerk dat ATP regenereert door de afbraak van L-arginine in L-ornithine27. De vorming van ATP gaat gepaard met de productie van glycerol-3-fosfaat (G3P), een belangrijke bouwsteen voor de fosfolipidensynthese22,28. De metabole route bestaat uit twee integrale membraaneiwitten, een arginine/ornithine (ArcD) en een G3P/Pi-antiporter (GlpT). Daarnaast zijn drie oplosbare enzymen (ArcA, ArcB, ArcC) nodig voor de recycling van ATP, en GlpK wordt gebruikt om glycerol om te zetten in glycerol 3-fosfaat, waarbij gebruik wordt gemaakt van het ATP uit de afbraak van L-arginine, zie figuur 1 voor een schematisch overzicht van de route. Dit protocol vormt een goed uitgangspunt voor de toekomstige constructie van nog complexere reactienetwerken - voor de synthese van lipiden of eiwitten of de deling van cellen. De lipidensamenstelling van de blaasjes ondersteunt de activiteit van een breed scala aan integrale membraaneiwitten en is geoptimaliseerd voor het transport van diverse moleculen in of uit de blaasjes 27,29,30.
Figuur 1: Overzicht van de route voor ATP-productie en glycerol-3-fosfaatsynthese en -uitscheiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kortom, gezuiverde membraaneiwitten (opgelost in dodecyl-β-D-maltoside, DDM) worden toegevoegd aan voorgevormde lipideblaasjes die zijn gedestabiliseerd met Triton X-100, waardoor de eiwitten in het membraan kunnen worden ingebracht. De wasmiddelmoleculen worden vervolgens (langzaam) verwijderd door de toevoeging van geactiveerde polystyreenkorrels, wat resulteert in de vorming van goed afgesloten proteoliposomen. Oplosbare componenten kunnen vervolgens aan de blaasjes worden toegevoegd en worden ingekapseld via vries-dooicycli, waardoor de moleculen worden opgesloten in het proces van membraanfusie. De verkregen blaasjes zijn zeer heterogeen en veel zijn multilamellair. Ze worden vervolgens geëxtrudeerd door een polycarbonaatfilter met een poriegrootte van 400, 200 of 100 nm, wat blaasjes van meer uniforme grootte oplevert; Hoe kleiner de poriegrootte, hoe homogener en unilamellair de blaasjes, maar tegen de prijs van een kleiner inwendig volume. Niet-opgenomen eiwitten en kleine moleculen worden uit de externe oplossing verwijderd door middel van grootte-uitsluitingschromatografie. De proteoLUV's kunnen worden omgezet in blaasjes ter grootte van een micrometer door middel van gel-geassisteerde zwelling, en deze proteoGUV's worden vervolgens verzameld en gevangen in een microfluïdische chip voor microscopische karakterisering en manipulatie. Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het volledige protocol.
Figuur 2: Overzicht van het protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en wateroplosbare componenten in lipideblaasjes met een submicrometer (LUV's) en micrometergrootte (GUV's). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De reconstitutie- en inkapselingsprotocollen werken goed en de functionaliteit van de eiwitten blijft behouden, maar de proteoLUV's en proteoGUV's zijn heterogeen van grootte. Microfluïdische benaderingen31,32 maken de vorming van blaasjes ter grootte van een micrometer mogelijk die homogener van grootte zijn, maar functionele reconstitutie van membraaneiwitten is over het algemeen niet mogelijk omdat resterend oplosmiddel in de dubbellaag de eiwitten inactiveert. De proteoLUV's variëren in grootte van 100 tot 400 nm, en bij lage concentraties enzymen kan de inkapseling leiden tot blaasjes met onvolledige metabole routes (stochastische effecten; zie figuur 3). LUV's zijn ideaal voor het bouwen van specifieke metabolische modules, zoals hier te zien is voor de productie van ATP en bouwstenen zoals G3P. Dergelijke proteoLUV's kunnen mogelijk worden ingekapseld in GUV's en dienen als organelachtige compartimenten voor de gastheerblaasjes.
Figuur 3: Aantal moleculen per blaasje met een diameter van 100, 200 of 400 nm. (A) Wanneer de ingekapselde eiwitten (enzymen, sondes) zich in het bereik van 1-10 μM bevinden. (B) De reconstitutie wordt gedaan bij 1 tot 1.000, 1 tot 10.000 en 1 tot 100.000 membraaneiwitten per lipide (mol/mol). We gaan ervan uit dat moleculen in de aangegeven concentraties worden ingekapseld en in het membraan worden opgenomen in deze eiwit-lipideverhoudingen. Voor sommige enzymen hebben we gezien dat ze zich binden aan membranen, waardoor hun schijnbare concentratie in de blaasjes kan toenemen. Afkorting: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene voorbereiding
- Chemicaliën
- Los lipiden (in poedervorm) op tot 25 mg/ml inCHCl 3 voor het maken van voorgevormde liposomen.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om verse lipidenvoorraden te bereiden, maar de bouillonoplossingen kunnen ook enkele weken bij -20 °C worden bewaard. Het werken met lipiden in poedervorm is nauwkeuriger dan het gebruik van lipiden die al in CHCl3 zijn opgelost. CHCl3 moet worden gehanteerd met behulp van glazen pipetten en/of spuiten en worden bewaard in glazen recipiënten, aangezienCHCl 3 kunststoffen oplost. - Los kleine moleculen (nucleotiden, aminozuren, fluorescentiesondes) voor de inkapselingsprocedure op in 50 mM KPi (buffer A, zie tabel 1) en stel de pH in op 7,00 ± 0,01. Los MgCl2 op in gedeïoniseerd water om de vorming van magnesiumfosfaatneerslag te voorkomen.
OPMERKING: Voorraadoplossingen kunnen enkele weken bij -20 °C worden bewaard, met uitzondering van DTT, dat op de dag van het experiment vers wordt bereid. - Los ionoforen (bijv. valinomycine, nigericine) op in DMSO of EtOH bij een voorraadconcentratie van 100-500 μM. Bewaren bij -20 °C gedurende enkele weken; Vermijd verdamping.
OPMERKING: DMSO is niet volatiel en heeft daarom de voorkeur boven EtOH. Gebruik glazen in plaats van plastic injectieflacons om hechting van de ionoforen aan het oppervlak van de injectieflacons te voorkomen.
- Los lipiden (in poedervorm) op tot 25 mg/ml inCHCl 3 voor het maken van voorgevormde liposomen.
- Buffers
- Bereid op de dag van het experiment verse buffers voor (tabel 1). Niet langer dan 24 uur bewaren.
- Zuivering van oplosbare eiwitten
- Express ArcA, ArcB, ArcC (we gebruiken een specifieke variant met de naam ArcC1), PercevalHR en GlpK zoals eerder beschreven 27,28,33. Zorg ervoor dat u 10% v/v glycerol toevoegt aan de cellysebuffer, wat de stabiliteit van de eiwitten verbetert. Zuiver de oplosbare eiwitten zoals beschreven 27,28,33 en hierna kort gerapporteerd.
- Ontdooi 10 ml cellysaat (~5 g nat gewicht) in een ijswaterbad. Breng intussen 2 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-hars aan op een zwaartekrachtstroomkolom (capaciteit 20 ml) met gedeïoniseerd water (12 CV's) en Buffer B (4 CV's) om te wassen. Breng het ontdooide lysaat over op ijs; Werk op ijs, tenzij anders vermeld.
- Voeg imidazol in een eindconcentratie van 10 mM toe aan het ontdooide lysaat en giet de oplossing vervolgens op de zwaartekrachtkolom. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met zachte nootvorming.
- Gooi na 1 uur de doorstroom weg en was de hars met Buffer C (20 CVs).
- Elute het eiwit met Buffer D. Gebruik 60% CV voor de eerste elutiestap, gevolgd door 4-6 stappen van 40% CV's.
- Bepaal de eiwitconcentratie en voeg Na-EDTA toe tot een eindconcentratie van 5 mM.
- Draai het gezuiverde eiwit rond in een gekoelde tafelcentrifuge (maximale snelheid, 10 minuten, 4 °C). Zuiveren door middel van grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van Buffer E. Pool de elutiefracties samen en concentreer ze tot ~10 mg/ml met een concentrerend filter met een cut-off van 30 kDa. Bereid aliquots van de juiste grootte (~ 20 μL) voor, vries ze snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C voor later gebruik.
OPMERKING: Het is belangrijk om de enzymen te concentreren tot 50-100 μM om het volume dat nodig is voor de inkapseling te minimaliseren.
- Zuivering van membraaneiwitten
- Overexpress ArcD en GlpT zoals eerder beschreven 22,27,33. Zorg ervoor dat u 10% v/v glycerol toevoegt aan de cellysebuffer; voor zuivering van ArcD 2 mM reductiemiddel (bijv. DTT) in de buffer opnemen. Zuiver de met affiniteit gelabelde eiwitten door Ni2+-Sepharose-chromatografie.
- Ontdooi een hoeveelheid ruwe membraanblaasjes (10-20 mg totaal membraaneiwit) in een ijswaterbad.
NOTITIE: Eenmaal ontdooid, werk altijd op ijs, tenzij anders vermeld. Zie tabel 1 voor de buffers die in dit hoofdstuk worden gebruikt. - Voeg de membraanblaasjes toe aan Buffer F (ArcD) of Buffer G (GlpT) tot een eindvolume van 6 ml. Incubeer het monster gedurende 1 uur bij 4 °C met zachte bevochtiging.
- Scheid de opgeloste membraaneiwitten van het membraanpuin door ultracentrifugatie (337.000 × g, 30 min, 4 °C). Breng intussen 0,25 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-hars aan op een zwaartekrachtstroomkolom (capaciteit van 10 ml) met gedeïoniseerd water (40 CV's) en 20 CV's Buffer H (ArcD) of Buffer I (GlpT).
- Giet het opgeloste eiwit op de zwaartekrachtstroomkolom en voeg imidazol toe tot een eindconcentratie van 10 mM. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C met zachte bevochtiging.
- Gooi na 1 uur de doorstroom weg en was de hars met 20 CV's Buffer J (ArcD) of Buffer K (GlpT).
- Eluer het membraaneiwit in stappen van 60% CV (1st) en 40% CV (2-6th) met Buffer L (ArcD) of Buffer M (GlpT).
- Bepaal de eiwitconcentratie en ga verder met rubriek 2.2. voor membraanreconstitutie.
OPMERKING: De zuivering met uitsluiting van grootte wordt niet noodzakelijkerwijs uitgevoerd voor membraaneiwitten, aangezien de membraanreconstitutie een vergelijkbare zuivering oplevert. Stap 1.4 en 2.2 kunnen in 1 werkdag worden uitgevoerd. Begin 's ochtends met eiwitzuivering (stap 1.4) en 's middags verder met reconstitutie (stap 2.2). De reconstitutie eindigt de volgende dag (zie rubriek 2.2 voor meer informatie). STOPPUNT: Gezuiverde en DDM-oplosbare ArcD en GlpT kunnen bij -80 oC worden opgeslagen voor later gebruik, maar dit geldt niet voor alle membraaneiwitten. Bereid aliquots van de juiste grootte (50-200 μl) voor, vries ze snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C voor later gebruik. Deze eiwitten zijn enkele maanden actief wanneer ze worden bewaard bij -80 °C in aanwezigheid van 10% v/v glycerol.
- Ontdooi een hoeveelheid ruwe membraanblaasjes (10-20 mg totaal membraaneiwit) in een ijswaterbad.
- Overexpress ArcD en GlpT zoals eerder beschreven 22,27,33. Zorg ervoor dat u 10% v/v glycerol toevoegt aan de cellysebuffer; voor zuivering van ArcD 2 mM reductiemiddel (bijv. DTT) in de buffer opnemen. Zuiver de met affiniteit gelabelde eiwitten door Ni2+-Sepharose-chromatografie.
- Bereiding van β-caseïne voor passiveringsdoeleinden
- Resuspendeer 100 mg β-caseïne in 20 ml gedeïoniseerd water en titreer met 1 M NaOH totdat de β-caseïne volledig is opgelost. Voeg vervolgens 1 M azijnzuur toe om de pH aan te passen tot 7,0 en vul het volume tot 50 ml met gedeïoniseerd water. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm en maak aliquots van 500 μl.
LET OP: De β-caseïne is 6 maanden houdbaar bij -20 °C. Het wordt aanbevolen om de β-caseïne voor gebruik opnieuw te filteren om te voorkomen dat β-caseïne-aggregaten de microfluïdische chip verstoppen.
- Resuspendeer 100 mg β-caseïne in 20 ml gedeïoniseerd water en titreer met 1 M NaOH totdat de β-caseïne volledig is opgelost. Voeg vervolgens 1 M azijnzuur toe om de pH aan te passen tot 7,0 en vul het volume tot 50 ml met gedeïoniseerd water. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm en maak aliquots van 500 μl.
| Buffer | Compositie | ||
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 | ||
| Buffer B | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 10 mM imidazool, pH 7,5 | ||
| Buffer C | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 50 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Buffer D | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 500 mM imidazool, pH 7,5 | ||
| Buffer E | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, pH 7,0 | ||
| Buffer F | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, pH 7,5 | ||
| Buffer G | 50 mM Tris-HCl, 0,5% w/v DDM, 20% v/v glycerol, pH 8 | ||
| Buffer H | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 10 mM imidazool, pH 7,5 | ||
| Buffer I | 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 10 mM imidazool, pH 8,0 | ||
| Buffer J | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 50 mM imidazool, pH 7,5 | ||
| Buffer K | 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 50 mM imidazool, pH 8 | ||
| Buffer L | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 500 mM imidazool, pH 7,5 | ||
| Buffer M | 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 500 mM imidazool, pH 8 | ||
| Buffer N | 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0 | ||
| Buffer O | 50 mM KPi, 0,5 mM L-ornithine, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0 | ||
| Buffer P | 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glucose (x is gevarieerd om overeen te komen met de osmolariteit van het externe en interne medium) | ||
| Buffer Q | 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM Sucrose, 2 mM DTT | ||
| Buffer R | 50 mM KPi pH 7.0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginine, x mM glucose | ||
Tabel 1: Buffers die in dit protocol worden gebruikt.
2. Proteoliposomen: reconstitutie van gezuiverde membraaneiwitten tot voorgevormde lipideblaasjes
- Dag 1
- Bereiding van voorgevormde lipideblaasjes
- Kies de lipidensamenstelling (bijv. synthetische fosfolipiden, E. coli polaire lipiden) op basis van de vereisten van de membraaneiwitten.
OPMERKING: Een mengsel van DOPE, DOPG en DOPC (25:25:50 mol%) is een goed uitgangspunt, maar voor sommige eiwitten kunnen sterolen of cardiolipine nodig zijn; Voor gistplasmamembraaneiwitten nemen we palmitoyl-oleoyllipiden op in plaats van Dioleoyl30. Een mengsel van DOPE, DOPG en DOPC (25:25:50 mol%) is voldoende voor de reconstitutie van ArcD en GlpT. - Meng de gewenste lipiden (opgelost inCHCl 3) en verdamp de CHCl3 in een roterende verdamper tot er een lipidenfilm is gevormd. Was de lipiden door diethylether toe te voegen in hetzelfde volume als de CHCl3. Verdamp de diethylether en verkrijg een droge lipidenfilm.
- Resuspendeer de lipidenfilm tot 20 mg/ml totale lipiden in waterige media (buffer A). Begin met de helft van het totale volume en schud voorzichtig; Breng de lipiden vervolgens voorzichtig over in een schone tube of fles van voldoende grootte. Voeg verse buffer A toe aan de kolf en herhaal de procedure om de resterende lipiden op te lossen en over te brengen naar een nieuw vat. Voeg extra buffer A toe om een eindconcentratie van 20 mg/ml te bereiken.
- Sonificeer de geresuspendeerde lipiden met behulp van een sonde-sonicator. Gebruik de volgende parameters voor een sonicatortip met een diameter van 6 mm: 4 μm intensiteit, 70% amplitude, 5 s aan, 45 s uit, 16 cycli. Dompel de lipiden onder in een ijswaterbad met EtOH om oververhitting door sonicatie te voorkomen.
- Vries het gesoniseerde monster (volume van 40 ml in een centrifugebuis van 50 ml) snel in vloeibare stikstof in en ontdooi het monster in een waterbad bij kamertemperatuur. Herhaal een keer; aliquot vervolgens de liposomen in de gewenste volumes (bijv. 1 ml of 20 mg totale lipiden in een plastic buisje van 1,5 ml).
STOPPUNT: De procedure kan op dit punt worden gestopt. Vries elke aliquot nog een keer in (derde cyclus) en bewaar ze maximaal een paar maanden in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat u de buisdeksels twee keer met een naald doorboort om te voorkomen dat de buis ontploft bij het snel koken van de vloeibare stikstof.
- Kies de lipidensamenstelling (bijv. synthetische fosfolipiden, E. coli polaire lipiden) op basis van de vereisten van de membraaneiwitten.
- Bereiding van voorgevormde lipideblaasjes
- Dag 2
- Reconstitutie van gezuiverde membraaneiwitten tot voorgevormde liposomen
- Ontdooi een aliquot liposomen (20 mg totale lipiden) in een waterbad bij kamertemperatuur. Bereid intussen een extruder voor door een filter naar keuze aan te brengen (bijv. polycarbonaat, poriediameter van 400 nm); pre-equilibrate van de extruder met Buffer A; En laad de ontdooide liposomen ('melkachtige oplossing') in de extruder en haal ze 13x door het filter. Verzamel de geëxtrudeerde liposomen (nu grote unilamellaire blaasjes; "ondoorzichtige oplossing") in een glazen of plastic vat van voldoende grootte (bijv. 15 ml). Verdun de liposomen tot 4 mg/ml met Buffer A aangevuld met 2 mM DTT.
- Breng 1 ml liposomen van 4 mg/ml over in een transparante cuvet van 1 ml. Meet in een spectrofotometer de initiële optische dichtheid bij 540 nm. Giet het gemeten monster terug en voeg 50 μL 10% v/v Triton X-100 toe aan de liposomen.
OPMERKING: Een titratievolume van 50 μl 10% Triton-X100 is geschikt voor 20 mg lipiden in een volume van 5 ml; de toevoeging van Triton X-100 zal de lipiden met ~5% verdunnen. Pas het titratievolume aan wanneer u met verschillende hoeveelheden liposomen werkt. Voor stabiele optische dichtheidssignalen titreert u de liposomen met Triton X-100 bij kamertemperatuur. - Herhaal stap 2.2.1.2 en noteer wanneer een maximale optische dichtheid is bereikt (Rsat). Ga verder met de titratie totdat een optische dichtheid van ongeveer 60% Rsat is bereikt (Figuur 4). Giet de met wasmiddel gedestabiliseerde blaasjes terug in de glazen/plastic buis (het uiteindelijke volume is nu ongeveer 5,2 ml), breng het monster over in ijs en laat het afkoelen.
- Voeg het (de) gezuiverde membraaneiwit(en) toe aan de gedestabiliseerde liposomen om een gewenste lipide-eiwitverhouding (w/w) te bereiken. Gebruik een verhouding van 400:1 tot 100:1 w/w; aangezien zowel ArcD als GlpT een molecuulgewicht hebben van ~55 kDa, komt een lipide-eiwitverhouding van 400:1 w/w overeen met ~30.000 lipiden per eiwit, en ~ 50 moleculen ArcD en GlpT elk per blaasjes met een diameter van 400 nm.
OPMERKING: Hier gebruiken we 400:1 w/w, wat overeenkomt met 50 μg van elk eiwit per 20 mg lipiden. - Bevochtig de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C zodat de membraaneiwitten in het gedestabiliseerde liposomale membraan kunnen worden ingebracht.
- Om het wasmiddel te verwijderen, voegt u 200 mg droge polystyreenkorrels toe, bereid volgens de instructies van de fabrikant. Nutate bij 4 °C gedurende nog eens 15 min.
OPMERKING: Een hoeveelheid van 200 mg droge kralen is geschikt voor 20 mg lipiden, maar moet worden aangepast wanneer een andere steekproefgrootte wordt gebruikt. - Herhaal stap 2.2.1.6 2x, voor in totaal drie toevoegingen van polystyreen korrels. Vervolgens een nacht bij 4 °C incuberen met zachte nutatie.
- Reconstitutie van gezuiverde membraaneiwitten tot voorgevormde liposomen
- Dag 3
- Herhaal stap 2.2.1.6; deze keer echter nutate bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Plaats een lege zwaartekrachtkolom (capaciteit van 10 ml) boven een lege ultracentrifugatiebuis van 6,5 ml op ijs. Giet het monster in de kolom en verzamel de proteoliposomen in de ultracentrifugatiebuis (de korrels worden in de kolom vastgehouden).
- Was de korrels met 0,5 ml buffer A aangevuld met 2 mM DTT en vang het filtraat op in de ultracentrifugatiebuis.
- Concentreer de proteoliposomen door ultracentrifugatie (337.000 × g, 30 min, 4 °C). Resuspendeer de proteoliposomen in een totaal volume van 200 μL (100 mg lipide/ml) in Buffer A aangevuld met 2 mM DTT; het droge volume van de blaasjes na centrifugeren is ~40 tot 120 μL27. Opgesplitst in aliquots van de gewenste grootte (bijv. drie aliquots van 6,66 mg totale lipiden).
OPMERKING: De aliquotgrootte is willekeurig, maar zal in latere stappen van invloed zijn op de korrelgrootte (zie stap 3.2.3.1). STOPPUNT: De procedure kan hier worden gestopt. Vries elke aliquot snel in en bewaar ze maximaal een paar weken in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat u de buisdeksels twee keer met een naald doorboort om te voorkomen dat de buis ontploft bij snel koken van de vloeibare stikstof.
Figuur 4: Titratie van voorgevormde liposomen met Triton X-100. Liposomen van 5 mg lipiden/ml worden geëxtrudeerd door een polycarbonaatfilter (400 nm) in 50 mM KPi (pH 7,0) en vervolgens getitreerd met Triton X-100 (protocolstap 2.2.1.2). De troebelheid van de blaasjes wordt gemeten bij A540. De pijl geeft de Triton X-100 concentratie aan waarbij de blaasjes voldoende gedestabiliseerd zijn voor spontane insertie van membraaneiwitten zoals beschreven in19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Inkapseling van een metabool netwerk voor ATP-recyclage en glycerol 3-P-synthese in blaasjes van submicrongrootte
- Dag 1
- Mengen van componenten
- Gebruik voor een standaardinkapseling 66,6 μl proteoliposomen in een eindvolume van 200 μl (33,33 mg/ml totale lipiden). Bereken het volume van elke component (enzym, cofactor) die nodig is om de gewenste concentratie te bereiken, voeg deze componenten toe aan de proteoliposomen en pas het volume aan tot 200 μL met buffer A (tabel 2).
OPMERKING: De eiwitconcentratie kan worden aangepast op basis van de experimentele opstelling. Er moet echter voor worden gezorgd dat er gemiddeld meerdere kopieën (>10) van elk enzym per blaasje aanwezig zijn, om ongewenste stochastische effecten te voorkomen. Concentraties > 1 μM zijn over het algemeen veilig; 1 μM in een blaasje met een diameter van 400 nm komt overeen met ongeveer 20 kopieën (figuur 3). - Pipetteer buffer A in een lege tube van 1,5 ml en voeg de DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornithine (en pyranine, indien nodig voor interne pH-metingen) toe. Voeg vervolgens de enzymen toe en meng voorzichtig. Voeg de oplossing toe aan de voorgevormde proteoliposomen en draai kort op lage snelheid.
OPMERKING: Het is belangrijk om Na-ADP toe te voegen vóór MgCl2 om de ongewenste vorming van magnesiumfosfaatneerslag te voorkomen. Vortexen zijn nodig voor een goede menging van de viskeuze oplossing; Minimaliseer echter de duur en snelheid om mechanische schade aan de eiwitten te voorkomen. PercevalHR en pyranine kunnen niet samen worden ingekapseld omdat hun spectra elkaar overlappen.
- Gebruik voor een standaardinkapseling 66,6 μl proteoliposomen in een eindvolume van 200 μl (33,33 mg/ml totale lipiden). Bereken het volume van elke component (enzym, cofactor) die nodig is om de gewenste concentratie te bereiken, voeg deze componenten toe aan de proteoliposomen en pas het volume aan tot 200 μL met buffer A (tabel 2).
- Bepaling van de interne osmolaliteit
- Bereid een oplossing van 50 μl zoals beschreven in stap 3.1.1.1 maar zonder proteoliposomen, en meet de osmolaliteit met een vriespuntosmometer.
- Maak een kalibratiecurve met behulp van buffer (50 mM KPi pH 7,0) en variërende concentraties zout (bijv. NaCl of NaCl) of suiker. Bepaal de osmolytconcentratie die overeenkomt met de interne osmolaliteit (Buffer N).
OPMERKING: Membraanpermeabele componenten (bijv. glycerol) kunnen niet worden gebruikt om de interne osmolaliteit te evenaren. Voor eiwitten die zijn opgelost in een glycerolbevattende buffer (bijv. Buffer E), moet dezelfde buffer worden gebruikt zonder glycerol. De osmoliet die is gekozen voor de bereiding van een iso-osmotische externe buffer moet membraanondoordringbaar zijn en mag het metabolische netwerk niet verstoren.
- Bevriezen-ontdooien
- Vries de proteoliposomen samen met de oplosbare bestanddelen snel in (in vloeibare stikstof) en ontdooi ze in een water-ijsbad bij ongeveer 10 °C.
- Herhaal stap 3.1.3.1 in totaal 5x.
STOPPUNT: De procedure kan hier worden gestopt. Sla de laatste ontdooistap over en bewaar het ingevroren monster 1-3 dagen in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat u de buisdeksels 2x met een naald doorboort om te voorkomen dat de buis ontploft bij het snel koken van de vloeibare stikstof. Opslag in vloeibare stikstof heeft de voorkeur boven -80 °C om lipide-oxidatie te minimaliseren.
- Mengen van componenten
- Dag 2
- Extrusie
OPMERKING: Alle extrusiestappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, omdat de gasdichte spuiten anders gaan lekken.- Bereid een extruder voor door een filter naar keuze aan te brengen (bijv. polycarbonaat, poriediameter van 400 nm). Was de extruder met een oplossing die dezelfde buffer en metabolieten bevat die worden gebruikt voor het inkapselen van de blaasjes (bijv. Buffer O plus 0,1 mM pyranine).
OPMERKING: Gebruik een speciale extruder voor het laden van proteoliposomen met pyranine, aangezien de kleurstof aan het oppervlak van de extruder blijft plakken en in latere monsters verontreiniging kan veroorzaken. - Laad het inkapselingsmengsel in de extruder en haal het 13x door het filter. Vang de geëxtrudeerde oplossing op in een tube van 1,5 ml.
- Bereid een extruder voor door een filter naar keuze aan te brengen (bijv. polycarbonaat, poriediameter van 400 nm). Was de extruder met een oplossing die dezelfde buffer en metabolieten bevat die worden gebruikt voor het inkapselen van de blaasjes (bijv. Buffer O plus 0,1 mM pyranine).
- Grootte-uitsluitingschromatografie (optioneel)
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om externe moleculen, zoals kleurstoffen zoals pyranine, te verwijderen door middel van grootte-uitsluitingschromatografie. Als er geen kleurstoffen in het systeem aanwezig zijn en andere componenten niet in lage concentraties interfereren (merk op dat de blaasjes daarna ook worden gewassen door ultracentrifugatie), dan stap 3.2.2. kan worden overgeslagen.- Rehydrateer Sephadex G-75 hars en giet het in een glazen kolom (22 cm lang, 1,5 cm breed). Breng de hars in evenwicht met een overmaat aan externe buffer (bijv. Buffer N).
- Laad de geëxtrudeerde proteoliposomen uit stap 3.2.1.2 op de vooraf in evenwicht gebrachte chromatografiekolom met uitsluiting van grootte en pas een zwaartekrachtstroom van externe buffer toe. Gooi het lege volume weg (ongeveer 7 ml); verzamel vervolgens tien aliquots van 1 ml. Visualiseer de proteoliposoom-bevattende aliquots door korte blootstelling aan een UV-lamp. Voeg de fracties samen die de meeste proteoliposomen bevatten (2-4 ml).
- Wassen en resuspensie
- Was de geëxtrudeerde proteoliposomen door middel van ultracentrifugatie. Vul een ultracentrifugatiebuis van 6,5 ml met 5,8 ml Buffer N en breng het geëxtrudeerde monster erop aan. Als er grootte-uitsluitingschromatografie is uitgevoerd, vul dan de buis met de gepoolde elutiemonsters (2-4 ml) en voeg buffer N toe aan een eindvolume van 6 ml.
- Centrifugeer bij 337.000 × g, 30 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en droog de ultracentrifugatiebuis grondig af met een stofvrije tissue en let erop dat u de pellet niet aanraakt. Resuspendeer de pellet in een kleine hoeveelheid Buffer N (200 μL). Wanneer de pellet volledig is geresuspendeerd, vult u de buis tot 6 ml met Buffer N.
OPMERKING: het opnieuw suspenderen van de pellet kost tijd en moet voorzichtig gebeuren. - Herhaal de stappen 3.2.3.1-3.2.3.2 2x, voor in totaal drie wasbeurten, tenzij chromatografie met uitsluiting van de grootte wordt uitgevoerd (in dat geval volstaat één centrifugatiestap). Resuspendeer de pellet uiteindelijk tot een gewenste concentratie (bijv. 5,55 mg/ml totaal lipide) door een geschikt volume Buffer N toe te voegen.
STOPPUNT: De proteoliposomen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of gedurende ten minste 48 uur bij 4 °C worden bewaard. De grootte van de ultracentrifugatiebuizen moet worden gekozen op basis van de steekproefomvang. Voor een pellet van 6,66 mg totale lipiden is een tube van 6,5 ml geschikt. Het wassen van 200 μL proteoliposomen (33,33 mg lipiden/ml in totaal; volume droge pellets ~40 μL)28 voor 3 x 6 ml buffer verdunt de externe componenten met een factor 100 voor elke wasstap. Als er buizen van verschillende grootte worden gebruikt, is het wenselijk om het aantal wasbeurten dienovereenkomstig aan te passen.
- Extrusie
- Dag 3
- Detectie van ATP-synthese door fluorescentie
- Meng de reactiecomponenten tot een eindvolume van 120 μl (tabel 3) in een zwarte kwartscuvet met een venster van 3 x 5 mm en een minimaal inwendig volume van 100 μl.
OPMERKING: Ionoforen kunnen worden toegevoegd om elektrochemische ionengradiënten af te voeren. Een mengsel van valinomycine en nigericine (elk 1 μM) voert eventuele proton- en kaliumgradiënten effectief af. - Verwarm het monster voor in een fluorometer die is ingesteld op 30 °C en verkrijg excitatiespectra van PercevalHR (excitatie 400-520 nm, bandbreedte 5 nm; emissie 550 nm, bandbreedte 5 nm). Zodra het sondesignaal constant is, start u het metabolische netwerk door de toevoeging van een overmaat aan L-arginine (5-10 mM) en glycerol (400 μM) wanneer de recycling van ATP wordt gekoppeld aan de synthese van glycerol 3-fosfaat. Volg de reactie in de loop van de tijd.
- Meng de reactiecomponenten tot een eindvolume van 120 μl (tabel 3) in een zwarte kwartscuvet met een venster van 3 x 5 mm en een minimaal inwendig volume van 100 μl.
- Gegevensanalyse
- Zet de verhouding F500/F430 uit als functie van de tijd, wat een kwalitatieve indicator is van de ATP/ADP-verhouding. Voor een meer kwantitatieve beoordeling van ATP-vorming construeert u een kalibratiecurve in proteoliposomen of gebruikt u een aanvullende benadering (bijv. ATP-kwantificering door chemiluminescentie28).
- Detectie van ATP-synthese door fluorescentie
| Bestanddeel | Eindconcentratie |
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 |
| DTT | 2 mM |
| Na-ADP | 10 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| L-ornithine | 0,5 mM |
| Fluorescerende sonde (PercevalHR of pyranine) | Respectievelijk 5,8 μM of 0,1 mM |
| ArcA (arginine deiminase) | 1 μM |
| ArcB (ornithine carbamoyltransferase) | 2 μM |
| ArcC1 (carbamaatkinase) | 5 μM |
| GlpK (Glycerol kinase) | 1,6 μM |
| Proteoliposomen | 33,33 mg/ml totale lipiden |
Tabel 2: Inkapselingscomponenten. De componenten staan op volgorde van optelling. Oplosbare eiwitten zitten in Buffer E; alle andere componenten (behalve MgCl2, in gedeïoniseerd water) bevinden zich in buffer A.
| Bestanddeel | Eindconcentratie |
| Buffer K | 50 mM KPi pH 7.0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0 |
| Proteoliposomen (5,55 mg/ml lipiden) | 2,7 mg/ml lipiden |
| Ionoforen (valinomycine, nigericine) | 1 μM elk |
Tabel 3: Experimentele omstandigheden. De componenten staan op volgorde van optelling. Proteoliposomen bevinden zich in Buffer N, ionoforen in DMSO of EtOH.
4. Opschaling van een metabool netwerk voor blaasjes ter grootte van een micrometer
- Dag 1
- Bereiding van microfluïdische chips
OPMERKING: Dit experiment maakt gebruik van een microfluïdisch apparaat ontwikkeld door Robinson et al.34. Andere ontwerpen van microfluïdische chips zijn beschikbaar 35,36,37 en kunnen eenvoudig in dit protocol worden geïmplementeerd.- Snijd een pipetpunt van 200 μl op een derde van de bodem en steek het onderste deel van de punt in een kant-en-klaar microfluïdisch opvangapparaat.
- Voeg aan het inlaatreservoir van de chip 400 μL β-caseïneoplossing (2 mg/ml; zie stap 1.5) toe, zorg ervoor dat er bij deze stap geen lucht binnendringt. Plaats een emmer met 96 putjes en voeg een laboratoriumweefsel toe aan een kegelvormige buiscentrifuge op tafel. Plaats de chip op het weefsel en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 900 × g om passivering van de microfluïdische chip mogelijk te maken. Na de centrifugatiestap moet het vloeistofniveau gelijk zijn op het inlaatreservoir en de uitlaatpunt van de microfluïdische chip; Controleer op lekkage van de chip. Incubeer de β-caseïneoplossing in de microfluïdische chip gedurende ten minste 30 minuten.
- Verwijder het grootste deel van de passiveringsoplossing zonder lucht toe te voegen en voeg 400 μl wasbuffer (buffer P) toe. Plaats de chip op de plaatemmer met 96 putjes en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 900 × g . Laat de chip in de wasoplossing staan tot gebruik (maximaal 4 uur).
- Bereiding van microfluïdische chips
- Gelpreparaat voor het maken van proteo-GUV's
OPMERKING: De volgende beschrijving is overgenomen en aangepast van 25,38.- Los 0,5% (m/m) van een agarose met lage geleertemperatuur (LGT) op in gedeïoniseerd water door de oplossing in de magnetron te verwarmen; Zorg ervoor dat de agarose volledig is opgelost en vermijd het koken van de oplossing. Houd de agarose op 50 °C tot verder gebruik.
OPMERKING: Opgeloste agarose kan enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard. Om de agarose opnieuw te gebruiken, smelt je de gel gewoon met een magnetron. - Neem twee objectiefdia's en teken de omtrek van de afstandhouder op de dia's. Maak de glaasjes hydrofiel door plasmareiniging, met behulp van plasma met een hoog zuurstofgehalte gedurende 1 minuut.
- Voeg LGT-agarose toe aan de bovenkant van het objectglaasje totdat het volledig bedekt is met agarose (~500 μL); Kantel vervolgens de dia in een hoek van 90 ° en giet overtollige agarose af op een tissue. Laat de glijbanen 30 minuten staan bij 50 °C.
- Neem proteoliposomen opgeslagen in vloeibare stikstof (sectie 3) en ontdooi op ijs. Verdun de blaasjes tot 5 mg/ml lipiden met behulp van buffer Q.
OPMERKING: Proteoliposomen bereid in sectie 3 bevatten geen oplosbare eiwitten en kunnen ruim van tevoren worden bereid als ze in vloeibare stikstof worden bewaard. Zorg er bij het werken met proteoGUV's voor dat u de werkoplossingen altijd filtert om verstopping van het microfluïdische apparaat te voorkomen. - Sonificeer de proteo-liposomen met behulp van een draagbare sonde-sonde met een sonde van 1 mm. Sonicaat gedurende 10 cycli van 0,5 s aan en 0,5 s uit bij 70% amplitude. Houd de blaasjes, hierna proteoSUV's genoemd, 30 s op ijs en herhaal het sonicatieproces 5x.
- Vul een spuit van 100 μL (in een draagbare LCP-dispenser) met de proteo-SUV-ophanging. Breng 0,5 μL druppeltjes proteo-SUV's aan op de eerder bereide agarosegel; Zorg ervoor dat u de agaroselaag niet verstoort en voldoende afstand houdt om te voorkomen dat druppels samensmelten.
OPMERKING Het gebruik van een draagbare LCP-dispenser maakt druppelafzetting op een reproduceerbare manier mogelijk, maar er kunnen ook alternatieve pipetteersystemen worden gebruikt. Spotten met een glazen capillair is minder geschikt omdat het de gedroogde agarosegel verstoort. - Droog de SUV-druppels in ~10 minuten met behulp van een stikstofstroom in plaats van perslucht om de kans op oxidatie van de lipiden te verkleinen.
- Bereid 1 ml van een 1,25x geconcentreerde buffer O (tabel 4) in buffer A en passeer deze door een celluloseacetaatfilter van 0,2 μm. Neem 800 μl van de 1,25x geconcentreerde oplossing en voeg de oplosbare enzymen en sondes toe tot een concentratie zoals aangegeven in tabel 4. Gebruik gefilterd gedeïoniseerd water om het uiteindelijke volume 1 ml te maken.
- Bereid 100 μL zweloplossing die alle bestanddelen van tabel 4 bevat, met uitzondering van eiwitten en glycerol. Meet de osmolaliteit van de zweloplossing met behulp van een 3-punts gekalibreerde vriespuntosmometer.
OPMERKING: Bereid 100 μL zweloplossing zonder eiwit en glycerol om de osmolaliteit van deze oplossing nauwkeurig te bepalen. Glycerol, dat aanwezig is in de eiwitoplossing, beïnvloedt de osmolaliteit, maar bij GUV's diffundeert glycerol snel door het membraan en leidt dit alleen tot voorbijgaande osmotische verschillen. - Zet de GUV-zwelkamer in elkaar door een sandwich te maken van twee objectiefglazen met daarin de gel en gedroogde SUV's met daartussen een 1,5 of 3,0 mm dikke Teflon afstandhouder. Voeg vervolgens de zwellingsoplossing in de kamer toe door het kleine gaatje in de zijkant met behulp van een spuit en naald.
OPMERKING: Het volume van de zweloplossing kan worden aangepast door de afstandhouders te variëren van 1,5 tot 3,0 mm.
- Los 0,5% (m/m) van een agarose met lage geleertemperatuur (LGT) op in gedeïoniseerd water door de oplossing in de magnetron te verwarmen; Zorg ervoor dat de agarose volledig is opgelost en vermijd het koken van de oplossing. Houd de agarose op 50 °C tot verder gebruik.
- Zwelling van blaasjes en oogsten van GUV's
- Laat de zwelling van de blaasjes toe door de kamer gedurende ten minste 30 minuten op 22 °C te zetten.
OPMERKING: De zwelling van de blaasjes kan worden gevolgd door lichtmicroscopie (bijv. een tafelmodel fasecontrastmicroscoop of een breedveld fluorescentiemicroscoop) als de eiwitten of lipiden fluorescerend zijn gelabeld. - Oogst de GUV's uit de gel door zachtjes fysiek te roeren door met de kamer op een stevig oppervlak te tikken (bijv. laboratoriumbank); neem een derde van het volume weg en gebruik de resulterende luchtbel om de resterende vloeistof voorzichtig in beweging te brengen, waardoor de GUV's van de gel worden losgemaakt.
- Terwijl de GUV's opzwellen, bereidt u buffer P voor en stemt u de osmolaliteit af op de zwellingsoplossing door de glucoseconcentratie aan te passen. Filtreer de buffer door een spuitfilter van 0,2 μm.
OPMERKING: Over het algemeen moet de was- en substraatoplossing binnen ± 5 mosmol/kg worden gehouden. Elke oplossing die door de chip gaat, moet zeer schoon zijn, omdat verontreinigingen de kanalen kunnen verstoppen. Maak telkens verse buffers of bewaar voorbereide buffers bij -20 °C en filtreer voor gebruik.
- Laat de zwelling van de blaasjes toe door de kamer gedurende ten minste 30 minuten op 22 °C te zetten.
- Vangen van de GUV's voor microscopie-experimenten
- Monteer de gepassiveerde microfluïdische chip op de monstertafel van de microscoop. Controleer op mogelijke defecten (bijv. lekken, ingesloten lucht, verstopte kanalen).
OPMERKING: Het controleren van de chip kan ruim voor gebruik worden gedaan, zodat indien nodig een nieuwe chip kan worden voorbereid. - Sluit de slang met een gebogen naald aan op de uitlaat van het reservoir en sluit het andere uiteinde aan op een spuit van 1 ml. Monteer de spuit op een pomp en stel het debiet in op maximaal 10 μL/min.
- Verwijder de wasbuffer uit het reservoir (stap 4.1.1.3) en vervang deze door vers medium (buffer P). Start de bufferstroom door de chip door via de spuit te infuseren met 1-10 μL/min. Wassen met ten minste 80 μL osmotisch uitgebalanceerde wasbuffer (Buffer P).
- Verwijder overtollige wasbuffer uit het reservoir en voeg de (proteo)GUVs toe aan het reservoir. Stel het debiet in op 0,1- 1 μL/min om de GUV's door de chip te laten stromen. Bewaak de chip in de loop van de tijd totdat er voldoende GUV's in de chip zijn opgesloten.
OPMERKING: Blaasjes met relatief grote hoeveelheden (>20 mol%) geladen lipiden zoals fosfatidylglycerol (PG), fosfatidylserine (PS) of fosfatidinezuur (PA) of niet-dubbellaagvormende lipiden zoals fosfatidylethanolamine (PE) worden met een lagere stroomsnelheid door de chip gebracht om barsten te voorkomen. Blaasjes die zijn samengesteld uit pure fosfatidylcholine (PC) hebben de neiging stabieler te zijn. - Verwijder overtollige GUV-oplossing en voeg wasbuffer P toe, met behulp van een constante stroom van 0,1-1 μL/min, om het externe medium te vervangen en de ingesloten GUV's gedurende ten minste 1 uur te wassen om niet-ingekapselde verbindingen te verwijderen en de achtergrondfluorescentie te verlagen wanneer een fluorofoor is ingekapseld. Bewaak de achtergrondfluorescentie in de loop van de tijd; Als de achtergrondfluorescentie niet afneemt, kan de chip worden geblokkeerd.
- Lokaliseer vallen met voldoende hoeveelheden blaasjes en sla hun posities op. Pas de instellingen op de microscoop toe (bijv. laserintensiteit, versterking, golflengte) en start een tijdreeksexperiment.
- Voeg osmotisch uitgebalanceerde substraatoplossing (buffer R) toe aan het reservoir en start een debiet van 0,5 μL/min.
- Monteer de gepassiveerde microfluïdische chip op de monstertafel van de microscoop. Controleer op mogelijke defecten (bijv. lekken, ingesloten lucht, verstopte kanalen).
| Buffer L componenten | ||
| Bestanddeel | 1.25 x concentratie | Concentratie op het werk |
| Buffer A | 62,5 mM KPi pH 7,0 | 50 mM KPi pH 7,0 |
| Sacharose | 125 mM | 100 mM |
| DTT | 2,5 mM | 2 mM |
| Na-ADP | 12,5 mM | 10 mM |
| MgCl2 | 12,5 mM | 10 mM |
| L-ornithine | 0,625 mM | 0,5 mM |
| Inkapseling componenten | ||
| Pyranine of PercevalHR | 1 mM of 20 μM | |
| ArcA (arginine deiminase) | 1 μM | |
| ArcB (ornithine carbamoyltransferase) | 2 μM | |
| ArcC1 (carbamaatkinase) | 5 μM | |
Tabel 4: Buffer O en inkapselingscomponenten. De componenten staan op volgorde van optelling. Alle componenten (behalve MgCl2, in gedeïoniseerd water) bevinden zich in Buffer A. De inkapselingscomponenten staan vermeld in volgorde van toevoeging. Alle wateroplosbare eiwitten zitten in Buffer E.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De reconstitutie van opgeloste membraaneiwitten in liposomen vereist de destabilisatie van voorgevormde blaasjes. De toevoeging van kleine hoeveelheden Triton X-100 resulteert in eerste instantie in een toename van de absorptie bij 540 nm (A540) als gevolg van een toename van de lichtverstrooiing door de zwelling van de blaasjes (Figuur 4). De maximale A540-waarde is het punt waar de liposomen verzadigd zijn met wasmiddel (Rsat), waarna elke verdere toevoeging van Triton X-100 zal resulteren in gedeeltelijke oplosbaarheid van de blaasjes. Bij Rsol zijn de liposomen volledig oplosbaar (Figuur 4). Voor de reconstitutie van membraaneiwitten gebruiken we meestal blaasjes die tot 60% voorbij Rsat zijn gedestabiliseerd (aangegeven met pijl).
Het gereconstitueerde membraaneiwit ArcD wordt gebruikt om L-arginine in en L-ornithine uit de blaasjes te transporteren en wordt samen met de ingekapselde enzymen ArcA, ArcB en ArcC gebruikt om ATP uit ADP en anorganisch fosfaat te recyclen. GlpT is een glycerol 3-fosfaat/fosfaat antiporter die samen met GlpK nodig is voor de synthese (en uitscheiding) van glycerol 3-fosfaat uit glycerol plus ATP geproduceerd door de afbraak van L-arginine. De toevoeging van 5 mM L-arginine bij t = 0 aan de proteoliposomen resulteert in een sterke toename van de verhouding van de PercevalHR-fluorescentie bij 500 en 430 nm excitatie39, die de ATP/ADP-verhouding in de blaasjes weerspiegelt (Figuur 5). Na toevoeging van glycerol wordt de ATP gebruikt voor de synthese van glycerol 3-fosfaat, wat resulteert in een verlaging van de ATP/ADP-verhouding28. De afbraak van L-arginine leidt ook tot pH-veranderingen, die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van pyranine of pHluorin27.
Figuur 5: Recycling van ATP via de L-arginine-afbraakroute. LUV's van 2,7 mg lipide/ml worden in een cuvet geplaatst en de verhouding van fluorescentie bij 500 nm en 430 nm wordt geregistreerd. 5 mM L-arginine wordt toegevoegd bij t = 0. De F500/F430-verhouding is een maat voor de ATP/ADP-verhouding in de blaasjes. Afkorting: LUV's = large-unilamellaire vesikels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De ATP-producerende LUV's kunnen ook worden gebruikt om GUV's te vormen. Rehydratatie van gedroogde proteo-LUV's op een LGT-agarosegel resulteert in de vorming van blaasjes ter grootte van een micrometer (Figuur 6). De vorming van proteo-GUV's in de gedroogde LUV-vlekken hangt sterk af van de lokale concentratie van lipiden en de mate van uitdroging. Sommige gebieden hebben grote plekken met GUV's, terwijl op andere plaatsen in dezelfde druppel geen of weinig GUV's kunnen worden gevormd. De vorming van GUV's via LGT-agarose-geassisteerde zwelling resulteert in een reeks GUV-groottes, meestal van enkele micrometers tot meer dan 50 μm.
Figuur 6: DIC-beelden van proteoGUV's gevormd door gel-geassisteerde zwelling. Schaal balk = 25 μm. Afkortingen: DIC = differentieel interferentiecontrast; GUVs = reusachtig-unilammellar blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De GUV's worden geoogst en opgesloten in een β-caseïne gepassiveerd PDMS-gebaseerd microfluïdisch apparaat (Figuur 7). Het apparaat is zo ontworpen dat veel blaasjes kunnen worden opgevangen en geanalyseerd binnen een enkel experiment, en het apparaat wordt gebruikt om de externe omgeving te regelen (stroomsnelheid, buffersamenstelling, enz.) 34. Zelfs wanneer het rendement van proteo-GUV's laag is, maakt de constante stroom van GUV's door de microfluïdische chip het mogelijk om veel blaasjes te verzamelen. Zodra er voldoende GUV's zijn opgevangen, wordt het systeem gewassen met een osmotisch uitgebalanceerde buffer om externe componenten zoals oplosbare eiwitten, kleine moleculen en fluorescerende sondes te verwijderen. De wasbuffer wordt vervolgens vervangen door een substraatoplossing van gelijke osmolaliteit met 50 mM KPi (pH 7,0), variërende hoeveelheden glucose (om de osmolaliteit aan te passen) en substraten zoals 10 mM L-arginine. Er wordt een tijdreeksexperiment uitgevoerd op verschillende vallen van de microfluïdische chip en er worden elke 90 s beelden gemaakt (405 nm en 488 nm excitatie wanneer PercevalHR wordt gebruikt). Verder wordt op elk tijdstip een helderveldopname gemaakt. De verhouding van de emissie-intensiteiten na excitatie bij 488 en 405 nm is een maat voor de ADP/ATP-verhouding in de blaasjes.
Figuur 7: Insluiting van blaasjes met de microfluïdische chip. (A) Insluiting van de blaasjes, vergezeld van het vermogen om de externe omgeving en het debiet te beheersen. (B) ProteoGUV's gevangen in een microfluïdisch apparaat en geëxciteerd met een laser van 405 nm (groen) en laser 488 (rood). De emissie voor beide kanalen wordt gemeten bij >500 nm. Het helderveldbeeld maakt visualisatie van de blaasjes mogelijk zonder fluorescentie. Schaal balk = 25 μm. Afkorting: GUVs = gigantisch-unilamellaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor de synthese van (membraan)eiwit met lipideblaasjes van minder dan een micrometer grootte (proteoLUV's), en de omzetting van proteoLUV's in reus-unilamellaire blaasjes (proteoGUV's). Het protocol moet van toepassing zijn op de reconstitutie van andere membraaneiwitten 13,19,30,40 en de inkapseling van andere metabole netwerken dan de hier gepresenteerde L-arginineafbraak- en glycerol-3-fosfaatsyntheseroutes.
De reconstitutie van membraaneiwitten in liposomen levert over het algemeen een willekeurige oriëntatie van de eiwitten binnen het lipidemembraan op. Voor ArcD en Glpt doet de oriëntatie er niet toe, omdat de eiwitten bidirectioneel werken en de opgeloste stoffen bewegen afhankelijk van het teken van de totale elektrochemische potentiaal. Voor eiwitten die in één richting functioneren, zal de helft van de moleculen niet beschikbaar zijn voor activiteit wanneer hun oriëntatie 50/50 is.
De extrusie van blaasjes door een polycarbonaatfilter vernauwt de grootteverdeling en de blaasjes worden homogener naarmate de poriegrootte van de filters kleiner is. Kleinere blaasjes gaan echter ten koste van een kleiner volume en dus een zeer klein aantal eiwitten (enzymen, membraaneiwitten) per blaasje. Om het aantal LUV's waarbij een of meer componenten ontbreken tot een minimum te beperken, kan de concentratie van de eiwitten worden aangepast zoals weergegeven in figuur 3A,B, maar bij zeer kleine blaasjes zijn stochastische effecten onvermijdelijk.
De gel-geassisteerde zwellingsmethode is gebaseerd op de afzetting van gesoniceerde blaasjes (SUV's) op een gedroogd agarose-oppervlak. Tijdens het droogproces wordt een concentratiegradiënt van blaasjes gevormd en de lipidenconcentratie is het hoogst aan de rand van de plek. Dit komt door een fenomeen dat bekend staat als het koffievlekeffect 41,42. Als gevolg hiervan bevat slechts een klein gebied in de vlek een concentratie lipiden die geschikt zijn voor GUV-vorming. Cirkelvormige ongelijk geconcentreerde lipidevlekken resulteren in grote ongebruikte gebieden die niet beschikbaar zijn voor blaasjesfusie; vandaar dat de efficiëntie van GUV-vorming bij deze aanpak laag wordt. Om de opbrengst van GUV's te verhogen, moet men streven naar een uniforme lipideafzetting, die kan worden bereikt door coating42 te draaien of gebruik te maken van het koffievlekeffect41.
Verdere opmerkingen over het protocol:
Er moet voor worden gezorgd dat gemiddeld meerdere membraaneiwitten (>10) per blaasje worden gereconstitueerd om stochastische effecten te voorkomen. Vermijd dus lipide-eiwitverhoudingen hoger dan 400:1 w/w. Voor de meeste eiwitten wordt uitgegaan van een willekeurige oriëntatie.
Idealiter is het volume van de totale membraaneiwitten zo klein mogelijk en komt het in ieder geval niet boven de 10-20% van het liposoomvolume uit. Door grotere volumes toe te voegen, wordt er meer wasmiddel geïntroduceerd en kunnen de meeste voorgevormde liposomen lyseren, wat een negatief effect kan hebben op de efficiëntie van de reconstitutie.
Pre-equilibratie van de extruder met de juiste oplossing is belangrijk om verdunning van de componenten tijdens de inkapseling te voorkomen. Idealiter zou de pre-equilibratieoplossing ook de oplosbare enzymen moeten bevatten, maar het opnemen van enzymen kan te duur zijn vanwege het relatief grote volume dat nodig is voor de pre-equilibratie van de extruder. Daarom laten we deze componenten meestal weg en accepteren we een verdunning van 5% van de enzymen.
Ionoforen moeten worden toegevoegd aan de mengsels die proteoliposomen bevatten, omdat de moleculen sterk hydrofoob zijn en aan oppervlakken kunnen adsorberen als er geen blaasjes aanwezig zijn. Er moet voor worden gezorgd dat de hoeveelheid toegevoegd oplosmiddel laag is (<1% van het totale reactievolume). Er worden controles uitgevoerd om te controleren of de oplosmiddelen de metabolische netwerken in de blaasjes niet beïnvloeden. Ionofoorconcentraties van ongeveer 1 μM zijn over het algemeen veilig voor totale lipideconcentraties van ~3 mg/ml.
Zorg ervoor dat de druppels goed worden gedroogd. Als de druppels niet droog genoeg zijn, is de vorming van GUV minder efficiënt, omdat lipiden lipideaggregaten vormen en MLV's kunnen worden gevormd wanneer de zwellingsoplossing wordt toegevoegd.
Glucose wordt gebruikt om de osmolariteit van het externe met het interne medium af te stemmen; deze laatste bevat sucrose in plaats van glucose om de dichtheid van de blaasjes te verhogen en zo de sedimentatie van de GUV's te vergemakkelijken. Bovendien versterkt glucose in de externe omgeving het fasecontrast, waardoor het blaasje beter zichtbaar wordt.
Stochastische effecten zijn veel minder een probleem met GUV's; Maar hier kan de verhouding tussen oppervlak en volume onaanvaardbaar laag worden, zodat het aantal membraaneiwitten (bijv. transporters) beperkend wordt voor het interne metabolische netwerk. De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt geen nauwkeurige controle over de grootte van de proteoGUV's mogelijk, maar de meeste vallen in het groottebereik van 5-50 μm.
Concluderend biedt het hier gepresenteerde werk een uitgebreid overzicht van membraaneiwitreconstitutie en enzyminkapseling in lipideblaasjes van verschillende groottes. We demonstreren de constructie van functionele blaasjes voor de synthese van ATP en bouwstenen van eenvoudige precursoren zoals aminozuren en glycerol. Het reconstitueren van membraaneiwitten in GUV's blijft een uitdaging, maar de hier gepresenteerde protocollen maken de weg vrij voor verdere ontwikkelingen in bottom-up synthetisch biologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Aditya Iyer voor het klonen van het pBAD-PercevalHR-gen en Gea Schuurman-Wolters voor haar hulp bij de productie en zuivering van eiwitten. Het onderzoek werd gefinancierd door het NWO Zwaartekracht programma "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | - | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
- Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
- Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
- Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
- Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
- Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
- Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
- Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
- Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
- Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
- Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
- Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
- Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
- Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
- Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
- Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
- Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
- Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
- Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
- Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
- Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
- Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
- Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
- Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
- Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
- Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
- Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
- Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
- Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
- Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
- Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).
