Abstract
免疫是通常用于研究生物学的许多方面实验室技术。它通常用于可视化目标分子的细胞和组织中的分布和/或定位。免疫荧光依赖于对小区内其相应的抗原的荧光标记的抗体的特异性。直接和间接的免疫荧光方法可以用于其中依靠使用带有荧光联抗体。直接免疫是不经常使用的，因为它提供较低的信号，涉及到较高的成本和更少的灵活性。与此相反，间接免疫荧光更常用，因为其高灵敏度和提供放大的信号，因为一个以上的次级抗体可以附加到每个主抗体。在这份手稿，无论是荧光显微镜和共聚焦显微镜被用来监测人乳铁蛋白的内化，免疫的重要组成部分系统，进入肝细胞。此外，我们监测了使用免疫荧光的丙型肝炎病毒的细胞内复制的hLF的抑制潜能。都与这些方法相关的优点和缺点进行了讨论。
Protocol
1.细胞制备与处理
- 在一个24孔板，把一个玻璃盖在孔的底部。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤各孔。
- 种子Huh-7细胞在每孔配套的HCV亚基因组复制到5×10 4个细胞的密度/孔。如果没有治疗做，细胞可以在更高的密度接种。培养基是Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和250毫克/毫升的G-418（以维持复制子）。
- 在37℃和5％的CO 2。第二 天，处理细胞以3微米的hLF的从人乳纯化。
2.多聚甲醛/蔗糖制备（12％的PAF和12％蔗糖）
- 把500个毫升的PBS在一个烧杯中，并加热它在20℃至30℃。溶解60克蔗糖的PBS中。溶解60克的多聚醛（PAF）在PBS /蔗糖溶液中。慢慢加入氢氧化钠2N（3至7毫升）中获得澄清溶液为止。
- 调节pH至7.4，用HCl。完整体积至500ml，用PBS。通过重力的滤纸过滤器过滤。在使用前，稀释用PBS溶液至4％的PAF和4％蔗糖（寄存4℃，1周最大）的终浓度。
3.免疫
- 在所需的时间（0小时，2小时或24的治疗小时），洗涤细胞两次（1分钟），用PBS并用PBS / 4％PAF / 4％蔗糖固定20分钟，在室温。所述细胞通常是在30-40％汇合和1.5×10 5个细胞的使用。
- 透化在PBS中的10％正常山羊血清（NGS）将细胞用0.15％的Triton X-100的PBS进行5分钟，在RT和块20分钟。
- 稀释的感兴趣的蛋白质的一次抗体，在10％NGS（例如：主小鼠抗体hLF抗体稀释1：1000）。应用第一抗体的细胞。
- 4小时后在室温下或O /北，4℃，洗细胞三次，持续5分钟，用10％NGS。细胞染色与标记荧光染料稀释在10％NGS的二级抗体（例如：荧光染料具有488纳米连接于抗体抗小鼠1的激发波长：1,000）在RT在黑暗1小时。
- 一次5分钟，用PBS洗涤细胞，并将细胞染色用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1微克/ ml）在室温15分钟在黑暗中。
- 5分钟两次，用PBS洗涤细胞。盖山在SlowFade安装介质眼镜通过显微镜可视化之前。这些细胞是现在可以通过荧光或共聚焦显微镜分析。
- 使用不同的控制，以确保检测的特异性。例如，所有抗体可为了检测自体荧光被省略。第一抗体可以被省略，以确定由所述第二抗体的非特异性染色。最后，如果可能，控制不这样做的细胞或组织表达也可用于感兴趣的分子。
- 可视化使用适当的荧光显微镜（epifluorescence的或共焦）和过滤器组适合于所使用的荧光标记的样品。幻灯片也可以存储在<-20℃供以后检查一个滑动箱。
4.荧光显微镜
- 保持样品在黑暗中以防止光漂白。打开所选择的显微镜（萤光或共焦）的光源。
- 打开显微镜。打开相机的显微镜上。把滑动显微镜上进行可视化。添加浸油在滑动以增加物镜的数值孔径。
- 选择适当的过滤器。调整的重点和合适的目标。调节百叶窗以便检测适当的荧光染料，但防止光漂白。请顶灯关在看样品，以尽量减少背景光。
- 变更日ë滤波器可视化的各种荧光染料（例如DAPI和为488纳米的激发波长下）。拍照与摄像头。
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Representative Results
使用免疫荧光共聚焦miscroscope肝的Huh-7细胞系的内化外生有管理的体hLF的能力进行监测。的hLF加入到培养液中并内化被允许进行24小时，在这之后，细胞外的hLF用PBS洗涤和结合体hLF残留膜降解，5分钟胰蛋白酶处理（1ml）中。将细胞再接种，并使其重新附着的免疫荧光染色前18小时。为了概括的胞质限制，将细胞的膜进行染色的488纳米缀合物的激发波长的麦胚凝集素（WGA）的荧光染料。所述的hLF染色使用抗体hLF第一抗体并用633 nm波长连接到二抗荧光染料来实现的。为了确定体hLF的精确定位，将细胞进行成像以下顺序0.5微米的水平横截面通过共聚焦显微镜。 图4表示一个选择对应于中间单元厚度的iCal横截面。在加入外源性的hLF，被肝细胞的细胞质内检测出的显著量的hLF。没有铁蛋白是使用相同的工具设置时，未经处理的细胞中观察到。总之，这些数据证实，肝细胞必须从它们的胞外环境取得的hLF的能力。
使用荧光显微镜铁蛋白抑制丙型肝炎病毒在细胞内的复制是明年的能力监控。 Huh-7细胞的HCV支承亚基因组复制（表达HCV NS3，NS4A，NS4B，NS5A NS5B蛋白）的复制具有3微米的hLF共治疗0,2或24小时。双免疫荧光染色铁蛋白和HCV NS5A的蛋白质是由荧光显微镜进行分析。这些结果表明，HCV亚基因组复制染色（如由丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的免疫荧光测定）减少与铁蛋白处理的细胞中。 图5 仲>揭示的HCV染色强度质减少大约50％的hLF治疗24小时后。这是一个有趣的观察，因为这亚基因组复制系统缺少的HCV E1和E2包膜糖蛋白，这是体hLF的普遍接受的药理学靶点。伴随的HCV染色的褪色，铁蛋白积累开始2小时后进行检测，并强的hLF积累24小时后观察到。
图1原理落射荧光显微镜。在这种类型的显微镜，激发滤光片选择特定波长激发样品（皮膜组织或细胞携带荧光标记的抗体）。此外，发射滤波器被选择为匹配用于标记样品中的荧光团的光谱发射特性。加载/ 53053 / 53053fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.原理共聚焦显微镜的。这种类型的显微镜使用的发射针孔来消除失焦光信号。由于只有通过荧光非常接近焦平面产生的光可以被检测，图像的光学分辨率比落射荧光显微镜的要好得多。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.原理的直接和间接免疫荧光。直接免疫荧光涉及只有一种类型的抗体的标记荧光染料是特定于感兴趣（一级抗体）的分子。与此相反，间接免疫荧光涉及标记的荧光染料是特定的未标记第一抗体的物种的二抗。不止一个二级抗体可以连接到每个主抗体，增加了荧光信号。 请点击此处查看该图的放大版本。
外源性的hLF。Huh-7细胞的图4.肝癌摄取与0微米或3μM的hLF共治疗24小时，洗涤两次，提交到5分钟胰蛋 白酶处理，允许重新附着18小时，并进行免疫荧光。细胞核染色瓦特第i个DAPI（蓝色通道），血浆膜标记的WGA（绿色通道）和体hLF染色用抗体hLF抗体（红色通道）。在60倍的放大倍率原被收购共聚焦显微镜图像。的水平光学截面表示中间厚度的细胞。比例尺，10微米。从（11）修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.体hLF治疗降低HCV染色。Huh-7细胞的HCV支承亚基因组复制的复制用3微米的hLF共治疗0,2，或24小时，并进行免疫荧光。细胞核用DAPI染色（蓝色通道），丙型肝炎病毒揭示通过抗NS5A抗体（红色信道）和体hLF染色用抗体hLF一个ntibody（绿色通道）。在60倍的放大倍率原被收购通过荧光显微镜图像。比例尺，10微米。从（11）修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
丙型肝炎病毒的流行仍然是一个全球性的威胁，有80％的新感染者发展为慢性感染的，这使他们肝硬化，肝衰竭或肝癌的危险。直接作用的靶向HCV复制和成熟抗病毒剂代表素抗HCV药物，如最近由两个NS3 N-末端蛋白酶抑制剂（用boceprevir和替拉瑞韦）的监管机构批准证明。所述的hLF抗HCV活性的目前认为表现为病毒进入抑制剂，结合循环病毒粒子和阻止它们进入到他们的肝细胞靶。我们对铁蛋白的研究提出了一个行动新颖的细胞内抗HCV机制（从细胞外病毒中和不同）7。
免疫可以有效地用于可视化靶分子的分布和/或定位在生物样品中。由于发现在许多其他的荧光技术，主要职业之一与免疫相关的blems被漂白（光化学荧光染料的破坏）8。这种活性损失造成的漂白可以通过使用更健壮的荧光染料是不易于漂白或降低强度或时间范围的光曝光来规避。此外，由于抗体不能穿过细胞膜，免疫荧光一般只限于固定的细胞。替代方法来监测活细胞中蛋白质的分布/本地化因此一般依靠含有荧光蛋白结构域的蛋白的表达，如绿色荧光蛋白（GFP）9。然而，加入这类的GFP的表位的有时与在蛋白的定位和活性的修改相关联。免疫荧光也可以在许多不同的样本，包括组织切片，培养的细胞系，或单个细胞用它也经常用于监控蛋白质，多糖和小分子的本地化/分布。该技术的主要优点驻留在它的简单的事实，它可以被组合使用，荧光染色（例如，DNA染色）的其它的，非抗体的方法。此外，商业化生产的二级抗体是相对便宜和可以在一个颜色繁多。
在目前的研究中，肝细胞支持的HCV亚基因组复制的免疫荧光揭示处理后定性的降低与HCV染色强度用的hLF。这是一个有趣的观察，因为这亚基因组复制系统缺少的HCV E1和E2包膜糖蛋白，这是体hLF的普遍接受的药理学靶点。不像细胞外病毒颗粒中和活性，的hLF将需要由丙型肝炎病毒感染的肝细胞，以削弱病毒复制内在化。使用fuorescence显微镜允许我们evalu吃了这种可能性。在对HCV感染的肝细胞预孵育，外源性的hLF成功内在化，并显示出削弱的细胞内的病毒复制。这种新颖的铁蛋白的抗病毒活性的理解是向前迈出了一步，抑制这种先天免疫蛋白的全球（可能多效）机制的理解。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
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- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
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