Immunology and Infection

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53053

Andréa Allaire¹, Frédéric Picard-Jean¹, Martin Bisaillon¹

¹Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke

Abstract

المناعي هو تقنية المختبرات تستخدم عادة لدراسة جوانب كثيرة من الأحياء. وعادة ما يتم استخدامه لتصور توزيع و / أو توطين جزيء الهدف في الخلايا والأنسجة. تعتمد المناعي على خصوصية الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى ضد المستضدات يناظرها داخل الخلية. كلا النهجين المباشرة وغير المباشرة المناعي يمكن أن تستخدم التي تعتمد على استخدام الأجسام المضادة ترتبط مع تألقي. وأقل استخداما المناعي المباشر لأنه يوفر أدنى إشارة، ينطوي على ارتفاع تكلفة وأقل مرونة. في المقابل، يستخدم المناعي غير المباشر أكثر شيوعا بسبب حساسية عالية ويوفر إشارة تضخيم منذ الضد الثانوية أكثر من واحد يمكن أن نعلق على كل الأجسام المضادة الأولية. في هذه المخطوطة، واستخدمت كل من المجهري epifluorescence ومتحد البؤر المجهري لمراقبة استيعاب اللاكتوفيرين الإنسان، وهو عنصر مهم من جهاز المناعةالنظام، في الخلايا الكبدية. وعلاوة على ذلك، ونحن رصد إمكانات المثبطة للمؤسسة الأرض المقدسة على تكرار داخل الخلايا لفيروس التهاب الكبد C باستخدام المناعي. كلاهما مناقشة مزايا وعيوب المرتبطة بهذه النهج.

Protocol

1. خلايا إعداد والعلاج

في لوحة 24-جيدا، ووضع غطاء من الزجاج في الجزء السفلي من الآبار. يغسل كل جيدا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
البذور هوه-7 خلايا دعم HCV ريبليكون subgenomic في كل بئر لكثافة 5 × 10 ⁴ خلايا / جيد. إذا لم يكن هناك علاج لذلك، الخلايا يمكن المصنف في مناطق ذات كثافة أعلى. مستنبت هو Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ من الجنين مصل بقري (FBS)، 2mm و L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم و 250 ملغ / مل G-418 (للحفاظ على ريبليكون).
احتضان عند 37 ° C وCO _2. في اليوم التالي 5٪، وعلاج الخلايا مع 3 ميكرومتر من مؤسسة الأرض المقدسة تنقيته من الحليب البشري.

2. امتصاص العرق / إعداد السكروز (12٪ القوات الجوية الباكستانية و 12٪ سكروز)

وضع 500 مل من برنامج تلفزيوني في كوب وتسخينها بين 20 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. حل 60 غرام من السكروز في برنامج تلفزيوني. حل 60 غرام من paraformaldehyde (القوات الجوية الباكستانية) في برنامج تلفزيوني / محلول السكروز. إضافة ببطء هيدروكسيد الصوديوم 2N (3-7 مل) حتى يتم الحصول على حل واضح.
ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. حجم الكامل إلى 500 مل مع برنامج تلفزيوني. تصفية عن طريق الجاذبية على مرشح هتما. قبل الاستخدام، وتمييع الحل مع برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 4٪ القوات الجوية الباكستانية و 4٪ السكروز (التخزين 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع كحد أقصى).

3. المناعي

في الوقت المطلوب (0 ساعة، 2 ساعة أو 24 ساعة من العلاج)، وغسل الخلايا مرتين (1 دقيقة) مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع PBS / 4٪ القوات الجوية الباكستانية / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة في RT. الخلايا عادة في 30-40٪ التقاء وتستخدم 1.5X10 ⁵ الخلايا.
Permeabilize الخلايا مع 0.15٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT وكتلة في 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
تمييع الأجسام المضادة الأولية من البروتين من الفائدة في 10٪ NGS (على سبيل المثال: الماوس الرئيسي لمكافحة HLF الأجسام المضادة المخفف 1: 1000). تطبيق الأجسام المضادة الأولية للخلايا.
بعد 4 ساعات في RT أو O /N عند 4 درجات مئوية، وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 10٪ NGS. وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع تألقي مخففة في 10٪ NGS (على سبيل المثال: تألقي مع الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر ترتبط الأجسام المضادة لمكافحة فأر 1: 1000) لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
غسل خلايا مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني وصمة عار على الخلايا مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) (1 ميكروغرام / مل) لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
غسل الخلايا مرتين لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. جبل تغطية النظارات على SlowFade المتوسطة المتزايدة قبل التصور من خلال المجهر. الخلايا هي الآن جاهزة لتحليلها من قبل epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.
استخدام عناصر التحكم المختلفة لضمان خصوصية الكشف. على سبيل المثال، عن الأجسام المضادة يمكن أن يكون تم حذفها من أجل الكشف عن تألق ذاتي. يمكن حذف الأجسام المضادة الأولية لتحديد تلطيخ غير محدد من الأجسام المضادة الثانوية. وأخيرا، إذا كان ذلك ممكنا، والخلايا أو الأنسجة التي لا تحكمويمكن أيضا التعبير عن جزيء من الفائدة يمكن استخدامها.
تصور العينات باستخدام المجهر المناسب مضان (epifluorescence أو متحد البؤر) ومجموعات مرشح مناسب لتسمية الفلورسنت المستخدمة. الشرائح ويمكن أيضا أن تكون مخزنة في مربع الشريحة في <-20 ° C للفحص لاحقا.

4. مضان المجهر

الحفاظ على العينات في الظلام لمنع photobleaching من. بدوره على مصدر ضوء المجهر المختار (epifluorescence أو متحد البؤر).
بدوره على المجهر. تشغيل الكاميرا لالمجهر. وضع الشريحة على المجهر التصور. إضافة زيت الغمر على الشريحة لزيادة الفتحة العددية للعدسة موضوعية.
حدد الفلاتر المناسبة. ضبط التركيز والهدف المناسب. ضبط مصاريع من أجل الكشف عن تألقي المناسب ولكن منع photobleaching من. إبقاء الأضواء العلوية من لتقليل ضوء الخلفية عند النظر في العينة.
التغيير عشرمرشحات البريد لتصور fluorochromes مختلف (على سبيل المثال دابي وللحصول على الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر). التقاط الصور مع الكاميرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم رصد قدرة الكبد هوه-7 خط الخلية لاستيعاب الناجزة خارجيا مؤسسة الأرض المقدسة باستخدام المناعي على miscroscope مبائر. وأضاف مؤسسة الأرض المقدسة إلى وسائل الإعلام والثقافة، وسمح للاستيعاب لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك، تم غسلها خارج الخلية مؤسسة الأرض المقدسة مع برنامج تلفزيوني وتدهور الغشاء المتبقية ملزمة مؤسسة الأرض المقدسة مع 5 دقائق التربسين العلاج (1 مل). تم reseeded الخلايا ويسمح لإعادة الالتزام لل18 ساعة قبل تلوين المناعي. من أجل توضيح حدود حشوية، وكانت ملطخة أغشية الخلايا التي تحتوي على جرثومة القمح راصة (WGA) تألقي من الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر المترافقة. وقد تحقق تلطيخ مؤسسة الأرض المقدسة باستخدام الأجسام المضادة الأولية المناهضة للمؤسسة الأرض المقدسة وتألقي مع طول موجة من 633 نانومتر ترتبط الأجسام المضادة الثانوية. من أجل تحديد التعريب الدقيق للمؤسسة الأرض المقدسة، تم تصوير الخلايا التالية المتسلسل 0.5 ميكرون الأفقي المقطع العرضي بواسطة المجهر متحد البؤر الشكل 4 يقدم التقيدكال المقطع العرضي المقابلة لسمك خلية منتصف. بعد إضافة عوامل خارجية مؤسسة الأرض المقدسة، تم الكشف عن كمية كبيرة من مؤسسة الأرض المقدسة داخل سيتوبلازم خلايا الكبد. لم يلاحظ أي مؤسسة الأرض المقدسة داخل الخلايا غير المعالجة عند استخدام إعدادات فعال متطابقة. معا، وتؤكد هذه البيانات أن خلايا الكبد لديها القدرة على اكتساب مؤسسة الأرض المقدسة من بيئتهم خارج الخلية.

قدرة مؤسسة الأرض المقدسة لمنع وتكرار داخل الخلايا HCV المقبل رصدها باستخدام المجهر epifluorescence. وعولج هوه-7 خلايا دعم HCV ريبليكون subgenomic (معربا عن HCV NS3، NS4A، NS4B، NS5A والبروتينات NS5B) النسخ المتماثل مع 3 ميكرومتر مؤسسة الأرض المقدسة لل0، 2 أو 24 ساعة. تم تحليل تلطيخ المزدوج المناعي لمؤسسة الأرض المقدسة وHCV NS5A البروتينات بواسطة المجهر epifluorescence. هذه النتائج تشير إلى أن تلطيخ HCV ريبليكون subgenomic (مقاسا المناعي للHCV غير الهيكلية بروتين 5A) تم تخفيض في الخلايا تعامل مع مؤسسة الأرض المقدسة الشكل 5 ترونج> يكشف عن تخفيض نوعي ما يقرب من 50٪ في HCV كثافة تلطيخ بعد 24 ساعة من العلاج مؤسسة الأرض المقدسة. هذا هو ملاحظة مثيرة للاهتمام لأن هذا النظام ريبليكون subgenomic ينقصنا HCV E1 و E2 بروتينات سكرية المغلف، والتي هي أهداف الدوائية المقبولة عموما من مؤسسة الأرض المقدسة. يصاحب ذلك من تراجع HCV تلطيخ، بدأ تراكم مؤسسة الأرض المقدسة ليتم الكشف بعد 2 ساعة، ولوحظ تراكم مؤسسة الأرض المقدسة قوية بعد 24 ساعة.

الشكل 1. مبدأ المجهر epifluorescence. في هذا النوع من الفحص المجهري، والمرشحات الإثارة اختيار الطول الموجي المحدد الذي يثير العينة (tissus أو خلايا إيواء الأجسام المضادة الفلورسنت المسمى). وعلاوة على ذلك، يتم اختيار المرشحات الانبعاثات لتتناسب مع خصائص الانبعاثات الطيفية للfluorophore يستخدم لوصف العينة.تحميل / 53053 / 53053fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مبدأ متحد البؤر المجهري. ويستخدم هذا النوع من الفحص المجهري لالثقب الانبعاثات للقضاء خارج نطاق التركيز ضوء الإشارة. منذ ضوء فقط التي تنتجها مضان قريب جدا من المستوى البؤري يمكن الكشف عنها، القرار البصري للصورة هو أفضل بكثير من المجاهر epifluorescence. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تخطيطي لالمناعي غير المباشر والمباشر. ويشمل المناعي المباشرنوع واحد فقط من الأجسام المضادة المسمى مع تألقي التي تقتصر على جزيء من الفائدة (الأجسام المضادة الأولية). في المقابل، المناعي غير المباشر ينطوي على الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع fluorochromes التي هي محددة لأنواع من الأجسام المضادة الأولية التي لا تحمل علامات. أكثر من الأجسام المضادة الثانوية يمكن للمرء أن نعلق على كل الأجسام المضادة الأولية مما يزيد من إشارة مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
وعولج الشكل 4. الكبدي امتصاص الخارجية مؤسسة الأرض المقدسة. هوه-7 الخلايا مع 0 ميكرومتر أو 3 ميكرومتر مؤسسة الأرض المقدسة لمدة 24 ساعة، وغسلها مرتين، المقدم إلى العلاج التربسين 5 دقائق، سمح لإعادة الالتزام لل18 ساعة وتعرض لالمناعي. كانت ملطخة نوى ثكانت ملطخة دابي إيث (القناة الزرقاء)، وصفت أغشية البلازما مع WGA (قناة خضراء) ومؤسسة الأرض المقدسة مع الأجسام المضادة لمكافحة مؤسسة الأرض المقدسة (القناة الحمراء). تم الحصول على الصور بواسطة المجهر متحد البؤر في والتكبير الأصلي من 60X. تمثل الأفقية البصرية المقاطع العرضية في منتصف سمك الخلايا. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. تعديل من (11). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. العلاج مؤسسة الأرض المقدسة يقلل HCV تلطيخ. وعولج هوه-7 خلايا دعم تكرار HCV ريبليكون subgenomic مع 3 ميكرومتر مؤسسة الأرض المقدسة لل0، 2، أو 24 ساعة وتعرض لالمناعي. كانت ملطخة النوى مع دابي (القناة الزرقاء)، تم الكشف عن فيروس (سي) عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة NS5A (القناة الحمراء) وكانت ملطخة مؤسسة الأرض المقدسة مع مضاد للمؤسسة الأرض المقدسة لntibody (قناة خضراء). تم الحصول عليها من صور المجهر epifluorescence في والتكبير الأصلي من 60X. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. تعديل من (11). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا يزال وباء فيروس (سي) يشكل تهديدا عالميا، مع 80٪ من المرضى المصابين حديثا تطوير عدوى مزمنة، مما يعرضهم لخطر تليف الكبد، وفشل الكبد أو سرطان الكبد. العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف تكرار HCV والنضج التصرف المباشر تمثل رئيس كلاء المضادة للفيروس (سي)، كما تبين مؤخرا الموافقة التنظيمية على اثنين NS3 N-محطة مثبطات الأنزيم البروتيني (Boceprevir وTelaprevir). ويعتقد أن مؤسسة الأرض المقدسة النشاط المضاد للفيروس (سي) حاليا في التصرف كما المانع دخول الفيروس، ملزمة تعميم virions ومنعهم من الدخول إلى هدفهم الكبد. أبحاثنا على مؤسسة الأرض المقدسة ويعرض آلية جديدة داخل الخلايا المضادة للفيروس (سي) من العمل (متميزة من خارج الخلية الفيريون تحييد) ^7.

المناعي يمكن استخدامها بكفاءة لتصور توزيع و / أو توطين جزيء الهدف في عينة بيولوجية. كما وجدت في العديد من التقنيات مضان أخرى، واحدة من المؤيدين الرئيسيblems المرتبطة المناعي وphotobleaching من (التدمير الضوئي من تألقي) ^8. هذه الخسارة من النشاط الناجم عن photobleaching من يمكن التحايل عليها إما عن طريق استخدام fluorochromes أكثر قوة التي هي أقل عرضة للphotobleaching من أو عن طريق الحد من شدة أو فترة زمنية من التعرض للضوء. وعلاوة على ذلك، لأن الأجسام المضادة لا يمكن أن يخترق غشاء الخلية، المناعي بشكل عام يقتصر فقط على الخلايا الثابتة. النهج البديلة لمراقبة توزيع / توطين البروتينات في الخلايا الحية تعتمد بالتالي عموما على التعبير عن البروتينات التي تحتوي على المجالات بروتين فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ^9. ومع ذلك، فإن إضافة هذه الحواتم GFP أحيانا يترافق مع تعديل في توطين ونشاط البروتينات. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعي على عدد من العينات المختلفة بما في ذلك قطاعات النسيج، وخطوط خلايا مستنبتة أو الخلايا الفردية كما انها تستخدم في كثير من الأحيان لمراقبةتوطين / توزيع البروتينات، glycans، والجزيئات الصغيرة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية تكمن في بساطته وحقيقة أنه يمكن أن تستخدم في تركيبة مع أساليب أخرى، غير الضد من تلطيخ فلوري (على سبيل المثال، وتلطيخ DNA). وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة الثانوية المنتجة تجاريا هي رخيصة نسبيا ومتوفرة في مجموعة واسعة من الألوان.

في الدراسة الحالية، وكشف المناعي للخلايا الكبدية الداعمة لHCV ريبليكون subgenomic تخفيض نوعي في كثافة HCV تلطيخ على العلاج مع مؤسسة الأرض المقدسة. هذا هو ملاحظة مثيرة للاهتمام لأن هذا النظام ريبليكون subgenomic ينقصنا HCV E1 و E2 بروتينات سكرية المغلف، والتي هي أهداف الدوائية المقبولة عموما من مؤسسة الأرض المقدسة. على عكس الخلية النشاط الفيريون تحييد، ستحتاج مؤسسة الأرض المقدسة ليكون داخليا من قبل خلايا الكبد المصابة HCV بهدف إضعاف تكاثر الفيروس. استخدام fuorescence المجهر سمح لنا evaluأكل هذا الاحتمال. على مرحلة ما قبل الحضانة على خلايا الكبد المصابة HCV، والمنضوية بنجاح خارجية المنشأ مؤسسة الأرض المقدسة، وتبين أن تنال تكاثر الفيروس داخل الخلايا. فهم هذا HLF نشاط مضاد للفيروسات رواية يشكل خطوة إلى الأمام في فهم آلية (عديد المظاهر والأرجح) العالمي لتثبيط هذا البروتين الحصانة الفطرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca²⁺& Mg²⁺
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4 (2013).
Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).